Protokoll, Morphologie - Blutuntersuchungen mit menschlichem Blut

Anne Kühnle 1 28.6.00

Protokoll, Morphologie

Thema: Blutuntersuchungen mit menschlichem Blut

Einleitung:

Bei Blut handelt es sich um eine im einem geschlossenem Kreislaufsystem zirkulierende Körperflüssigkeit der Vertebraten. Seine wichtigste Funktion ist der Transport verschiedenartigster Stoffe vom Ort ihrer Bildung zu den Stellen, wo sie benötigt oder abgebaut werden oder aber zu den Organen, die für ihre Ausscheidung sorgen.

Außerdem übernimmt das Blut noch andere Funktionen, wie das Erhalten der Homöostase bei, das Aufrechterhalten konstanter Bedingungen im Körper. Es ist dient dem Wärme- und Hormontransport.

Das Blut des Menschen setzt sich aus dem sogenannten Plasma und den zellulären Bestandteilen zusammen. Das Plasma (55%) besteht wiederum aus dem Serum und dem Fibrinogen, ein Protein, was bei der Blutgerinnung eine Rolle spielt. Die zellulären Bestandteile (45%) sind die Erythrocyten (99,2%), die Thrombocyten (0,5%) und die Leukocyten (0,3%).

Die Blutzirkulation wird in der Regel durch das Herz aufrechterhalten.

Beim Blut kann man zwischen verschiedenen Blutgruppen unterscheiden, die sich aufgrund der unterschiedlichen Oberfläche der Blutkörperchen (die Antigene) beziehungsweise der Inhaltsstoffe des Serums (die Antikörper) ergeben. So unterscheidet man das Blut unter anderem in A, B, AB und 0. So besitzt das Blut der Blutgruppe A das Antigene A und die Antikörper B, während Blut der Gruppe B nur Antikörper A und das Antigen B trägt. Die Blutgruppe AB besitzt keinerlei Antikörper, aber dafür die Antigene A und B. Blutgruppe 0 hat beide Antikörper aber keine Antigene. Vermischen sich zwei unterschiedliche Blutgruppen mit einander, agglutiniert das Blut., indem die Antikörper sich mit dem gleichnamigen Antigen verbinden und dann große Komplexe bilden, die die feinen Kapillare verstopfen würden. Diese Reaktion wird zur Blutgruppenbestimmung verwendet, indem man bekannte Antikörper zur Blutprobe gibt und auf die Agglutination hin untersucht.

Material:

Filterpapier um Arbeitsplatz abzudecken

Handschuhe

drei Pasteurpipetten

Ethanol, w = 70%

Autoklav

Für Bestimmung der Blutgruppen:

3 Objektträger

Testseren (Anti A, Anti B, Anti AB)

9 Plastikstäbchen

3 unterschiedliche Blutproben (687-1, 678-3, 667-9)

Für Bestimmung des Rhesusfaktors:

Objektträger

Testserum (Anti D, Rhesocit) 0,9 %ige NaCl-Lösung

4 Pasteurpipetten

3 Plastikstäbchen

3 unterschiedliche Blutproben (678-3, 667-9, 687-1)

bio-o-blutuntersuch.doc

Anne Kühnle 2 28.6.00

große Petrieschale

Filterpapier, Æ wie Petrieschale Brutschrank

Hämoglobin-Bestimmung im Photometer:

Reagenzglas

Dispensierflasche

20ml Eppendorfpipette

Filterphotometer "Hitachi"

2 Glasküvetten, 1cm Dicke

Transformationslösung

Eichkurve, HB-Bezugskurve

aqua dem.

Blutprobe (682-2)

Für Untersuchung von Leukocyten

2 Objektträger

Pasteurpipette

May-Grünwald-Lösung

Giemsa-Gebrauchslösung, 1/20 verdünnt aqua dem.

Blutprobe (808-1) Färbewanne

Färbebank Mikroskop

Für Verhalten von Erythrocyten in Lösungen:

Objektträger

Deckgläschen

3 Plastikstäbchen Pasteurpipette Blutprobe (667-9)

NaCl-Lösung, w = 6 % und w = 0,9 % aqua dem.

Mikroskop

Durchführung:

Vor Beginn der eigentlichen Versuche wird der Platz mit dem Filterpapier abgedeckt. Außerdem muß während der Versuche Handschuhe getragen werden, damit eventuelle Krankheitserreger im Blut nicht in Kontakt mit den Händen beziehungsweise in kleine Wunden gelangen können.

Bestimmung der Blutgruppen:

Zuerst werden die Objektträger (OT) mit Scheuermilch gereinigt und getrocknet. Ebenso müssen die Plastikstäbchen sauber sein. Nun wird auf je einem OT ein Tropfen der Testseren Anti A, Anti B und Anti AB gegeben. Mit den sauberen Pasteurpipetten wird auf jedem OT je ein Tropfen einer Blutprobe neben die Testseren gegeben, dabei wird pro Probe eine Pipette verwendet. Dies soll verhindern, dass sich das Blut in der Pipette vermischt und das Ergebnis verfälscht. Mit den Plastikstäbchen werden die Bluttropfen mit den Testseren vermischt. Dafür wird für jeden Tropfen ein sauberes Stäbchen verwendet.

Nach circa 15 s werden die Proben auf Agglutination untersucht, indem man die OTs leicht kippt. Dies erleichtert die Beobachtung. Das Ergebnis wird in einer Tabelle notiert.

Bestimmung des Rhesusfaktors:

Auf einem gereinigtem OT (siehe oben) werden drei Tropfen des Testserums Anti D gegeben, so dass sie sich nicht mit einander vermischen können. Dazu wird je ein Blutstropfen einer unterschiedlichen Probe und ein Tropfen 0,9%ige NaCl-Lösung mit je einer sauberen Pasteurpipette gegeben. Die Tropfen sollten möglichst klein sein, damit sie sich nicht bei verrühren mit dem Plastikstäbchen vermischen können. Bevor man die Tropfen auf den OT gibt, wird er beschriftet, damit man die Blutproben später noch zuordnen kann. Der so vorbereitete OT wird in die mit befeuchteten Filterpapier ausgelegte große Petrieschale gelegt und mit dem Deckel verschlossen. Dadurch wird eine feuchte Kammer erreicht, die hier erwünscht ist.

Die geschlossene Petrieschale wird in den Brutschrank bei 37°C für 45 min gestellt und läßt das Blut inkubieren.

Nach dieser Zeit werden die Proben durch leichtes Kreisen des OTs auf Agglutination geprüft. Das Ergebnis wird in einer Tabelle notiert.

Hämoglobin-Bestimmung im Filterphotometer:

In ein Reagenzglas wird mit der Dispensierflasche 5ml Transformationslösung gefüllt. Dazu wird mit der Eppendorfpipette 20ml Blut gegeben. Durch leichtes Schwenken wird das Blut mit der Lösung vermischt, ohne das die Lösung zu sehr schäumt. Dies könnte die spektroskopische Messung verfälschen. Mit einem Teil der Lösung wird die Glasküvette vorgespült, während das Filterphotometer circa 15 min einbrennt. Für die Messung wird die zweite Küvette mit aqua dem. gefüllt. Es dient als Nullwert. Anschließend wird das Maximum kalibriert. Nun wird die Extinktion der Lösung bei 520nm vermessen. Des Messwert notiert und mittels der Eichkurve wird der Hämoglobin-Gehalt in g pro 100ml Blut abgelesen.

Untersuchung von Leukocyten:

Mit einer Pasteurpipette wird ein Blutstropfen am Rand auf den OT gegeben. Mit einem zweiten OT wird der Tropfen dünn ausgestrichen, indem man den OT schräg an den Tropfen hält und über den OT zieht. Der Ausstrich wird an der Luft getrocknet.

Für die Färbung wird der OT auf die Färbebank in der Wanne gelegt und mit der May-Grünwald- Lösung betropft. Dies läßt man für 3min stehen. Nun gießt man die Lösung in die Wanne ab und versetzt den OT mit ungefähr der gleichen Menge aqua dem., das man ebenfalls nach circa 1 bis 1,5 min abkippt. Zum Schluss tropft man die Giemsa-Gebrauchslösung auf den OT und läßt dies 30 min einwirken. Dann wurde die Lösung mit Leitungswasser vorsichtig abgespült und getrocknet, ohne dass der gefärbte Ausstrich aus Versehen entfernt wird.

Der Ausstrich wird nun ohne Deckglas unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung betrachtet und die unterschiedlichen Leukocyten gezeichnet und zugeordnet.

Verhalten der Erythrocyten in Lösungen:

Auf einem sauberen OT werden drei Blutstropfen einer Probe neben einander mit einer Pasteurpipette aufgetragen. Nun wird der erste Tropfen mit einem Tropfen 0,9%iger NaCl-Lösung versetzt, der zweite mit 6%iger NaCl-Lösung und der dritte mit einem Tropfen aqua dem. Mit Plastikstäbchen werden die drei Blutlösungen gut vermischt und mit einem Deckglas versehen. Man muss hier sorgfältig arbeiten, damit sich die Tropfen nicht unter einander vermischen. Sonst wäre eine eindeutige Aussage nicht möglich.

Nun wird der OT unter dem Mikroskop betrachtet und die Erythrocyten der unterschiedlichen Lösungen gezeichnet. Außerdem werden die Beobachtungen notiert, die sich mit der Zeit ergeben. Zum Schluss der Versuche werden die benutzten Glasgeräte im Autoklaven sterilisiert und die Arbeitsplätze mit 70%igem Ethanol abgewischt.

Resultate:

Bestimmung der Blutgruppen:

Nach Vermischen der Seren konnte man die Agglutination anhand der auftretenden granulären Struktur des Blutes erkennen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Bestimmung des Rhesusfaktors:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hämoglobin-Bestimmung:

Bei der photometrischen Bestimmung des Hämoglobin-Gehaltes wurde die Extinktion mit 0,152 bestimmt.

Untersuchung von Leukocyten:

Nach der Färbung konnte man unter dem Mikroskop deutlich zwischen den Leukocyten und den sehr viel kleineren Erythrocyten unterscheiden. Durch die Färbung waren die rundlichen bis ovalen Erythrocyten hellrosa gefärbt, während die Leukocyten durch einen dunkelvioletten Kern in einer ebenfalls hellrosa Zelle auffielen. Der Kern variierte in der Größen und Form. So füllte er bei einigen Zellen fast den ganzen Raum aus und war eher rund, während er bei anderen Leukocyten relativ klein war und eher ein halbmondförmiges Aussehen hatte. Andere Strukturen waren bei diesem Ausstrich und Vergrößerung nicht zu erkennen.

Verhalten der Erythrocyten in Lösungen:

Bei Vergleich der Erythrocyten unter dem Mikroskop in den unterschiedlich konzentrierten Lösungen konnte man mit der Zeit deutliche Unterschiede in der Form und Größe erkennen. Dabei bezieht man sich auf die Erythrocyten in der 0,9%igen NaCl-Lösung, da dies das isotonische Medium für die Erythrocyten darstellt.

In der physiologischen Kochsalzlösung lagen die Erythrocyten recht eng bei einander und hatten eine rundliche bis ovale Form, die teilweise etwas eingedellt war. Hier konnte während der Beobachtung keine Veränderung erkannt werden.

Die Erythrocyten im aqua dem. nahmen mit der Zeit an Größe zu und wurden kugelrund. Sie lagen nicht mehr so dicht beisammen wie die Erythrocyten in der physiologischen Kochsalzlösung und ihre Zahl schien auch geringer zu sein.

In der 6%igen Lösung waren die Erythrocyten dagegen sehr viel kleiner geworden und hatten auch einen gezähnten Umfang. Allerdings konnte man dies nicht bei allen Erythrocyten erkennen, aber die Anzahl der gezähnten Form nahm während der Beobachtung leicht zu. Aufgrund ihrer Größe waren auch sehr viel mehr Erythrocyten im Blickfeld zu sehen.

Diskussion:

Bestimmung der Blutgruppen:

Aufgrund der Agglutination des Blutes bei Zugabe des Serums, also der Reaktion von Antigenen auf der Zellmembran der Erythrocyten mit den entsprechenden Antikörpern im Serum, kann man auf die Blutgruppe der Blutprobe schließen. So weist die Agglutination bei der Probe 667-9 mit dem Serum Anti B auf die Blutgruppe B hin, da sich in der Probe die entsprechenden Antigene befinden. Die geringere Agglutination beim Serum Anti AB zeigt, dass nur ein Teil der Antikörper des Serum mit den Antikörper agglutiniert. Nämlich nur die Antikörper B.

Nach dem gleichem Prinzip kann man die Blutgruppen der zwei anderen Proben bestimmen. Blutprobe: 678-3 ⇒ 0

667-9 ⇒ B

687-1 ⇒ A

Bestimmung des Rhesusfaktors:

Hier weist ebenso wie bei der Bestimmung der Blutgruppe eine Agglutination auf den Rhesusfaktor hin. Es wird die Agglutination mit dem Antikörper D im Serum mit den Antigenen im Blut hervorgerufen, wenn das Blut rhesuspositiv (rh+) ist. Beim rh- Menschen fehlt das Antigen. Da aber im Normalfall bei beiden keine Antigene vorhanden sind, müssen sie erst gebildet werden. Deswegen müssen die Blut proben auch erst in der feuchten Kammer inkubieren, damit eine Agglutination ermöglicht werden kann. Da bei allen drei Blutproben eine Agglutination beobachtet wurde, also alle das Rh-Antigen gebildet haben, sind alle Proben rh+ einzustufen.

Hämoglobin-Bestimmung:

Mittels der Eichgerade ist es möglich den Hämöglobin-Gehalt im Blut durch eine photometrische Messung zu ermitteln. Denn die Eichgerade stellt eine Beziehung zwischen der Extinktion und des Hämoglobin-Gehaltes her.

Die Extinktion wurde mit 0,152 bestimmt. Aus dem Graphen erhalte ich dann für den Hämoglobinwert die Konzentration von 7,7g pro 100ml Blut.

Das in den Erythrocyten befindliche Hämoglobin dient dem Sauerstofftransport, indem die O2- Beladung des Transportprotein über das Metallkation (Fe+) erfolgt. Der Sauerstoff wird dabei in den Aveolen der Lunge gebunden und im Gewebe wieder freigesetzt.

Die Erythrocyten werden im rotem Knochenmark gebildet. Wenn die Erythrocyten zerfallen, werden sie zum größtem Teil in der Leber und Milz abgebaut.

Untersuchung von Leukocyten:

Die ohne besonderen Strukturen kleineren Blutbestandteile sind die Erythrocyten. Sie besitzen keinen Zellkern, sondern sind mit Hämoglobin gefüllte "Säckchen".

Die Leukocyten lassen sich in mehrere Typen unterscheiden. Dies wird durch die unterschiedliche Form des Zellkerns ermöglicht. Die hier beobachteten Zellen sind die Lymphocyten mit rundem Zellkern und die Monocyten mit dem halbmondförmigen Kern gewesen. Die Lymphocyten werden im Knochenmark und in lymphatischen Organen wie Thymus, Milz und Lymphknoten gebildet. Sie sind für die Immunität verantwortlich, indem sie Antikörper bilden. Auch die Monocyten sind Zellen des Immunsystems. Sie sind die größten Leukocyten und betreiben Phagocytose von Antigenen, die sie dann an ihrer Oberfläche den Lymphocyten zur Erkennung präsentieren. Die Monocyten werden im Knochenmark gebildet.

Weitere Leukocyten sind unter anderem der Granulocyt, der basophiler Leukocyt und der eosinophiler Leukocyt. Sie sind vor allem für die unspezifische Immunabwehr verantwortlich, indem sie durch Endocytose Erreger unschädlich machen.

Verhalten von Erythrocyten in Lösungen:

Da die 0,9%ige NaCl-Lösung der Salzkonzentration im Körper entspricht, Kann man hier keine Veränderung der Erythrocyten bezüglich ihres Aussehen und Umfanges machen. Bei einem hypotonischem Medium dagegen, wo die Konzentration des Mediums niedriger ist als die der Zelle (hier aqua dem.), nimmt die Zelle passiv aufgrund der Osmose Wasser auf. Sie schwillt also an und platzt letztendlich, wenn der hydrosstatische Druck des Wassers in der Zelle stärker ist als die Cytoplasmamembran. Dies könnte auch die geringere Anzahl der beobachteten Erythrocyten unter dem Mikroskop erklären. Allerdings kann dies auch an einer geringeren Blutkonzentration liegen. Bei einem hypertonischem Medium dagegen ist der Sachverhalt genau umgekehrt. Die 6%ige Salzlösung ist deutlich konzentrierter als die physiologische Lösung. Dem Erythrocyt wird Wasser entzogen, so dass er sich verkleinert und die Cytoplasmamembran sich zusammenzieht. Er nimmt die sogenannte "Stechapfelform" an. Dieser Vorgang wird als Plasmolyse bezeichnet. Das dieser Prozeß passiv verläuft und von dem Erythrocyt nicht gesteuert werden kann, wird dadurch deutlich, dass er zum Tod der Zelle führt.