Gentechnologie

André Gärtner

Gentechnologie

1. Was istGentechnologie?
2. In welche drei grundsätzlichen Kategorien lässt sich der mögliche Nutzenklonierter DNA einteilen?
3. Welches sind die beiden wichtigsten Arten von Enzymen in der Gentechnologie und welche Aufgaben haben sie?
4. Was versteht man unter einemKlonierungsvektor(Vehikel) und wie wird mit ihrer Hilfe rekombinante DNAhergestellt?
5. Welche Organismen können sog.Wirtsorganismensein, und wozu dienen sie?
6. Beschreibe die einzelnen Schritte näher, wie man mit Bakterien und Plasmiden Gene kloniert.
7. Was ist eine Restriktionsschnittstelle
8. Was sindGenomische-Bibliotheken?
9. Was sindIntronsundExons?
10. Was istkomplementäre DNA (c DNA)und wozu wird sie genetisch benutzt?
11. Mithilfe welcher Methoden lässt sich die DNA in die Wirtszelle einschleusen?
12. Wozu werdenGensonden benutzt?
13. Wie können klonierte Gene exprimiert werden? zu 1:

Die Gentechnologie ist ein Verfahren zur gezielten Veränderung vererbter Eigenschaften eines Organismus durch Eingriff in dessen genetisches Material (Erbmaterial). Diese Methode wird häufig bei Mikroorganismen wie Bakterien oder Viren angewendet, um sie zur vermehrten Bildung bestimmter Stoffe oder zur Bildung völlig neuer Substanzen anzuregen oder sie unterschiedlichen Milieus anzupassen.

Ein weiteres Gebiet der Gentechnik oder DNA-Rekombinationstechnik ist die medizinische Gentherapie. Dabei werden bei genetischen Störungen oder Erkrankungen wie AIDS oder Krebs Gene in bestimmte Körperzellen eingeschleust.

Es werden diejenigen Gene eingeschleust die der Zelle fehlen, mit dem Ziel, erworbene oder vererbte Krankheiten zu heilen.

Die Gentherapie lässt sich weiterhin in zwei Kategorien unterteilen.

In der Ersten werden Veränderungen an der Keimzelle (Ei- oder Samenzelle) vorgenommen, die eine bleibende genetische Veränderung des gesamten Organismus kommender Generationen zur Folge hat.

Die zweite Kategorie der Gentherapie ist die Körperzellentherapie. Sie lässt sich mit einer Organtransplantation vergleichen. Dabei werden Gewebszellen direkt behandelt oder zunächst entnommen. In diese Gewebszellen werden im Labor therapeutische Gene eingeschleust, dann werden die Zellen dem Patienten wieder implantiert.

Durch die Gentechnologie ist es auch möglich Gene über die Artengrenze hinweg ,,auszutauschen". zu 2:

Die möglichen Nutzen klonierter DNA lassen sich in drei Kategorien einteilen. Diese Bestimmung erfolgt der DNA nach der Klonierung.

Die erste Kategorie beschreibt klonierte DNA, die das Ziel hat ein Protein zu synthetisieren welche von der ursprünglichen DNA nicht oder nicht ausreichend hergestellt wurde. Ein möglicher Einsatz ist z.B. die DNA insoweit zu verändern, dass sie in Zukunft die Synthese des Wachstumshormons ausführt, wie es bei Patienten die an Zwergwuchs leiden nicht der Fall ist.

Die zweite Kategorie beschreibt das Ziel, Zellen mit einer bestimmten Stoffwechseleigenschaft zu versehen die sie vorher nicht gehabt haben. Dieses wird z.B. in der Agrarwirtschaft verwand um bestimmtes Getreide gegen einen Schädling resistent zu machen.

Die dritte Kategorie beschränkt sich auf die Duplikation des klonierten Genes, bzw. der klonierten DNA. Das Gen wird somit häufig dupliziert, um möglichst viele dieser veränderte Erbinformationen zu erhalten, um diese weiter untersuchen zu können.

Dies ist notwendig, da in einem kompletten DNA-Satz ein Gen meistens nur einmal vorkommt aber Millionen anderer, in diesem Falle ,,unerwünschte Gene" vorkommen. Um nun speziell nur das veränderte Gen zu untersuchen, wird dieses dupliziert.

zu 3:

Zu den wichtigsten Enzymen in der Gentechnologie zählen zwei Gruppen.

Die erste Gruppe besteht aus den sogenannten Restriktionsenzymen (Restriktionsendonucleasen). In der Natur kommen diese Restriktionsendonucleasen in Bakterien vor und schützen diese vor dem Eindringen fremder DNA. Diese Restriktionsenzyme zerschneiden die fremde DNA in einem Vorgang, dieser wird weitläufig als Restriktion bezeichnet. Die meisten Restriktionsenzyme haben eine hohe Substratspezifität, d.h. die Restriktionsenzyme können nur an einer ganz bestimmten Stelle die DNA zerschneiden.

Restriktionsenzyme erkennen bestimmte Nucleotidsequenzen auf der DNA und zerschneiden diese an der erkannten Stelle der DNA. Die Bakterienzelle schützt sich vor dem Trennen ihrer DNA mit ihren eigenen Restriktionsenzyme durch Anheftung von Methylgruppen (-CH3). Bis heute wurden hunderte solcher Restriktionsenzyme entdeckt und isoliert.

Die zweite Gruppe besteht aus den sogenannten DNA-Ligasen. Diese DNA-Ligasen bewirken eine ,,Umkehrung" des Prozesses der Restriktionsenzyme. Diese Ligasen verknüpfen die verschiedenen DNA-Stränge miteinander. Dieses geschieht, indem sie die Phosphodiester- Bindungen herstellt.

zu 4:

Klonierungsvektoren sind in erster Linie ein Hilfsmittel um eine veränderte DNA-Sequenz wieder in einen geeigneten Wirt zu transportieren.

Die zwei gebräuchlichsten Vehikel (Klonierungsvektoren) sind bakterielle Plasmide und Viren.

Plasmide sind extrachromosomale Elemente die in Bakterien vorkommen. Dieses ringförmig angeordnete, doppeltsträngige DNA-Molekül ist autonom und bietet meistens einen Selektionsvorteil.

Man entnimmt nun einem unverändertem Bakterium das Plasmid und verändert an diesem die DNA-Struktur in gewünschter Weise, dies geschieht durch den Einbau von Restriktionsfragmenten einer Fremd-DNA. Dieses rekombinante Plasmid enthält nun die rekombinante DNA.

Das Plasmid wird nun wieder in die Zelle zurück transferiert, die Bakterienzelle bemerkt die Veränderung des Plasmides nicht und kloniert mit jeder Mitose die rekombinante DNA.

Ein weiterer Klonierungsvektor sind Viren (Bakteriophagen). Der Einsatz von Viren ist doch sehr gering, da der Wirt (Zelle) einen entsprechenden Rezeptor für die Bakteriophage besitzen muß, damit diese in die Zelle eindringen kann.

In dem Fall, daß Phagen als Klonierungsvektoren eingesetzt werden, muß durch Hilfe von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen Fremd-DNA in das Phagengenom eingebaut werden.

Über einen normalen Infektionsprozess wird nun die Phage mit der enthaltenen rekombinanten Phagen-DNA in den Wirt eingeschleust.

zu 5:

Gebräuchliche Wirte in der Gentechnologie sind Bakterienzellen. Diese eignen sich aufgrund der unkomplizierten Isolation ihrer DNA und der einfachen Rückführung der DNA besonders gut zum Einsatz in der Gentechnik. Ein weiterer Vorteil von Bakterien liegt in der raschen Vermehrung und somit in der schnellen Duplizierung von der veränderten DNA.

Weiterhin eigenen sich als Wirtszellen auch Hefezellen. Die Besonderheit an diesen Zellen ist die Zugehörigkeit zur eukaryotischen Zelle, sie besitzt aber trotzdem Plasmide, wie es für prokaryotische Zellen typisch ist.

Es treten aber Schwierigkeiten bei der Übertragung von eukaryotischen Genen in eine prokaryotische Bakterienzelle auf, die unter Punkt 9 näher beschrieben werden.

Die größte Limitierung bei der Auswahl der Wirtszelle besteht darin, daß die Zelle die Aufnahme der Fremd-DNA verweigert.

zu 6:

Um ein Bakterium zu klonieren, muß man zunächst aus diesem das Plasmid extrahieren. Genauso muß man eine DNA aus einem anderen Organismus extrahiert vorliegen haben, in der das Gen enthalten ist welches nach dem Prozess in dem Bakterium aktiv seien soll. Unter Zuhilfenahme von einem Restriktionsenzym werden nun an ganz bestimmten Stellen des Plasmid und in der DNA mit dem enthaltenem Gen, die DNA getrennt.

Der Unterschied in der Wirkungsweise des Restriktionsenzym ist, an dem Plasmid aus dem Bakterium, besteht darin, dass an einer ganz bestimmten Stelle das Plasmid getrennt wird, an der sogenannten Restriktions-Schnittstelle. Bei der anderen vorliegenden DNA trennt das Restriktionsenzym diese DNA an vielen Stellen. Es entstehen also viele Fragmente der DNA mit dem enthaltenem Gen aber nur ein Fragment des Plasmides.

Diese Fragmente besitzen ,,klebrige Enden", diese klebrigen Enden werden so bezeichnet, da es mit ihnen möglich ist, eine Verbindung mit einem anderen DNA-Fragment einzugehen.

Diese Fragmente bestehen aus einem doppelten DNA-Strang der durch Spaltung eines Restriktionsenzyms an den Enden nur einen einfachen DNA-Satz hat. Dieser einfache DNA- Satz wird als klebriges Ende bezeichnet.

Nun kommt es zur Verbindung des Plasmides und einem Fragment der aufgespalteten DNA. Die klebrigen Enden des Plasmides gehen mit den komplementären klebrigen Enden der DNA-Fragmente Verbindungen ein.

Nun setzt die DNA-Ligase ein und verbindet die neu zusammengesetzten Fragmente ,,dauerhaft".

Man hat nun ein rekombinantes Plasmid erzeugt, daß jetzt unter Beihilfe von Klonierungsvektoren (siehe Punkt 4) in das ursprüngliche Bakterium zurück transferiert werden kann.

Dieser oben beschriebene Prozess ist nicht direkt kontrollierbar. Bei der Spaltung entstehen unzählige Fragmente und Plasmide. Das richtige Plasmid mit der gewünschten ,,neuen" Eigenschaft muß durch Hilfe von verschiedenen Test identifiziert werden. Nur so lässt sich mit Gewissheit der gewünschte Erfolg manifestieren.

zu 7:

Unter einer Restriktions-Schnittstelle versteht man diejenige Stelle, an der ein Restriktionsenzym die DNA aufspaltet. Ein bestimmtes Restriktionsenzym wird immer an der gleichen Stelle, an der gleichen Nucleotidsequenz, die DNA aufspalten.

zu 8:

In den Labors liegen genomische Bibliotheken vor, die in Plasmid Bibliotheken und Phagen Bibliotheken eingeteilt werden.

Diese Bibliotheken, ob Plasmid oder Phagen, enthalten nun alle erdenklichen DNA- Veränderungen in ihren Organismen. Wissenschaftler stellen diese Bibliotheken her um bei Bedarf auf einen Organismus mit veränderter, rekombinanter DNA, zurückgreifen zu können. Da es nicht möglich ist ein Genom gezielt zu verändern, bezeichnet man die Herstellung von Bibliotheken auch als ,,Schrotschuss-Methode".

zu 9 + 10:

Die unter Punkt 5 angesprochene Problematik, bei der Rückführung von DNA-Fragmenten eukaryotischer Herkunft in einen prokaryotischen Wirt, besteht hauptsächlich im unterschiedlichen Aufbau der jeweiligen DNA.

Die eukaryotische DNA enthält Introns und Exons, die prokaryotische DNA entgegen enthält nur Exons.

Als Intron bezeichnet man diejenigen Basenpaare auf der DNA, die vorhanden sind aber nicht den Code für ein Gen darstellen, diese Introns sind ,,Platzhalter" in der eukaryotischen DNA und kommen auch nur in dieser vor.

Als Exon bezeichnet man die Basenpaare die eine genetische Information tragen, diese Exons kommen in prokaryotischen sowie in eukaryotischen Zellen vor.

Durch diese unterschiedliche Struktur der jeweiligen DNA und der unterschiedlichen Transkriptions- und Translationseinheiten der verschiedenen Zellen, ist es erforderlich die DNA auf eine gleiche Struktur zu bringen. Bakterienzellen sind nicht in der Lage Introns zu interpretieren.

Um diesem Problem auszuweichen, stellen Forscher künstliche Gene her, die sich von der Wirkungsweise nicht unterscheiden, aber keine Introns besitzen.

In der eukaryotischen Zelle wird durch die Transkription eine RNA synthetisiert. Diese RNA enthält, aufgrund eukaryotischen Ursprungs Introns und Exons.

Unter Mithilfe von Spleißosomen werden in dieser RNA die Introns entfernt und anschließend die restlichen Exons zusammengefügt. Diesen Vorgang des Zusammenfügens nennt man ,,verspleißen".

Man isoliert nun die modifizierte RNA aus der Zelle und unter Mithilfe von reverser Transkriptase katalysiert man einen DNA-Strang. Wenn dieser DNA-Strang synthetisiert ist, wird der RNA-Strang abgebaut und eine DNA-Polymerase synthetisiert am vorhandenen Strang als Kopie einen komplementären DNA-Strang.

Das Resultat ist ein völlig neuer DNA-Strang der das gewünschte Gen enthält aber die unerwünschten Introns nicht beinhaltet. Die DNA, die das neu Gen trägt wird nun als komplementäre DNA oder als cDNA bezeichnet.

Die durch Introns und Exons beschränkte Übertragung ist damit gelöst. zu 11:

Die Einschleusung von klonierter DNA hängt von den möglichen Vektoren und von der Wirtszelle ab.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten die DNA in die Zelle zu transferieren. Die Gebräuchlichste ist die Absorption der DNA aus der Umgebung.

Eine weitere Möglichkeit stellen Phagen dar, die die rekombinante DNA in einer Proteinhülle verpackten, die dann die Wirtszelle infizierten.

Unter bestimmten Voraussetzungen können Hefen auch lineare DNA-Stücke aufnehmen und dann sofort einbauen.

Zu den aggressiveren Techniken die DNA in den Wirt zu bringen, zählt die Elektroporation, die durch einen elektrischen Impuls Löcher in die Plasmamembran ,,reißt", durch die die DNA übergeht. Diese Löcher schließen sich in der Regel wieder. Weiterhin kann man mit einer mikroskopisch kleinen Nadel die DNA injizieren, man nennt dies die ,,Mikroinjektion". An Pflanzenzellen besteht noch die Möglichkeit die Zelle mit den DNA-Stücken zu beschießen.

In allen Fällen wird die DNA in das Genom der Wirtszelle implementiert. zu 12:

Um den Nachweis zu erbringen, dass ein bestimmtes kloniertes Gen in die Struktur der DNA aufgenommen wurde, gibt es die Möglichkeit dies mit einer Gensonde zu überprüfen. Diese Gensonde besteht aus rekombinanter DNA die unter Zuhilfenahme eines radioaktiven Isotops oder eines Floureszenzfabstoffes markiert wurde. Diese rekombinante und markierte DNA wird in die Wirts-DNA eingebracht. Mit Hilfe der Audiograhie erkennt man, ob und wo die veränderte DNA eingebaut wurde.

zu 13:

Um ein kloniertes Gen zur Expression zu veranlassen, ist es wichtig die unter Punkt 9 beschriebene Hürde zu überwinden. Von weiterer großer Bedeutung ist die Aktivierung der Transkription und der Translation in der Wirtszelle. Wenn dieses nicht geschieht, beinhalten alle nachfolgenden Zellgenerationen zwar die Basenpaare, die Zelle aber besitzt nicht die Möglichkeit die ,,Wirkung" dieses Gens zu aktivieren. Durch den Einsatz weiterer Restriktionsenzyme, die z.B. das Plasmid an einer ganz bestimmten Stelle aufspalten z.B. an einer Stelle an welcher ein ,,Startcode" ist und daran das DNA-Fragment angebracht wird, begünstigt dies die Wirkungsweise des Gens. Es veranlasst den Wirt zu einer häufigen Synthese des Genes bzw. des Proteins.

Eine weitere Möglichkeit bietet das anheften von ,,Startcodes" direkt an die rekombinante DNA, somit wird der Befehl zur Expression gleich mit implementiert.