Regeneration von Getreide aus Protoplasten

1. Regeneration von Pflanzen allgemein

1.1. Isolierung von Protoplasten

Zu Beginn der 60er wurde von Cocking eine Enzympräparation zum Abbau der Zellwand entwickelt, er isolierte damit einzelne Protoplasten aus den Wurzelspitzen der Tomate. Die Präparation setzt sich aus zwei Stufen zusammen:

1. Auflösen der Mittellamelle durch Pektinasen
2. Verdauung der Zellwand durch Cellulasen

Die Isolation in zwei Schritten wird als Sukzedantechnik bezeichnet, dabei wird das zerkleinerte Gewebe zunächst mit Pektinase behandelt, was zur Freisetzung der Einzelzellen führt. Die anschließende Behandlung mit Cellulase, wobei die Protoplasten freigesetzt werden. (Bild Heß S.70)

Die benötigten Enzyme werden von Pilzen und Bakterien geliefert. Anstelle des zwei Stufen Verfahrens, kann der Prozess auch in einem Schritt durchgeführt werden indem man ein Enzymgemisch verwendet, dies bezeichnet man als Simultantechnik. Mit Calcofluor White kann überprüft werden ob alle Zellwand verdaut wurden. (Bild) (der Farbstoff bindet an Cellulose und liefert baue Fluoreszenz bei Anregung) Um eine Deplasmolyse der Protoplasten zu vermeiden, werden sie während der Präparation in isotonischem Medium gehalten. Dieses Medium enthält in der Regel Zucker, Zuckeralkohole wie Mannitol oder Sorbitol und eine Vielzahl anorganischer Salze und einige Vitamine.

1.2. Kultur von Protoplasten

Die Kultur der Protoplasten erfolgt in komplexen Nährmedien, die nach definierten Rezepten aus ca. 20-40 verschiedenen Substanzen hergestellt werden. Darunter wären z. B. anorganische Salze, Kohlenhydrate, Vitamine, Aminosäuren, Phytohormone evtl. Hefeextrakt.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten die Protoplasten zu kultivieren:

1.2.1. Kultur in Flüssigmedium

Wird angewandt, wenn die Protoplasten beim einbetten in Agarose die dabei nötigen hohen Temperaturen nicht vertragen. Die Protoplastensuspension wird in einem Flüssigmedium kultiviert bis sich kleine Kalli bilden und diese werden in Agar ausplattiert

1.2.2. Einbetten in Agarmedium

Dafür muss die Protoplastensuspension mit dem erwärmten Agar gemischt werden. Dies geschieht bei einer Temperatur von ca. 45°C, was dazu führen kann, dass die Protoplasten schon beim Einbetten geschädigt werden. Der große Vorteil gegenüber der Kultur in Flüssigmedium ist der, dass die einzelnen Protoplasten in ihrer Lage fixiert sind und deshalb individuell in ihrer Entwicklung verfolgt weden können.

1.2.3. Einbetten in Agarose

Auch hierbei sind die Protoplasten in ihrer Lage fixiert. Agarose wird durch abspalten von Sulfatgruppen aus Agar abgeleitet, durch einfügen von Hydroxyethylgruppen wird der Schmelzpunkt gesenkt. Die Protoplasten können also bei einer Temperatur von 32°C mit der Agarose vermischt werden, wodurch eine Schädigung vermieden werden kann. Die Agarose kann nach dem ausgießen in Petrischalen in Sektionen geschnitten und in flüssige Nährmedien übertragen werden (Agarose-Sektions-Kultur = bead type cultur). Oder es werden von Anfang an nur kleine Tropfen Agarose auf den Boden der Petrischale gegeben und das Nährmedium zugesetzt, dies nennt sich dann Agarose-Scheibchen-Kultur (disc type culture). (Schema Agaroseverfahren Heß S.75)

Nach einigen Tagen Kultur bildet sich wieder eine Zellwand aus, was man durch anfärben nachweisen kann. Sobald sich die Zellwand wieder vollständig regeneriert hat beginnen die Zellen sich zu teilen. (Bild Heß S.70)

1.3. Regeneration von Pflanzen

Die aus der Protoplastenkultur gewonnenen Kalli werden anschließend zu neuen Pflanzen regeneriert, dies kann durch Organogenese oder somatische Embryogenese geschehen.

1.3.1. Organogenese

Um ein organisiertes Wachstum zu erreichen werden die Zellkalli auf Differenzierungsmedien übertragen. Spross- und Wurzelbildung wird durch verschiedene Medien induziert, d.h. zeitlich und räumlich getrennt gebildet. Entscheidend dafür sind die Mengenverhältnisse der Phytohormone im Kulturmedium. Bei relativ hoher Konzentration von Auxin und geringer Menge von Cytokininen bilden sich Adventivwurzeln, ist dagegen der Cytokiningehalt höher werden Adventivsprosse gebildet. (Bild Heß S.54) Bei der Pflanzenregeneration wird zunächst die Sproßbildung induziert und anschließend werden die Sprosse in ein anderes Medium übertragen um sie zu bewurzeln.

1.3.2. Bildung von Embryoiden (somatische Embryogenese)

Embryoide können sowohl aus Kalli als auch aus Suspensionskulturen gebildet werden, Voraussetzung ist, dass sich die Zellen dedifferenzieren und anschließend beginnen sich zu teilen. Für die Embryoidbildung muss man die Kulturbedingungen so wählen, dass bestimmte Zellen zu embryogenen Zellen determiniert werden, von denen aus dann Embryoide gebildet werden. Dafür sind hohe Auxinkonzentrationen erforderlich, wobei oft 2,4- D(ichlorphenoxyessigsäure) eingesetzt wird. Cytokinine wirken nicht entscheidend, Gibbereline hemmen sogar die Induktion von Ebryoiden.

Das Auswachsen der Embryoide erfolgt auf einem anderen Nährmedium, das wenig oder gar kein Auxin enthält. Oft wird MS-Medium (Murashige-Skoog-Medium) eingesetzt, dieses enthält Ammoniumnitrat in großen Mengen. Ammoniumionen fördern die Induktion und das Wachstum der Embryoide.

(Schema der Protoplastenregeneration Heß S.73)

2. Anwendung bei Getreide

2.1. Quellen für regenerierbare Protoplasten

2.1.1. Embryo-Zellsuspension

Bei Getreide ist die Embryo-Zellsupension die Hauptquelle, die zur Isolation von totipotenten (vollständiges Genom, fähig zur Regeneration) Protoplasten genutzt wird. Die Herstellung und Erhaltung solcher Embryokulturen ist allerdings sehr Zeitaufwendig und Arbeitsintensiv, die Embryonenisolation ist schwierig, da man ihn dabei nicht verletzen darf (noch dazu sind die regenerierten Pflanzen oft steril und Phänotypisch abnormal). (In den meisten Studien wird) die Suspension aus Kalluskulturen hergestellt, die aus unreifem Embryo- oder

Keimzellengewebe (Pollen, Antheren) gebildet werden. Der erste Schritt ist dabei die Selektion der Kalli. Es treten 2 Typen auf, Typ I ist gelblich bis weiß, kompakt und oft mit knotiger Struktur, Typ II ist relativ weich, bröckelig und lichtdurchlässig. Typ II, der unglücklicherweise häufig nur in geringer Zahl vorhanden ist, wird zur Herstellung der Suspension benötigt. Die selektierten Kalli werden mechanisch zerkleinert und in ein flüssiges Medium überführt wobei die schnell wachsenden Aggregate in der Regel in 2-7 Tagen die Zellmasse verdoppeln. Diese schnellen Wachstumsraten beeinflussen möglicherweise die Zusammensetzung und Dichte der Zellwände so, dass die spätere Isolation der Protoplasten erleichtert wird. (Schema Kalluskultur Heß S.48)

2.1.2. Primärkallus

Die direkte Isolation von Protoplasten aus Kallusgewebe ohne dazwischenliegende Suspensionsphase erfordert eine größere Menge an Kallusgewebe. Man kann reife und unreife Embryonen einsetzen aber auch unreife Blüten. Die Protoplasten werden aus 3-4 Wochen alten Kalli isoliert und in Anwesenheit von Nährzellen kultiviert.

Diese Methode wurde unter Verwendung von unreifen Embryonen bei Reis, Weizen und Gerste erfolgreich angewandt.

Die entstandenen Kalli sind in allen Experimenten als embryogen beschrieben, jedoch können sie unterschiedliches Aussehen aufweisen. Bei der Übertragung von granulär strukturierten Kalli in flüssiges Medium zerfallen diese allerdings in kleine Zellaggregate. Was praktisch wieder einer Suspension entspricht. Daher ist in frage zu stellen ob es sich hierbei tatsächlich um eine neue Quelle handelt.

2.1.3. Pollen bzw. Mikrosporenkultur

Aus Pollen hervorgebrachte Strukturen können auch geeignete Quellen zur direkten Isolation von Protoplasten sein. In Mikrosporenkultur kann es zur direkten Embryoidbildung kommen, es können also normale Kalli und Embryoide darin vorkommen, die am Anfang allerdings nicht unterschieden werden können. Es ist unklar ob die totipotenten Protoplasten aus Proembryos, bzw. Embryoiden, Kallusgewebe oder aus beiden Quellen entstehen. (Ein Problem bei dieser Quelle mag die geringe Zahl an spontaner Autoreduplikation sein, die gebildeten Pflanzen sind oft steril und die Pflanzenzellen müssen noch mit Colchicin oder ähnlichem zur Verdopplung des Chromosomensatzes gebracht werden.)

2.1.4. Scutellumgewebe unreifer Embryonen

Einige Studien zeigen, dass durch 3 tägige Vorkultur des Embryos in MS Medium

(Ionengehalt: 93,289 mM/l) (Kulturmedium) der Protoplastenertrag deutlich höher liegt als bei direkter Isolation aus frischen, intakten Embryonen. Überlebens- und Teilungsfähigkeit der Protoplasten kann durch die Vorkultur verbessert werden, wobei eine länger als drei Tage dauernde Vorkulturphase den Erfolg eher vermindert. Diese direkte Isolation aus Embryonen umgeht eine Kallusphase und somit die damit verbundenen Schwierigkeiten. Auch spielt die Größe bzw. das Alter des Scutellumgewebes eine entscheidende Rolle, ein ca. 1,4-1,6 mm großes Scutellum setzt die meisten lebensfähigen Protoplasten frei.

2.1.5. Mesophyll

Bei Dikotylen Pflanzen wurden Pflanzen aus Mesophyllprotoplasten bereits erfolgreich regeneriert. Bei Versuchen mit Mais, Gerste, Reis und Weizen konnte man zwar die Protoplasten aus Mesophyllgewebe isolieren, jedoch konnte keine anhaltende Zellteilung der Protoplasten erreicht werden. Scheinbar verlieren Blattzellen aus Monokotylen sehr schnell ihre Totipotenz. Es gibt aber eine Studie, die die Regeneration von Protoplasten aus Zellen der Blattbasis bei Reis unter Einsatz von Nährzellen dokumentiert. Die Regeneration aus Mesophyllprotoplasen wäre eigentlich ideal, da die regenerierten Pflanzen genetisch identisch wären mit der ,,Spenderpflanze"

Eine Reihe von Faktoren beeinflussen den Ertrag an Protoplasten bei Gersten wurde z.B. ermittelt, dass die Lagerung der unreifen Samen für einen Tag bei 4°C zu einer größeren Ausbeuete führte. Auch scheint es eine Rolle zu spielen welche Cellulase eingesetzt wird.

2.2. Protoplasten Kultivierung

2.2.1. Einsatz von ,,Feeder Cells"

Die Protoplastenkultur wird durch viele äußere Faktoren beeinflusst. Was zur deutlichen Verbesserung des Ertrags führt ist z.B. der Einsatz von sogenannten ,,Feeder Cells" bzw. Nährzellen, die dem Nährmedium zugesetzt werden. Sie setzten Wachstumsfördernde Stoffe frei und sorgen somit für ein anhaltendes Teilungswachstum der Protoplasten. Die Rolle der Feeder Zellen ist schwer zu definieren, bei einigen Sorten sind sie nötig um z.B. die Bildung von Zellkolonien zu fördern bei anderen jedoch hat ihr Einsatz keine besondere Wirkung. Es scheint dass einige Protoplasten in der Lage sind die benötigten Wachstumsfaktoren in den entsprechenden Mengen selbst zu sythetisieren. Bei Gerste kann man eine signifikante

Verbesserung der Ertrages durch den Einsatz von Nährzellen beobachten. Tabelle: Beispiel

Gerste (Feeder Cells...) Die Protoplasten können in direktem Kontakt mit den Nährzellen stehen, wenn die Nährzellen z.B. frei im flüssigen Medium flottieren oder es besteht kein direkter Kontakt, wenn die Närzellen beispielsweise in der Mitte der Petrischale lokalisiert sind ebenfalls eingebettet in Agarose.

2.2.2. Einbetten in festem Medium

Durch das Einbetten in festem Medium wie z.B. Agarose oder Alginat wird die mechanisch Stabilität der Protoplasten unterstützt und die Verklumpung der Zellen vermieden. Ebenso wird die Lebensfähigkeit verbessert und ein Anstieg der Teilungsrate (Plattierungsrate) kann beobachtet werden. Ein Vorteil von Alginat ist, dass man die Zellen leicht wieder herauslösen kann indem man einen Ca-Chelatbildner zusetzt. Dieser löst die Quervernetzungen zwischen den Polysacchariden und verflüssigt so das Alginat.

2.2.3. Zusammensetzung des Nährmediums

Dem Nährmedium werden verschiedene Kohlenhydrate als Osmotikum zugesetzt. Es hat sich gezeigt, dass Maltose z.B. bei Reis und Gerste zu den besten Ergebnissen führt. Ein schnelles Wachstum der Zellen wird ebenfalls durch das Vorhandensein einer geeigneten Stickstoffquelle gefördert.

Der Auxin-Gehalt der Mediums ist ein weiterer wichtiger Faktor. (Tabelle 2 aus Physiol. Planat. 98: 868-874 1996) Studie mit Gerste

ICF: %der intakten Zellen PDF: prim. Teilungshäufigkeit PE: Teilungsrate

Höchste PE wurde mit 4,5 µM 2,4-D in L8 Medium, d.h. 5mM Ammoniumnitrat und Maltose erreicht.

2.3. Regeneration von Getreide

Die Regeneration von Getreide kann sowohl über die somatische Embryogenese als auch über die Organogenese erfolgen. Bei der Organogenese werden immer mehrere Sprosse und Wurzeln gebildet und es wurde beobachtet, dass nur wenige dieser Gebilde zu Pflanzen regenerieren. Die somatische Embryogenese erfolgt durch die Subkultur der Kolonien, mit ca. 2-3mm Durchmesser, in speziellen Kulturmedien. Nach 3-5 Wochen werden die Kalli mit embryogenen Strukturen transferiert in ein Medium, das Spross und Längenwachstum fördert. Dies geschieht im Licht. Die gebildeten Pflänzchen werden dann in ein hormonfreies Medium übertragen wo sie dann Wurzeln bilden, anschließend werden sie in die Erde gepflanzt.

Bei der Regeneration treten häufig Probleme auf, zum Teil wird aus dem Kallus kein Spross gebildet und wenn doch Sprosse vorhanden sind bildet ein grossteil der Pflanzen keine Chloroplasten aus. Die in Erde ausgepflanzten Pflänzchen wiederum bilden nicht alle Samen. Diese Probleme beschränken sich im wesentlichen auf Protoplastenkulturen aus Embryosuspension. Studien mit Scutellumgewebe haben gezeigt, dass zwar die Zahl der gebildeten Zellkolonien geringer ist, die Mehrheit dieser Kolonien aber zu voll fruchtbaren Pflanzen auswächst.

3. Anwendung in der Pflanzenzucht

Protoplasten sind heutzutage ein nicht mehr wegzudenkendes Objekt der Pflanzenbiologie. Zum einen sind die ,,Zellen ohne Zellwand" für zahlreiche Untersuchungen besser geeignet als intakte Gewebe, zum anderen sind Protoplasten totipotent, d.h. aus einzelnen Protoplasten können wieder neue Pflanzen regeneriert werden.

Die wichtigen Getreidesorten konnten alle schon aus Protoplasten regeneriert werden, wobei die verschiedensten Gewebequellen genutzt wurden. (Tabelle Plant Science 111 (1995) 1-10) Die praktische Bedeutung der Protoplastenkultur liegt überwiegend im Bereich der Neuzüchtung.

Die Möglichkeit der Regeneration von Protoplasten wird für DNA-Transfer oder somatische Hybridisation genutzt. Der erste Erfolg wurde bei Reis erzielt wobei es den Anschein hat, dass dieser am einfachsten zu kultivieren und zu manipulieren ist.

Gentransfer durch direktes einschleusen von DNA wurde erfolgreich durchgeführt mit Elektroporation oder durch chemische Behandlung der Zellen mit PEG (Polyethylenglykol). Bei der Elektroporation führen elektrische Pulse zur Öffnung von Poren, durch diese kann die DNA eingeschleust werden. Zu diesem Thema gibt es aber noch einen Vortrag.

Durch die Fusion von Protoplasten wird eine somatische Hybridisation bzw. parasexuelle Hybridisierung auch zwischen sexuell inkompartibelen Spezies möglich. Denn es können auch genetisch verschiedene Protoplasten zur Fusion gebracht werden und diese erfolgt nicht über Gameten, also nicht sexuell. Aus der Fusion von genetisch verschiedenen Protoplasten resultieren Hybridprotoplasten. Voraussetzung für die Fusion ist zunächst einmal, dass die Protoplasten in Kontakt kommen und agglutinieren. Häufig verschmelzen erst einmal die Cytoplasmabereiche und man erhält ein Heterokaryon. Erst durch die Fusion der Zellkerne ist der Prozess abgeschlossen.

Auch zur Fusion kann man PEG oder Elektrische Pulse einsetzen. PEG scheint die Agglutination zu fördern, während die Fusion selbst auf Ca - Ionen zurückgeht. Allerdings werden die Protoplasten bei dieser Technik allzu leicht stark geschädigt. Das heute praktizierte Verfahren der Elektrofusion stellt eine schonende Fusion unter Feldpulsen hoher Intensität dar. Wenn die Protoplasten miteinander in Kontakt gebracht sind wird durch einen oder zwei kurze, aber starke Pulse die Fusion ausgelöst. Die Membran wird dadurch geschädigt und es bilden sich zunächst Poren in der Kontaktzone. Die Membran kollabiert anschließend vollständig in der Kontaktzone. Bild der Fusion Die Fusion selbst stellt kein Problem mehr dar, die Selektion der Hybridzellen dagegen ist problematisch. Denn zumindest bei der Verwendung von PEG treten nicht nur die gewünschten Fusionsprodukte auf. Neben dem erwünschten Typ A+B treten auch A+A und B+B als Fusionsprodukte auf. Da eine Aufzucht aller Protoplasten aus arbeitstechnischen Gründen nicht sinnvoll ist muss man also zunächst selektieren. Dies kann nach physikalischen oder physiologischen Eigenschaften geschehen.

Bei der Protoplastenfusion erfolgt nicht immer auch eine Kernverschmelzung. In diesem Fall kann man einen Zellkern völlig ausschalten oder eliminieren, was durch Röntgenstrahlung geschehen kann. Man erhält dann einen Hybrid der Mitochondrien und Chloroplasten als gentragende Strukturen enthält, diesen bezeichnet man dann als Cybrid. Hier eine Tabelle von Hybrid und Cybrid Pflanzen von Reis.

Züchtung mit Protoplasten können zur Lösung von bestehenden Problemen in der Landwirtschaft beitragen. Zum Beispiel die Züchtung von Kulturpflanzen, die von der Stickstoffdüngung unabhängig sind. Zum einen wäre die Einschleusung der sogenannten nif- Gene in das Pflanzengenom denkbar. Dies sind die Gene aus Bakterien, die für die Bindung des Luftstickstoffs nötig sind. Bis dahin ist es allerdings mit Sicherheit noch ein weiter Weg. Alternativ wäre auch eine somatische Hybridisation von Kulturpflanzen mit Leguminosen denkbar. Das heißt die Fusion von Protoplasten isoliert aus Wurzelknöllchen mit Protoplasten aus Kulturpflanzen.

Zum Abschluss ist zu sagen, dass sich jede Getreidesorte anders verhält und was bei einer Sorte zu durchschlagendem Erfolg führt muss nicht zwingend für eine andere ebenso erfolgreich sein. Wie schon gesagt erscheint Reis als am einfachsten zu kultivieren, möglicherweise auf Grund seines kleinen Genoms.

4. Literatur

- Heß, Dieter: Biotechnologie der Pflanzen Ulmer 1992
- Krautwig B., Lörtz H.: Cereal protoplasts Plant Science 111 (1995) S. 1-10
- Lörtz, Horst: Isolierte Protoplasten höherer Pflanzen - ihre Bedeutung in der Grundlagenforschung und Pflanzenzüchtung Mikrokosmos 69 (1980) S. 241-250

Infos aus dem Internet:

- Botanik Online: http://www.rrz.uni-hamburg.de/biologie/b_online/d29/29c.htm