Amplifikation und Klonierung von rDNA aus Sinorhizobium meliloti

Inhaltsangabe oder Einleitung

In diesem Versuch soll die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten
Sinorhizobium meliloti zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert und anschließend mit Hilfe von Transformation in E.coli kloniert werden.
Dazu wird zuerst die gesamte DNA der Bakterien in einem Schnellverfahren isoliert und
anschließend für die PCR eingesetzt. Diese ist in der Lage, auch aus einem komplexen DNAGemisch eine bestimmte Gensequenz zu amplifizieren, wichtig sind hierfür jedoch u.a. die richtige Wahl der Annealing-Temperatur und der Primer. Da es sich bei der 16S-rDNA um hochkonservierte Sequenzen handelt (die z.B. auch für taxonomische Bestimmungen eine bedeutende Rolle spielen), lassen sich hier unabhängig vom Bakterienstamm universelle Primer einsetzen. Die Annealing-Temperatur wird, genauso wie die Auswirkung des für die Replikation wichtigen Cofaktors Mg 2+, mithilfe mehrerer PCR-Ansätze getestet.
Nachdem mithilfe einer Gelelektrophorese der erfolgreichste Ansatz ausgewählt wurde (es muss sich eine kräftige, dominierende Bande bei 1,5 kb zeigen), wird das amplifizierte Gen in einen Vektor eingebaut und in den E.coli-Stamm JM109 transfomiert und anschließend kloniert. Aus 10 Einzelkulturen wird schließlich die Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse kontrolliert.
Damit fasst dieser Versuch eine große Bandbreite molekularbiologischer Techniken
zusammen, von der DNA-Isolierung über die PCR bis zur Transformation und Klonierung.