Determinación del crecimiento de hongos, con potencial productor de aflatoxinas, en leche fluida entera y harina de trigo

INDICE

Contenidos

Dedicatoria

Agradecimientos

Resumen

Introducción

Capítulo I: Marcoteórico
Antecedentes generales de los hongos
1.1 Caracterí sticas de los hongos
1.2 Condiciones de desarrollo y crecimiento
1.3 Micotoxinas
1.4 G é nero Aspergillusyaflatoxinas
1.5 Estructura qu í mica de las Aflatoxinas
1.6 Propiedades fisicoqu í micas de las aflatoxinas
1.7 Toxicidad de las aflatoxinas
1.8 Factores que influyen en la toxicidad de las aflatoxinas
1.9 L í mite de aflatoxinas establecido en los alimentos
1.10 Metabolismo de las aflatoxinas y efectos para la salud
1.11 Intoxicación por el consumo de aflatoxinas
1.12 Legislación de aflatoxinas en Chile y el mundo
1.13 Métodos de control y prevenci ó n contra hongos y micotoxinas
2. Antecedentes generales de los leche
2.1 Definición de la leche
2.2 Clasificación de la leche
2.3 Disposiciones generales de la leche
2.4 Requisitos microbiológicos para la leche
2.5 Composición nutricional de la leche
3. Antecedentes generales de la harina
3.1 Definición de harina
3.2 Clasificación de la harina
3.3 Disposiciones generales para la harina
3.4 Requisitos microbiol ó gicos de la harina
3.5 Composición nutricional de la harina

27 Capítulo II: Planteamiento del problema
1. Problema de investigación
2. Objetivo General
3. Objetivo específico
4. Variables de estudio
5. Operalizaci ó n de las variables

Capítulo III: Marco Metodológico
1. Dise ñ o metodol ó gico
1.1 Tipo de estudio
2. Muestreo
2.1 tipo de Muestreo
2.2 Universo
2.3 Muestra
2.4 Criterios de selección
2.5 Unidad deanálisis
3. Descripcióndeté cnicade recolecciónde información
3.1 Tipodetécnica: Toma de muestra microbiológica
4. Aspectosé ticos de la investigación

Capítulo IV: Programación de lainvestigación

Capítulo V: Resultadosy Análisis de resultados

Capítulo VI: Discusióny Conclusión

Bibliografía

Dedicatoria

Dedico esta tesis a todos mis seres queridos, a quienes me apoyaron siempre por sobre todas las cosas y a quienes creyeronenmi. Pero por sobre todo a Dios

Ana Belén Petermann T.

Agradecimientos

Atoda mifamilia, hermanos y amigos, especialmente a mi profesora gu í a, Dra. Ximena Ocampo, quien me apoyo siempre y a todos los docentes y auxiliares que me prestaron ayuda y apoyo durante este arduo proceso.

INDICE DE ANEXOS.

1. Carta Gantt

2. Cuadro Lógico

3. Mapa de maniobra de la Investigación

TABLA 1: Factores f í sicos, qu í micos y biol ó gicos necesarios para el ó ptimo desarrollo f ú ngico … 50-52

4. Estructura qu í mica de las aflatoxinas F1, F2, M1, M2, G1, G2

5. L í mites M á ximos Permitidos (LMP) de micotoxinas en alimentos destinados a consumo humano, seg ú n normativa

6. L í mite m á ximo de aflatoxinas en alimentos en varios pa í ses Europeos y Estados Unidos

7. Requisitos f í sicos y qu í micos de la leche ultrapasteurizada

8. Requisitos microbiol ó gicos de la leche

9. Requisitos microbiol ó gicos de la harina

10. Siembra en medio selectivo

11. Agar sabouraud Dextrosa

12. Recuento UFC

13. Aislamiento

14. Siembra en placa

15. Siembra en tubo con agar inclinado

16. Observaci ó n macrosc ó pica

17. Observaci ó n microsc ó pica

18. Fluorescencia

19. Hongos aislados de cultivos de harina de trigo A y B

20. Hongos aislados de cultivos de leche fluida entera A y B

Resumen

Introducci ó n: Pese a los cambios en la sociedad, hay alimentos que no varían en la dieta, a través del tiempo. Algunos de ellos son, la harina de trigo y la leche fluida entera, que actúan como sustrato, para diferentes organismos, donde se encuentran los hongos filamentosos. Capaces de producir sustancias toxicas denominadas aflatoxinas, que infestan el alimento, produciendo deterioro, además de efectos en la salud. Objetivo: Determinar el crecimiento de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en leche fluida entera y harina de trigo, en Concepción Chile 2015.

Metodolog í a: Para este estudio se utilizó un diseño observacional, el que consistió en realizar cultivos en duplicado, a partir de dos muestras de leche entera fluida A y B y dos muestras de harina de trigo A y B. Durante 7 días, se realizó recuento de UFC, repitiéndose el día 13. Finalizada la incubación por 7 días a 25ºC, se procedió al aislamiento de las colonias, posteriormente se realizó tinción con azul de metileno e identificación microscópica, anexándose a la macroscópia y se evaluó la potencialidad para producir aflatoxinas, mediante fluorescencia bajo exposición a luz U.V. Resultados: Las harinas analizadas, resultaron aptas para consumo, no así las leches. Se identificaron 4 géneros ; Alternar í a sp., Fusarium sp., Penicillium sp. y Aspergillus sp., este último, resultando ser potencial productor de aflatoxinas.

Conclusiones: La contaminación fúngica, con potencial aflatoxigenico, presente en los alimentos analizados, sugiere propensión a esta contaminación, mediante su consumo, significando un daño para la salud. Palabras claves: Hongos, aflatoxinas, Leche, Harina.

Abstract. Introduction: Despite the changes in society, there is food that do not change in diet over time. Some of them are wheat flour and liquid whole milk, which act as a substrate for different organisms, where you can filamentous fungi. Capable of producing toxic substances called aflatoxins which infest food, causing deterioration in addition to health effects.

Objective: To determine the growth of fungi with potential producer of aflatoxin, in liquid whole milk and whole wheat flour in Chile 2015, Concepción.

Methodology: For this study an observational design was used, which consisted in a duplicate growth from two liquid whole milk samples A and B and two samples of whole wheat flour A and B. During seven days, it was carried out a counting of UFC, which was repeated on day 13.

Once finished the 7 days incubation at 25 ° C it was proceded to the isolation of the colonies, then a methylene blue staining and microscopic identification was performed, annexing to the macroscopic. Finally it was evaluated the potential to produce aflatoxins, through the fluorescence under UV light exposure.

Results: The analyzed flour, are not suitable for consumption, not the milk. 4 genres were identified; Alternaria sp., Fusarium sp., Penicillium sp. and Aspergillus sp., the latter resulting to be a potential aflatoxin producer.

Conclusions: The fungal contamination with potential aflatoxigenic present in the foods analyzed, suggests propensity to this pollution through consumption, which can cause damage to health.

Keywords: fungi, aflatoxins, milk, flour.

Introducción.

La sociedad, desde sus inicios, se ha visto expuesta a cambios constantes, desencadenados tanto por el crecimiento de la población, como también por el aumento de ingresos. Factores, que inciden sobre la demanda de los alimentos, lo cual se incrementa aún más, en países en desarrollo y que produce, como consecuencia un cambio en la estructura de consumo (1).

Pese a esta situación, existen alimentos como la leche fluida entera y la harina de trigo, que se mantienen como un insumo básico en la alimentación, a través del tiempo, manteniéndose como un denominador común en la sociedad.

A nivel nacional, se estima que el consumo global per-cápita de lácteos, aumento casi 11% durante los últimos cinco años, alcanzando el año 2013, 146,5 litros per-cápita, cifra record en Chile y que seguirá creciendo exponencialmente (1). Además, se evidencia, una inclinación significativa por la leche fluida, descrita como “blanca”. Sin importar que experimente un aumento de precio, la preferencia por esta, en diferentes estratos sociales se mantiene constante y su penetración en el mercado es mucho mayor (2,3). La harina de trigo por su parte, como materia prima de sus diferentes derivados, mantiene estable su participación en la dieta de los chilenos, con un consumo promedio de 86,5 kilos por persona, sin sufrir mayores variaciones. De hecho, Chile presenta un consumo per-cápita entorno a derivados de trigo superior a Estados Unidos, como lo son la harina en primer lugar, el pan y por ultimo las pastas (4). Alimentos cotidianos, que forman parte, de los sustratos de preferencia para el crecimiento de hongos, pluricelulares, conocidos como filamentosos (mohos) y que además poseen la capacidad de producir sustancias toxicas denominadas micotoxinas (5). Una de estas micotoxinas es la aflatoxina, conocida como metabolito secundario, producido por hongos que corresponden al género Aspergillus, específicamente; Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nonius (6). Los que se ven favorecidos tanto por el sustrato como también por factores bioquímicos, biológicos y ambientales asociados, siendo capaces de originarse y colonizar alimentos de animales y humanos (7).

Existen cerca de 20 tipos de aflatoxinas conocidas (8), Las cuales son capaces de producir efectos dañinos para la salud, que van desde los agudos, de corta duración o crónicos, ocasionando: daño hepático y renal, mutagénesis, teratogénesis, carcinogénesis, inmunosupresión y citotoxicidad, hasta causar la muerte (9). Los estudios en torno a la materia, han establecido que efectivamente producen daño en el ADN, pudiendo desencadenar así, un potencial cáncer, debido al efecto acumulativo de estas micotoxinas, mediante intoxicación crónica que es la más frecuente, y que se produce al consumir de manera persistente, alimentos contaminados con bajas dosis de aflatoxinas (7,10). Frente a este tipo de eventos, y debido a la amplia gama de alimentos que se producen a nivel nacional, es que nace la inquietud de llevar a cabo el presente estudio, mediante el objetivo de esta investigación, el cual busca determinar el crecimiento de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en leche fluida entera y harina de trigo, en Concepción Chile. Lo cual, permitirá conocer realmente, a que nos exponemos al alimentarnos.

A continuación de presentan los diferentes capítulos a desarrollarse en este estudio, con el fin de dar cumplimiento al objetivo de esta investigación:

Capítulo I: Marco teórico: Este capítulo da descripción teórica completa a los conceptos de hongos, harina y leche. Además se abordara la descripción de diferentes tópicos, asociados a cada concepto de la investigación, desarrollados en orden, de manera de poder dar mayor comprensión a la temática en general.

Capículo II: Planteamiento del problema: Este capítulo plantea la problematización de la investigación, abarcado el problema de investigación, pregunta de investigación, objetivo general, objetivos específicos y variables de estudio, incluyéndose la operalización de las mismas.

Capítulo III: Marco metodológico: Este capítulo describe el marco y diseño metodológico de la presente investigación, identificándose el tipo de estudio que se va a realizar, junto con el muestreo correspondiente, indicándose tipo de muestreo, universo, muestra y sus diferentes criterios de selección, junto con ello se especifica la unidad de análisis. Se describe además, la técnica de recolección de información, en este caso correspondiente a toma de muestra microbiológica. Se indican además, las consideraciones y aspectos éticos de esta investigación.

Capítulo IV: Programación de la investigación: En este capítulo se describe la programación de la investigación.

Capítulo V: Resultados y Análisis de resultados: En este capítulo se detallan los resultados, análisis de estos, discusión y conclusión.

CAPITULO I: MARCO TE Ó RICO.

1. Antecedentes generales de los hongos

1.1 Caracter í sticas de los hongos.

“ Los hongos constituyen una numerosa agrupaci ó n de organismos con una amplia distribuci ó n a trav é s de la naturaleza” (11). Los cuales, pertenecen al reino "Fungi ”, sin embargo, fueron clasificados como pertenecientes al reino Plantae, aspecto que cambio con la aplicación de la biología molecular en estudios taxonómicos (12). Por otra parte estos seres eucariontes, cuentan con un núcleo delimitado por una membrana nuclear, con un nucléolo rico en ARN y organelos citoplasmáticos. Citoplasma que se encuentra limitado mediante una bicapa lipídica citoplasmática, la cual contiene proteínas y esteroles (ergosterol), quienes controlan la permeabilidad celular y que además participan en la síntesis de la pared celular. Por el exterior de la membrana citoplasmática, presentan una pared celular compuesta principalmente por polisacáridos, dentro de los que se encuentra la quitina, el mananas y el glucano, acompañados por diversas proteínas (11). Pese a que esta pared, es similar a la de células vegetales, tanto en grosor como en elementos estructurales. Los hongos, a diferencia de los vegetales, son carentes de cloroplastos y clorofila, no pudiendo realizar fotosíntesis (12). Esta carencia no es solo una forma de distinguirlos entre los vegetales, sino que es una condicionante en la actividad biológica de estos, ya que el hecho de carecer de clorofila provoca en ellos la incapacidad de sintetizar materia orgánica, por lo que deben desarrollarse sobre un sustrato que se las proporcione, lo cual los define como heterótrofos y que condiciona sus diferentes lugares de crecimiento (12). En cuanto a su morfología, los hongos se clasifican en dos tipos: una unicelular, denominada como levaduriforme, y una pluricelular, denominada como filamentosa. Estos últimos, (mohos), se caracterizan por tener un cuerpo formado por filamentos tubulares microscópicos que se ramifican y entrecruzan. Cada filamento es denominado hifa y normalmente se desarrollan a partir de esporas, aunque también pueden originarse a partir del fragmento de otras hifas (11). Por otra parte el crecimiento que se produce en los extremos de estas, se denomina como crecimiento distal o apical. En este proceso, las hifas se van extendiendo y a su vez, se van ramificando sucesivamente, cada una de ellas, hasta producir una maraña de filamentos, visible denominado micelio (11,12).

Con respecto a su función las podemos clasificar en hifas vegetativas (de crecimiento y nutrición) o hifas fértiles (de reproducción) y según su posición en hifas sumergidas o aéreas. Por su parte, el micelio puede ser vegetativo (sumergido) o fértil (aéreo) (6). Los hongos filamentosos se reproducen mediante la formación de esporas asexuales o conidios, que se encuentran y que se originan a partir de células diferenciadas de las hifas. Siendo, el conidio o espora asexual que una vez madura, se desprende y en condiciones correctas de sustrato, germina dando lugar a un nuevo hongo miceliar (11). Los hongos levaduriformes, por su parte, se caracterizan por presentar células de gran tamaño. Una levadura típica tiene una forma ovoide, pero también las hay alargadas, esféricas, en forma de pera o de limón o incluso triangulares. Cada especie tiene sus propias características, todo dependerá de la edad del cultivo y del medio en el que se encuentren (12). La estructura de una levadura es típica de una célula eucarionte. Al microscopio se pueden observar la pared celular, el citoplasma con sus respectivas vacuolas, glóbulos de grasa y sus gránulos metacromáticos, es decir, que pueden cambiar el color del colorante con el que son teñidos. Estas no poseen flagelo u otro órgano de locomoción, de hecho, algunas pueden presentar un material viscoso, compuesto de polisacáridos que rodea a la célula, cumpliendo la misma función que en las células bacterianas (12).

Lo que respecta a su reproducción, esta se lleva a cabo mediante división por gemación o por fisión binaria, en algunos casos las células hijas no se separan de la célula madre, formándose cadenas cortas que se han denominado como seudohifas (11). Los hongos que presentan este crecimiento, denominado seudomicelio, dan lugar a colonias similares a las que producen los hongos levaduriformes en los medios sólidos. Respecto a esto, existe un pequeño grupo de hongos, que presentan tanto crecimiento levaduriforme como miceliar, los cuales se denominan dimorficos y típicamente presentan un crecimiento filamentoso a 25 ºC y un crecimiento levaduriforme a 37ºC. Ejemplo de este último, es el caso de Candida albicans, que tiene un dimorfismo especial presentando crecimiento levaduriforme y filamentoso de manera simultánea (11). Dentro de los géneros de hongos filamentosos (mohos) destacan: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cephalosporium, Cladosporium, Fusarium, Helminthosporium, Monilia, Geotrichum, Gleosporium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sporotrichum, Trichotecium, Absid í a, Thamnidium. Por otra parte, dentro de los hongos levaduriformes encontramos: Candida, Rhodotorula, Mycoderma, Torulopsis (6).

1.2 Condiciones de desarrollo y crecimiento.

Con la finalidad de desarrollarse, estos organismos obtienen los nutrientes necesarios para ello, mediante la absorción a través de la pared celular del micelio nutritivo, el cual penetra el medio, donde se encuentra inserto. Si estos nutrientes, no se encuentran idealmente solubles, el hongo se verá en la obligación de secretar enzimas hidrolíticas, como lipasas, pectinasas y proteinasas al medio, con el fin de degradar los que son insolubles. Lo que a su vez, les otorga la capacidad de utilizar una amplia variedad de materiales orgánicos, tanto simples, como complejos, destacándose entre ellos, la glucosa; Carbohidrato simple propicio para la gran mayoría de los hongos, así como también lo son la sacarosa y la maltosa. En torno a los compuestos de carbono más complejos, se encuentran la celulosa y el almidón, los que también pueden ser utilizados por estos organismos. Además, estos tienen la capacidad de utilizar; carbono orgánico, nitrógeno orgánico como también inorgánico, en algunas especies (12). Es por esta razón, que cada producto alimentario es un sistema ecológico especial en el que la interacción, tanto de factores químicos, físicos y biológicos, poseen un papel fundamental en el deterioro de este, contribuyendo al crecimiento y proliferación fúngica (6).

Dentro de los factores físicos se pueden mencionar: Humedad y agua disponible (aw), Temperatura e Integridad física del alimento. Por otra parte se encuentran los factores Químico, como el ph, la composición del sustrato, nutrientes minerales y potencial de óxido-reducción. Finalmente como factores biológicos, se encuentran tanto la presencia de invertebrados como la cepa específica del hongo (6). Todos los diferentes factores mencionados se encuentran desarrollados a cabalidad en la TABLA 1.

1.3 Micotoxinas.

El termino micotoxina, como tal, proviene de la palabra griega “mykes” que significa hongo y “toxicum” que significa veneno y que describe las acciones adversas que pueden llegar a producir estas sustancias toxicas, sobre los organismos vivos, Tal y como lo describe Pitt (1996):” las micotoxinas son metabolitos f ú ngicos cuya ingesti ó n, inhalaci ó n o absorci ó n cut á nea reduce la actividad, hace enfermar o causa la muerte de animales (sin excluir las aves) y personas ” (13). Por otra parte estas se describen como metabolitos secundarios, representados por un tamaño molecular que se caracteriza por ser relativamente pequeño, por no ser volátiles a temperatura ambiente, normal y además por contar con una estructura química y una actividad biológica diversa (14,15). Estas sustancias tóxicas de origen fúngico, son contaminantes naturales del medio ambiente, siendo ampliamente encontradas en alimentos procedentes de todo el mundo (15). Tales como; harinas, granos, frutas, lácteos entre otros. Donde el hongo crece, coloniza y produce estas micotoxinas (9).

La mayoría de estos metabolitos secundarios, suelen formarse al final de la fase exponencial o al principio de la fase estacionaria del crecimiento de los hongos toxinógenos (16). Siendo estas micotoxinas, en su mayoría, genotípicamente específicas para un grupo de especies de un mismo género, sin embargo, el mismo compuesto, puede ser elaborado también, por hongos que pertenezcan a géneros distintos. Dándose, que mientras más compleja sea la ruta de biosíntesis de la micotoxina como tal, menor será entonces, el número de especies fúngicas capaces de elaborarla (16). De esta manera, las micotoxinas que se conocen y que se han descrito, son producidas por especies de los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium (14). A su vez, los hongos se pueden dividir en tres grupos, en función de su sustrato, del momento y de las condiciones en que se desarrollan, clasificándose en: hongos de campo (Alternaria, Cladosporium, Hemilthosporium, Fusarium), los cuales son agentes causales de enfermedades de los cultivos y que además invaden los granos de campo; hongos de almacén (Aspergillus y Penicillium) conocidos por desarrollarse después de la cosecha, durante el transporte, el secado lento, almacenamiento y procesamiento, bajo condiciones de humedad relativa baja y los hongos que se desarrollan en productos en estado de deterioro avanzado (Aspergillus, A. fumigatus, A. niger, A. clavatus), los cuales como requisito, necesitan de altos contenidos de humedad para su desarrollo (17). Razón, por la que los alimentos, se encuentran en total propensión durante cualquier punto de la cadena alimenticia, desde la siembra y cosecha, hasta en la carne y leche que se consume (9). Siendo la adquisición y sobre todo el consumo, de este tipo de alimentos contaminados por micotoxinas, y que se conoce como micotoxicosis (18), lo que produce efectos tóxicos inmediatos, además de inmunosupresores, mutagénicos, teratogénicos y carcinógenos, representando un peligro latente para la salud humana. “Actualmente se conoce una gran variedad de micotoxinas caracterizadas. Sin embargo, debido a su ocurrencia y toxicidad tanto en el hombre como en animales, sobresalen las denominadas aflatoxinas ” (7,14).

1.4 G é nero Aspergillus y aflatoxinas (AF).

“Aspergillus, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, pudi é ndose aislar de una extensa gama de sustratos ” (19). Siendo ampliamente estudiado desde hace ya siglos, debido a la gran cantidad de propiedades tanto industriales, como de deterioro, biotecnológicas y de efectos negativos en la salud, tanto animal como humana (19). Esta especie de hongo filamentoso, se encuentra en cualquier parte del mundo, y puede crecer en una gran variedad de condiciones ambientales y s obre una gran cantidad de alimentos. Dentro de este género, tres de los principales hongos que producen AF son: Aspergillus flavus Link, Aspergillus parasiticus Speare y Aspergillus nonius Kurtzman (7). Sin embargo, la presencia de Aspergillus no necesariamente implica presencia de aflatoxinas, pues hay cepas no toxigénicas; sin embargo, lo que es más interesante, la ausencia de Aspergillus en el alimento no necesariamente implica que el alimento no tenga aflatoxinas, debido a que la toxina puede persistir aun después que el moho ha desaparecido e incluso después de la cocción del alimento (8). En relación a las aflatoxinas, La palabra como tal, viene de a = Aspergillus, fla = flavus y toxina = veneno. Caracterizándose, por ser metabolitos secundarios que corresponden químicamente a bis dihidro-furano-cumarinas, los cuales se descubrieron en Gran Bretaña en 1960, después de la muerte de 100.000 pavos alimentados con cacahuate contaminado con el moho Aspergillus flavus y aflatoxinas, provenientes de Brasil. Estos mohos aflatoxicógenos crecen de 8ºC a 55 ºC con temperaturas óptimas de 36 a 38 ºC, la producción de AF se inicia de 11 a 14 ºC cesando a menos de 10 ºC o a más de 45 ºC. Siendo, la producción óptima de AF desde los 25 a 35 ºC. Viéndose favorecida la producción de estas, según el sustrato, por factores bioquímicos, biológicos y ambientales, a una humedad de 10% - 20% y a una humedad relativa de 70% - 90%. De esta manera, son capaces de colonizar y producir estas toxinas en diferentes medios, como son los alimentos para animales y para humanos. Las AF son toxinas de alimentos y la exposición del hombre a ellas es continua, encontrándose en cereales, maíz, arroz, trigo, sorgo, cebada, avena, centeno y sus productos derivados como tortillas, cereales para el desayuno, harinas, pastas, etc., en semillas oleaginosas, como ; cacahuate, nueces, avellanas, pistaches, piñones, semillas de girasol, de algodón, ajonjolí y almendras, en especias como; chiles, condimentos, paprika, comino, mostaza, etc., higos y frutas secas. Este tipo de micotoxinas es una de las más tóxicas, siendo esta, capaz de dañar a todos los animales (ganado bovino, aviar, equino, porcino, peces, ratas y mascotas como perros y gatos, etc.). Además, de contaminar los productos derivados de estos; como huevos y lácteos (leche, yogurt, quesos y crema), junto con derivados cárnicos como salami, jamón, pechugas de pollo, pathés, embutidos y cervezas. Además de encontrarse también, en alimentos balanceados para animales y humanos, encontrándose sólo trazas en vinos (7).

1.5 Estructura qu í mica de las aflatoxinas.

La estructura básica de las AF es un anillo dihidrodifurano o tetrahidrodifurano unido a una cumarina con un anilllo de cinco o seis átomos de carbono. Las difurano cumarinas ciclopentanonas de AF de las series B, M, P y Q son las AFB1, AFB2, AFB2a, AFM1, AFM2, AFM2a, AFQ1, AFP1 y AFL. El segundo subgrupo corresponde a las lactonas difurano cumarinas de la serie G como son AFG1, AFG2, AFG2a. Hay alrededor de 20 diferentes tipos de AF, las más importantes por su alto potencial cancerígeno, mutágeno y teratógeno son: B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1), G2 (AFG2), M1 (AFM1), M2 (AFM2), P1 (AFP1), Q1 (AFQ1) y D (AFD) (10). (Anexo 4)

A partir de la AFB1, se encuentra la aflatoxina M1, caracterizado como un metabolito derivado del hidroxilado de la AFB1, la cual se elimina en la leche de los animales que ingieren piensos contaminados con AFB1 (20). Pese a los diferentes tipos caracterizados de metabolitos secundarios, se considera a la aflatoxina B1 como la sustancia carcinogénica de origen natural más potente que se conoce y que se encuentra clasificada por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer como parte del Grupo 1 es decir, como carcinógena para el hombre (21).

1.6 Propiedades fisicoqu í micas de las aflatoxinas.

Las AF en estado puro, son cristales sólidos de colores, que van del blanco al amarillo, sin olor, sin sabor e incoloros, son insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos (metanol, cloroform o, acet ona, ac etonitrilo y dim etilsulfóxido) debido a su alta polaridad. Cuando las AF están en cloroformo o benceno son estables por años en refrigeración y oscuridad. En solución son sensibles a la luz, se descomponen en el aire, oxígeno, soluciones alcalinas o de ácidos suaves y se nombran según el color de la fluorescencia que emana con luz UV de onda larga, en color azul B (blue) con anillo de ciclopentano o verde G (Green) con anillo de lactona, lo que permite detectarlas en trazas de 0.5 ng o menos, en cromatografía de capa fina. Las AFB2 y AFG2 tienen difuranos saturados, y AFB2a y AFG2a tienen una unidad difurano hidratada. Por otra parte los subíndices 1 ó 2 de las AF tipo B, G, M o P indican la movilidad que tienen en la cromatografía de capa fina según su peso molecular, de 298 (AFP1) a 330 (AFG2 y AFM2), que da diferentes coeficientes de retención (RF) que las identifican. Los máximos picos de absorbancia de luz UV son de 265 nm a 362 nm, con una emisión a 425 nm (7).

Las AF ingresan al organismo mediante el consumo de alimentos, a través de la piel o al ser inhaladas, resisten altas temperaturas de 237 ºC (AFG2) a 320 ºC (AFP1), se descomponen de 237 ºC a 306 ºC, según el tiempo de calentamiento, la humedad del alimento y el pH. Así, las AF no se rompen con la ultra-pasteurización, cocción, freído o hervido, fermentación, ni nixtamalización, pero se pueden destruir si se calientan en autoclave con amonio o hipoclorito de sodio. Actúan en trazas de millonésimas de gramo (microgramos por kilogramo = μg kg-1) o menos. Durante la nixtamalización, por ejemplo: (pH de 8 a 12), el anillo de lactona de la AF se abre y pierde su fluorescencia, `pudiéndose llegar a pensar que están ausentes, pero en contacto con soluciones ácidas del jugo gástrico, regresan a pH neutro, reactivándose y fluoresciendo otra vez (7).

1.7 Toxicidad de las aflatoxinas.

Las aflatoxinas son carcinógenos genotóxicos, por lo que se piensa que generalmente no hay una dosis umbral por debajo de la cual no se produzca formación de tumores. Los múltiples informes de evaluación del riesgo permiten deducir que incluso niveles bajísimos de exposición a las aflatoxinas (p. ej., 1 ng/kg p.c. /día o menos) contribuyen al riesgo de cáncer de hígado. Respecto a la aflatoxina M1, el Comité científico de la alimentación humana aceptó que hay suficientes pruebas de que la aflatoxina M1 es un carcinógeno genotóxico; se calcula que su potencia carcinogénica es unas diez veces menor que la de la aflatoxina B1. Sin embargo, como la ingesta de leche y productos lácteos por el hombre puede ser considerable, especialmente entre lactantes y niños pequeños, es necesario valorar los riesgos derivados de la exposición a las aflatoxinas. Según el Centro Internacional de Investigación sobre el Cáncer (CIIC) en 1998, se determinó que existen suficientes datos demostrativos del efecto carcinógeno de mezclas naturales de aflatoxinas en el ser humano, las cuales se clasifican por ello como carcinógeno del grupo1, salvo en el caso de la aflatoxina M1 que se considera posible carcinógena para el hombre grupo 2B (16).

1.8 Factores que influyen en la toxicidad de las aflatoxinas.

El tipo y cantidad de aflatoxinas producidas no solo depende de las características de la cepa individual, sino también de las condiciones medio ambientales (nutrientes, parámetros físico-químicos, etc.). Las condiciones de crecimiento que permiten la toxigénesis son más limitadas que aquellas que posibilitan el crecimiento del hongo. Existen dos categorías principales que conducen a la presencia de micotoxinas en los alimentos, estas son: factores intrínsecos y extrínsecos. En relación a los factores intrínsecos la producción de una determinada micotoxina no está asociada con una especie en particular sino con una cepa en concreto, es decir, que su producción no depende solo del genotipo de la cepa sino también de toda una serie de factores ambientales (extrínsecos) que ejercen de alguna u otra forma, influencia sobre el crecimiento y metabolismo de la cepa (14,16). Los principales factores externos que influyen en la toxicogénesis son: gases atmosféricos, humedad relativa de equilibrio, descenso en la presión parcial de oxígeno, temperatura. Dentro de los factores químicos destacan: La actividad de agua (agua libre, agua combinada), potencial redox, composición del sustrato, nutrientes, pH, zona de microflora e integridad física del grano o alimento. Además se pueden agregar, factores como el substrato en que la cepa se encuentre aislada y el manejo en laboratorio, del cual se desprende la estabilidad en la capacidad toxigenica, de este metabolito, ya que se ha visto que ” la producci ó n de micotoxinas suele ser una propiedad caracter í stica de un aislamiento, pero en algunos casos la capacidad de s í ntesis de un metabolito secundario determinado, puede ser transitoria, vi é ndose afectada por el manejo en laboratorio ” (14,16).

1.9 L í mites de aflatoxinas establecidos en los alimentos.

El Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA), establece los Límites Máximos Permitidos (LMP) para Aflatoxinas Totales, Aflatoxina M1 y Zerealenona en alimentos destinados a consumo humano (7) (Anexo 5).

1.10 Metabolismo de las aflatoxinas y efectos para la salud.

La aflatoxina B1 (AFB1) está entre los más potentes carcinógenos conocidos para algunas especies animales y el hombre. La capacidad de la AFB1 para provocar diferentes efectos sobre la salud, radica en su metabolismo. Este sistema, es el responsable de cinco mecanismos básicos para la biotransformación de la AFB1, los cuales se representan mediante reacciones de reducción, hidratación, epoxidación, hidroxilación y orto-desmetilación. A través, de esta reducción mediada por la acción de enzimas citoplasmáticas, NADPH-dependiente, presentes en la fracción soluble del hígado, se obtiene un producto reducido, denominado aflatoxicol, el cual se caracteriza por poseer una toxicidad, aparentemente mucho menor que la AFB1, sin embargo esta conversión es reversible, por lo que el aflatoxicol, se convierte en un reservorio de la toxicidad de AFB1, pudiendo convertirse nuevamente en la aflatoxina inicial, o también puede ser metabolizado en AFM1 o AFH1, lo cual se produce en el espacio intracelular, por acción de la deshidrogenasa microsomal (23). Por otra parte, el proceso de hidratación da como resultado un metabolito AFB2a, el cual tiene por acción principal, la inhibición de enzimas, en los tejidos del hígado y otros, causando la reducción de la síntesis proteica. Llegándose a la conclusión, de que la formula pura de AFB1 no tiene acción mutagénica, sino que es la biotransformación de este compuesto, durante la reacción de epoxidación, la que transforma a la AFB1 en un potente compuesto carcinógeno. Este compuesto, 8,9 epoxido, resulta ser altamente electrofilico, reaccionando rápidamente, a través de uniones covalentes con sitios nucleófilos de otras macromoléculas como son el ácido desoxirrobucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y proteínas. Por ende, la unión de 8,9 epoxido de aflatoxina con la guanina del ADN en la posición N-7, determina la formación de aductos AF-N7- guanina en la célula diana, resultando de este aducto, una transversión sufrida por el par guanina-citocina (GT), en el codón 249 del gen supresor tumoral p53. Los aductos formados en el ADN, pueden ser removidos, luego de su formación dejando sitios vacantes, siendo ocupados por una adenina, produciéndose una mutación, importante en el inicio del cáncer (23, 24). Entre otras cosas, la unión de 8,9 epoxido de aflatoxina con el ADN o ARN del hígado ha sido demostrado in vivo e in vitro, dejando en evidencia la inhibición de la síntesis de ARN mensajero, la actividad de ARN dependiente de AND polimerasa, de la síntesis de proteínas en el hígado y la disminución de las proteínas plasmáticas durante la aflatoxicosis, causa una reducción del metabolismo de la grasa en el hígado, produciéndose necrosis y degeneración grasa, además de la disminución en el flujo de bilis y la absorción anormal de nutrientes especialmente. (23).

La AFM1 y AFQ1, son producto de la reacción de hidroxilación a la cual fue sometida la AFB1, los cuales poseen un grupo hidroxilo, que les permite conjugarse con el ácido glucuronico, sulfato y glutatión, lo que los hace muy solubles en agua, pudiendo excretarse por vías como son La bilis, orina y leche. En su mayoría, las aflatoxinas debieran de excretarse entre 72 horas a 96 horas después, de la exposición. Sin embargo, tanto hígado, como riñones poseen un tiempo se retención mucho más largo en comparación con otros tejidos, lo que las retiene en el sistema (23).

1.11 Intoxicaci ó n por el consumo de aflatoxinas.

Estos metabolitos tóxicos, de origen fúngico al encontrarse tanto en alimentos y piensos, se han relacionado con diversos tipos de enfermedades tanto en animales como en las personas, mediante la exposición a estas micotoxinas (13).

La exposición humana a aflatoxinas se produce principalmente por ingestión de alimentos contaminados, como también a través de la piel o al ser inhaladas (7, 24). La inhalación de estas toxinas puede suceder ocasionalmente mediante exposición de tipo laboral o profesional. Dentro de los efectos agudos por micotoxinas se hallan: hepatitis aguda, los síndromes de Reye y de Kwashiorkor especialmente en niños de los trópicos. Donde el cuadro clínico incluye hígado graso y edema cerebral sever o. Al respecto, el Organismo de Naciones Unidas considera que el riesgo de intoxicación aguda por micotoxinas es entre moderado y bajo, en comparación con otras familias de compuestos, como las de origen microbiológico. Sin embargo a largo plazo se presentan efectos nocivos, en los sistemas nervioso central, cardiovascular, respiratorio y sistema digestivo, además de aumentar la sensibilidad al estrés, así mismo inducir cáncer y mutaciones produciendo efectos potentes como agentes carcinogénicos, mutagénicos, teratogénicos, estrogénicos, inmunotóxicos, nefrotóxicos y neurotóxicos, lo que trae como consecuencia, una mayor mortalidad y un aumento de los casos de c arcinoma hepatocelular primario (cáncer de hígado), sobre todo en personas que padecen de problemas hepáticos subyacentes (18,24). Hoy en día, se ve extendida la opinión sobre cuál es el efecto más importante sobre el ser humano, particularmente en países en desarrollo, llegándose a la conclusión en que uno de estos efecto radica, en la capacidad de estas toxinas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y por consiguiente de reducir la respuesta a enfermedades infecciosas (13).

1.12 Legislaci ó n de aflatoxinas en el Chile y en el mundo.

En Chile el Reglamento Sanitario de los Alimentos establece límites sólo para las Aflatoxinas totales (5 ppb), Aflatoxina M1 (0.05 ppb) (25).

El nivel máximo permitido de la aflatoxina M1 en leche líquida deshidratada y en productos lácteos varía de un país a otro y depende también de consideraciones económicas. En la Unión Europea, el nivel máximo de la AFM1 no debe ser superior a 0,05 ng/g en leche cruda, tratada térmicamente y en productos derivados, en cambio, en la leche destinada a alimentación infantil no debe superar los 0,025 ng/g. En Estados Unidos no debe superar los 0,5 ng/g(5). (Anexo 6).

1.13 M é todos de control y prevenci ó n contra hongos y micotoxinas.

Prácticamente todos los animales en la cadena alimenticia pueden ser afectados por estas micotoxinas, mediante el consumo de alimentos y piensos contaminados, inclusive los humanos, quienes pueden exponerse directamente a las toxinas mediante manipulación y consumo de granos o indirectamente mediante consumo de compuestos no metabolizados o productos metabolizados tóxicos en carne contaminada o productos derivados de animales vivos (ejemplo: queso y leche) (8). Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas, métodos y mecanismos que puedan ayudar a reducir los niveles estas toxinas de origen fúngico, en alimentos para animales vivos e insumos alimenticios básicos, para consumo humano. Es por esto que se establecen las siguientes propuestas para reducir la contaminación de hongos y micotoxinas: 1.Realizar buenas prácticas agronómicas: 2.Identificar y separar productos contaminados; 3.Implementar un sistema de almacenamiento de productos en condiciones de humedad y temperatura controladas; 4.Desinfectar productos contaminados; 5.Desarrollar variedades con resistencia genética (8).

2. Antecedentes generales de la leche. 2.1 Definici ó n de la leche.

Según la Real Academia Española, la acepción de leche corresponde a: “ Liquido blanco que segregan las mamas de las hembras de los mam í feros para alimentos de sus cr í as”. Por otra parte EL ARTICULO 197, DEL REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, denomina a la leche como “el producto de la ordeña completa e ininterrumpida de vacas sanas, bien alimentadas y en reposo, exenta de calostro”, agregando dentro del mismo artículo que, “las leches de otros animales se denominan según la especie de que proceden, como también los productos que de ella se deriven”. A su vez, el punto 2.1 de LA NORMA GENERAL DEL CODEX PARA EL USO DE TERMINOS LECHEROS, denomina al término leche como “la secreción normal de animales lecheros obtenida mediante uno o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción, destinada al consumo en forma de leche líquida o a elaboración ulterior”, agregándose en el punto 4.2 , el uso del término “leche”, lo cual se desarrolla en el punto 4.2.1, donde se especifica que “ podrán denominarse “Leche” solo los alimentos que se ajusten a la definición formulada en la sección 2.1, antes mencionada. Junto con ello, se indica que “ si tales alimentos se destinan a la venta en cuanto tales se denominaran “ leche cruda ” u otra expresi ó n apropiada que no induzca a error o a enga ñ o al consumidor ” (27).

2.2 Clasificaci ó n de la leche.

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), sostiene que la leche líquida abarca tanto leche pasteurizada, como desnatada, además de la leche normalizada, reconstituida y la leche de larga conservación (UHT). Por otra parte entidades como la Sociedad Argentina de Nutrición, dan clasificación a la leche por su sistema de higienización, en este ítem se describe a la leche UHT O UAT (ULTRA ALTA TEMPERATURA) como aquella en que se somete al flujo de leche a 145ºC solo dos segundos, con envasado aséptico posterior. Al cortar tanto el tiempo de calor, se logra la esterilización sin disminuir nutrientes, y manteniendo el sabor. También se describen tanto a la leche esterilizada, como también a la leche pasteurizada. En el caso de la leche esterilizada, se indica que una vez envasada, se somete a 120ºC durante 20 minutos. Al ser eliminado todo tipo de gérmenes, puede conservarse a temperatura ambiente durante varios meses; pero con la disminución de gran parte de los nutrientes. Por otro lado, la leche pasteurizada se describe como aquella leche sometida a una temperatura de 72 ºC durante 15 segundos, con lo cual se asegura la eliminación de gérmenes patógenos, persistiendo aquellas bacterias propias de la leche, indicándose que debe conservarse en Frío. Lo que respecta a la clasificación según estado físico de la leche, el ítem sugiere que la leche líquida, se encuentra en el mismo estado que la leche cruda, con un 87 % de agua en su composición. Se describe además, a la leche condensada como leche a la cual se le elimina parte del agua que contiene, mediante evaporación bajo vacío y luego se le agrega sacarosa para asegurar la conservación. Por su parte, la leche en polvo se describe a partir de la leche higienizada, la cual es sometida a un proceso complejo de secado y eliminación del agua hasta un 4% o menos, lo que permite aumentar la vida útil hasta 3 años en la leche descremada y seis meses en la leche entera. Desde el punto de vista de su contenido nutricional, se indican en este ítem de clasificación, a la leche entera, como aquella que contiene todos los nutrientes, le siguen las leches semidescremada, la cual contiene la mitad de lo estipulado como normal de grasa, la leche descremada, que no contiene grasa, además de la leche fortificada, que contiene una adición de vitaminas y de calcio y la leche enriquecida, con adición de nutrientes que la leche no contiene en su estado natural, junto con la deslactosada, descrita como leche con menor contenido de lactosa (28). La clasificación vigente procedente del REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, indica dentro del ARTÌCULO 204, que la leche se clasificara como leche natural, a aquella que solamente ha sido sometida a enfriamiento y estandarización de su contenido de materia grasa antes del proceso de pasteurización, tratamiento a ultra alta temperatura (UHT) o esterilización. Por otra parte la leche reconstituida es descrita como el producto obtenido por adición de agua potable a la leche concentrada o a la leche en polvo, en proporción tal, que cumpla los requisitos establecidos en el ARTÍCULO 203 (características de las leches) y su contenido de materia grasa corresponda a alguno de los tipos de leche señalados en el artículo 205 (clasificación por contenido de materia grasa). Deberá ser pasteurizada, sometida a tratamiento UHT o esterilizada. Además incluye dentro de su clasificación a la leche recombinada indicándola como producto de la obtención de la mezcla entre leche descremada, grasa de leche y agua potable en proporción tal que cumpla los requisitos del ARTICULO 203 y su contenido de materia grasa corresponda a alguno de los tipos de leche señalados en el ARTICULO 205. Deberá ser pasteurizada, sometida a tratamiento UHT o esterilizada. A su vez, se estipula dentro del ARTICULO 205, del presente reglamento, la clasificación de las leches de acuerdo a su contenido de materia grasa láctea, donde se caracteriza a la leche entera como aquella con un contenido superior a 30 gramos de materia grasa por litro, seguida por la leche parcialmente descremada, la cual deberá tener como contenido un máximo de 30 gramos de materia grasa y un mínimo superior de 5 gramos por litro, agregando además, a esta clasificación la leche descremada, como aquella con contenido máximo de hasta 5 gramos por litro de materia grasa.

2.3 Disposiciones generales para la leche.

De acuerdo a lo que se estipula en el REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, PARRAFO II, De los requisitos de la leche, ARTÍCULO 203. Las características de las leches, deberán contemplar, caracteres organolépticos normales, estar exenta tanto de materias extrañas, como también de sangre, pus y antisépticos, antibióticos y neutralizantes. Por otra parte, se indica claramente que los residuos de plaguicidas y otras sustancias nocivas para la salud no deberán exceder los límites establecidos por el Ministerio de Salud. Lo que respecta a los requisitos microbiológicos, propiamente tal, y su contenido de materia grasa, estos serán los que determina este reglamento en cada caso. Específicamente en el caso de la leche de vaca, se presentan las siguientes características, las cuales abarcan desde el peso específico (1.028 a 1.034 a 20ºC), índice cronoscopio (- 0,53 a – 0,57 “Horvet” o 0,512 a – 0,550 ºC), pH (6,6 a 6,8), acidez, (12 - 21 ml de hidróxido de sodio 0,1 N/100 ml de leche) hasta solidos no grasos (82,5 gramos por litro, como mínimo). A su vez, la NORMA TÉCNICA ECUATORIANA, dentro de sus disposiciones generales para la leche, clasifica a la leche pasteurizada en entera, semidescremada y descremada, según requisitos físicos y químicos, siendo estos parámetros, analizados de acuerdo a las normas de ensayo correspondientes, y que se espera, las muestras en estudio debiesen cumplir. (Anexo 7)

2.4 Requisitos microbiol ó gicos para la leche

Según lo Estipulado en el REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, Párrafo III, de las Especificaciones microbiológicas por grupo de alimentos, ARTICULO 173: “si en un alimento se detecta la presencia de microorganismos pat ó genos no contemplados en la lista indicada a continuaci ó n, la autoridad sanitaria podr á considerarlos alimentos contaminado, conforme a la evaluaci ó n de los riesgos que de su presencia se deriven ” .

(Anexo 8).

2.5 Composici ó n nutricional de la leche.

La leche es una compleja mezcla de distintas sustancias, las que se encuentran presentes en suspensión o emulsión y otras en forma de solución verdadera. Presenta sustancias definidas como agua, la cual representa la fase dispersante, en la que los glóbulos grasos y demás componentes de mayor tamaño se encuentran emulsionados o suspendidos. Las sustancias proteicas se encuentran formando un coloide en estado sol liófobo (caseína y globulina) o liófilo (album ina), mientras que la lactosa y las sales se hallan en forma de solución verdadera. Lo que respecta al componente graso, este se sintetiza mayoritariamente en las celulares secretoras de la glándula mamaria y constituye cerca del 3 % de la leche, encontrándose en forma de partículas emulsionadas o suspendidas en pequeños glóbulos microscópicos, cuyos diámetros pueden variar de 0,1 a 0,22 micrones que se encuentran rodeados de una capa de fosfolípidos que evitan que la grasa se aglutine y pueda separarse de la parte acuosa. Además, la grasa de la leche puede sufrir alteraciones causadas por la acción de la luz, del oxígeno y enzimas (lipasas). A su vez, la proteína que compone la leche, es del 3,5% (variando desde el 2,9% al 3,9%), siendo esta una mezcla de numerosas fracciones de proteínas diferentes con pesos moleculares distintos, clasificándose en dos grandes grupos: caseínas (80%), la cual es la más abundante y característica de la leche por encontrarse en otros alimentos, clasificándose en tres tipos: ( a, b y kapa case í na) y el (20%) correspondiente a proteínas séricas, que se subdivide en albumina y globulina. La albumina, como tal, es una proteína que se desnaturaliza con facilidad al ser sometida a altas temperaturas, siendo esta la razón de porque durante el calentamiento, se destruye gran cantidad de la proteína sérica, por otra parte las globulinas de la leche, además de poseer un alto peso molecular, se encuentran preformadas en la sangre, existiendo la posibilidad de que parte de ellas se produzcan en las células del parénquima mamario, siendo las proteínas que más fluctuaciones experimentan en el transcurso de un periodo de lactación, pasando de un 9% a 16 % del total de la proteína. La lactosa, es el principal hidrato de carbono de la leche, su concentración es constante, a diferencia de la grasa de la leche, siendo similar en todas las razas lecheras, además de ser difícil de alterar con prácticas de alimentación (29).Lo que respecta a vitaminas, la leche presenta tales como: A, D, E K, B1, B2, B6, B12, C, carotenos, nicotinamida, biotina, ácido fólico. Los minerales contemplan: Sodio, potasio, magnesio, calcio, manganeso, hierro, cobalto, cobre, fósforo, fluoruro, yoduros. Reconociéndose la presencia de otros en cantidades vestigiales, como el aluminio, molibdeno y plata. A los cuales se les denomina como extracto seco o solidos totales. Los sólidos totales varían por múltiples factores como lo son: la raza, el tipo de alimentación, el medio ambiente y el estado sanitario de la vaca entre otros. En resumen la composición general de la leche, por cada 100 gramos es: Agua (88%), Energía (61 Kcal), Proteína (3,2 g), grasa (3,4 g), lactosa (4,7 g), minerales (0,72 g) (30).

3. Antecedentes generales de la Harina.

3.1 Definici ó n de Harina.

La Según la Real Academia Española define la palabra harina, por medio de 4 acepciones diferentes, las cuales corresponden, en primer lugar a harina como, “Polvo que resulta de la molienda del trigo o de otras semillas”, seguido a esta, se define al polvo propiamente tal, pero despojado del salvado o la cascarilla, por otra parte, otras acepciones describen al polvo tanto procedente de algunos tubérculos y de legumbres. Indicando además, a la harina como “polvo menudo que se reduce a materias sólidas”. En tanto, el ARTÍCULO 347, del REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, define “ harina, sin otro calificativo, como el producto pulverulento obtenido por la molienda gradual y sistem á tica de grano de trigo de la especie Triticum aestivum sp. Vulgare, previa separaci ó n de las impurezas, hasta un grado de extracci ó n determinado”. Seguido a esta acepción, se especifica por medio del ARTICULO 348, que “el producto pulverulento proveniente de la molienda de otros granos, ser á designado con la palabra harina, seguida de un calificativo que indique la o las especies de grano de la que provenga ” . Por otra parte el punto 2.1 de la NORMA DEL CODEX PARA LA HARINA DE TRIGO, entrega como definición de la harina de trigo, entendiéndose esta, como “el producto elaborado con granos de trigo com ú n, Triticum aestivum L., o trigo ramificado, Triticum compactum Host., o combinaciones de ellos por medio de procedimientos de trituraci ó n o molienda en los que se espera parte del salvado y del germen, y el resto se muele hasta darle un grado adecuado de finura ”

3.2 Clasificaci ó n de la harina.

Bajo el criterio de “uso”, la harina de trigo se clasifica, según La NORMA TECNICA ECUATORIANA, en harina panificable, donde se encuentra la harina extra, la cual corresponde a una harina elaborada hasta un grado de extracción determinado, que puede ser tratada con blanqueadores y /o mejoradores, productos máliticos, enzimas diastáticas y fortificada con vitaminas y minerales. Por otra parte, se encuentra la harina integral, la cual se obtiene a partir de granos limpios de trigo y que contiene todas las partes de este, que puede ser tratada con mejoradores, productos málticos, enzimas, diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales. A su vez, existen harinas especiales, las cuales contienen un grado de extracción bajo, como lo permita el proceso de industrialización, cuyo destino es la fabricación de productos de pastificio, galeteria y derivados de harinas edulcorantes, que pueden ser tratadas con mejoradores de olores, productos máliticos, enzima diastática y fortificada con vitaminas y minerales. Dentro de esta clasificación es posible encontrar a las harinas para pastificio, las que se elaboran a partir de trigos aptos para estos productos, que puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores, productos málticos, enzimas diastásicas y fortificada con vitaminas minerales. Junto con ella se agrupa en su clasificación la harina para galletas, la que se elabora a partir de trigo blando y suave o con otros trigos aptos para su elaboración, que puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores, productos málticos, enzimas diatásicas y fortificada con vitaminas y minerales. Finalizando con esta clasificación para las harinas especiales, se encuentra la harina autoleudante, producto que se define por contener agentes leudantes y que puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores y fortificada con vitaminas y minerales. El ultimo tipo de harina, se denomina en su clasificación, como harina para todo uso, la cual proviene de las variedades de trigo Hard Red Spring o Norther Spring Hard Red Winter, homólogos canadienses y trigos de otros orígenes que sean apto para la fabricación de pan, fideos, galletas, etc. Tratada o no con blanqueadores y/o mejoradores, productos málticos, enzimas diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales (31).

3.3 Disposiciones generales para la harina.

Según lo estipulado en el REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, Párrafo II, de las harinas, ARTICULO 349. La harina, como tal deberá responder a los requisitos de contener hasta una máximo de 15 % de humedad, además de contener un máximo de 0,25 % de acidez expresada en ácido sulfúrico, sobre la base de 14,0% de humedad y contener hasta una máximo de 0,65 % de cenizas, sobre la base de 14,0 % de humedad, junto con contener también, hasta un máximo de 0,4 % de fibra cruda sobre la base de 14,0% de humedad y no contener menos de 7,0% de materias nitrogenadas (N x 5,7), sobre la base de 14,0% de humedad , y ser blanca, marfil o ligeramente amarillenta.

3.4 Requisitos microbiol ó gicos para la harina.

Según lo Estipulado en el REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS, Párrafo III, de las Especificaciones microbiológicas por grupo de alimentos, ARTICULO 173 , si en un alimento se detecta la presencia de microorganismos pat ó genos no contemplados en la lista indicada a continuaci ó n, la autoridad sanitaria podr á considerarlos alimentos contaminado, conforme a la evaluaci ó n de los riesgos que de su presencia se deriven.

(Anexo 9)

3.5 Composici ó n nutricional de la harina

Aunque cualquier producto procedente de la molturación de un cereal puede denominarse harina, se hace referencia exclusivamente a la procedencia del trigo. Solamente, el trigo y el centeno producen harinas directamente panificables, para lo que se precisa la capacidad de retener los gases producidos durante la fermentación, que ocasiona el volumen de la masa. Lo que se refiere a la composición de la harina propiamente tal, la composición media de una harina de trigo para una tasa de extracción del 76% corresponde respectivamente a: Almidón (60% - 72%), Humedad ( 14%-16%), proteínas (8%-14%), otros compuestos nitrogenados (1%-2%), azúcares (1%-2%), grasas (1,2% -1,4%), minerales (0,4%- 0,6%), celulosa, vitaminas, enzimas y ácidos (---) (32).

CAPITULO II: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 1. Problema de Investigación

Desde sus inicios, la sociedad ha incurrido en implementar la leche como también la harina, dentro del consumo básico en la alimentación, lo cual se ha mantenido a través del tiempo y que se ve reflejado actualmente, en que estos alimentos se siguen contemplando dentro de la alimentación básica familiar. Pues bien, al respecto son diferentes los estudios que arrojan, que en Chile, el consumo de lácteos a aumentando de manera considerable y que este seguirá creciendo exponencialmente, viéndose reflejado en el consumo per cápita, evidenciándose además, una inclinación significativa por la leche fluida, descrita como “blanca”. Sin importar que esta experimente un aumento de precio, la preferencia por esta, en los diferentes estratos sociales se mantiene constante y su penetración en el mercado es mucho mayor (2,3).

De igual manera, en el caso de la harina de trigo, la cual al ser ocupada como materia prima para diferentes preparaciones, se ubica como un denominador común, junto con la leche entera en la alimentación de la población. De hecho, Chile presenta un consumo per- cápita de trigo superior a Estados Unidos, en productos derivados de trigo, como lo son la harina en primer lugar, siguiéndole a esta, el pan y por ultimo las pastas. Además, nuestro país también presenta un alto consumo per- cápita, respecto a países como: Australia y Canadá. En pan por ejemplo; Chile, registra un consumo de 98 Kg per-cápita, en pastas 9 Kg per-cápita y en harina 81 Kg per-cápita, cifras superiores en comparación a los países mencionados anteriormente (4). Pese a que es una opción consumir estos alimentos, el hecho de que no se produzca un suceso que afecte directamente la salud, no lo es. Siendo alimentos como los anteriormente citados, un sustrato ejemplar. Tal y como lo describen, J.Armijo C. &J. Calderón (2009)...“Los hongos contaminan los alimentos y all í producen micotoxinas que tienen efectos adversos sobre organismos vivos, animales y humanos ” ... Una de las micotoxinas considerada como el cancerígeno más potente son las aflatoxinas, sin embargo solo un grupo reducido de hongos filamentosos, pertenecientes al género Aspergillus sp., posee la capacidad de producirla (8). Estos metabolitos tóxicos secundarios, producto de los hongos aflatoxinogenos, se han detectado también en alimentos como: queso, maíz, maní, algodón, nueces, almendras, higos y una gran variedad de alimentos para animales (9). Por lo tanto, como sustrato, tanto harina de trigo como leche fluida entera, se convierte en vehículos para este tipo de micotoxinas, produciéndose una exposición reiterada a estas, mediante su consumo. Lo cual, puede llegar a producir desde intoxicaciones, hasta el daño irreversible en la salud, como se ha demostrado en estudios, donde se describe “que a pesar de la ausencia de cambios significativos en el peso hep á tico relativo y de lesiones macrosc ó picas, los hallazgos histopatol ó gicos y los resultados de las actividades enzim á tica discutidos, indican que aves sometidas a la dieta con 0,07 mg de AFB1/Kg de alimento, presentaron alteraciones hep á ticas morfol ó gicas y funcionales a pesar de la baja concentraci ó n de toxina suministrada, evidenci á ndose una aflatoxicosis cr ó nica ” (33).Agregándose que “ estos resultados dejan entre ver que no existe un nivel seguro de aflatoxina en los alimentos ” (33), causando efectos tanto con dosis bajas, medias o altas de corta duración (agudos), como también aquellos que pudieran durar meses o años (crónicos), ocasionando: daño hepático y renal, mutagénesis, teratogénesis, carcinogénesis, inmunosupresión y citotoxicidad, hasta causar la muerte (9). Es entonces, que nace la inquietud de determinar el crecimiento de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en leche fluida entera y harina de trigo, para conocer de manera palpable esta realidad que es a lo que nos vemos expuestos al alimentarnos.

Pregunta de investigaci ó n:

¿Qué hongos con potencial productor de aflatoxinas se encuentran presentes en Leche fluida entera y la harina de trigo.

2. Objetivo general:

Determinar el crecimiento de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en leche fluida entera y harina de trigo, en Concepción Chile 2015.

3. Objetivos espec í ficos:

1.- Determinar cuantitativamente el crecimiento de hongos desde un cultivo de leche entera fluida y otro de harina de trigo.
2.-Clasificar morfológicamente las cepas de hongos obtenidos desde el cultivo de leche fluida entera y el de harina de trigo.
3.- Identificar colonias de hongos con potencial productor de aflatoxinas desde el cultivo en leche fluida entera y el de harina de trigo.

4. Variables de estudio:

4.1 Carga de hongos mesófilos totales:

(variable cuantitativa discreta de razón) Definición conceptual: Cantidad de hongos por gramo o centímetro cubico de muestra de alimento.

4.2 Colonias de hongos: ( variable cualitativa nominal)

Definición conceptual: Clon de células suficientemente numeroso como para que sea visible en medio sólido (34).

4.3 Crecimiento de colonias de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en cultivo de leche fluida entera y harina de trigo: (variable cuantitativa continua de razón) Definición conceptual: Incremento simultaneo en masa celular y número de células, que sigue un curso definido, cuando este se detiene o no es uniforme e indefinido, cuando se observa el ritmo de avance del hongo de manera constante (35).

5. Operalizaci ó n de las variables :

5.1 Carga de hongos mesófilos totales:

(variable cuantitativa discreta de razón) Definición operacional: Valor numérico que resulta de la medición de recuento de colonias de hongos. El valor se expresa acompañado por una unidad de medida denominada como UFC/g.

5.2 Colonias de hongos: ( variable cualitativa nominal)

Definición operacional: Observar y clasificar las colonias según sus diferencias morfológicas 5.3 Crecimiento de colonias de hongos con potencial productor de aflatoxinas, en cultivo de leche fluida entera y harina de trigo: (variable cuantitativa continua de razón)

Definición operacional: Identificar colonias de hongos, con potencial aflatoxinogeno, mediante la ausencia o presencia de coloración fluorescente en torno a estas, bajo exposición a luz ultravioleta.

CAPITULO III: Marco Metodol ó gico.

1. Dise ñ o metodol ó gico

1.1 Tipo de Estudio.

Esta investigación presenta un enfoque cuantitativo , con un diseño observacional, con dimensión temporal transversal. El diseño de esta investigación es observacional, ya que, durante la investigación no se intervino en los resultados, si no que se definió mantenerse al margen del desarrollo de estos acontecimientos, no pretendiendo cambiar ninguna de las características presentes en las variables.

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