Trans gerichtete Interaktionen von Neurexinen mit dem amyloiden Vorläuferprotein

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Morbus Alzheimer
1.2 Die Pathogenität von APP, die Entstehung des Aβ-Peptids
1.3 Die APP Genfamilie
1.4 Die Dimerisierung der Mitglieder der APP Genfamilie
1.5 Synaptische Adhäsionsmoleküle (SAMs)
1.6 Das synaptische Adhäsionsprotein Neurexin
1.7 Ziel der Studie

2.Material
2.1 Chemikalien & Reagenzien
2.2 Puffer, Lösungen & Kulturmedien
2.2.1 4 x SDS Probenpuffer + DTT
2.2.2 10 x PBS (Phosphate buffered saline)
2.2.3 Lysepuffer
2.2.4 10 x SDS Tris/Glycin Gel Laufpuffer
2.2.5 10 x TBST (Tris buffered saline Tween)
2.2.6 10 x TBS (Tris buffered saline)
2.2.7 10 x Transferpuffer
2.2.8 Eqiulibrierungspuffer (pH 7,2)
2.2.9 1 x Elutionspuffer (pH 2,5)
2.2.10 5 x Bindepuffer (pH 7,4)
2.2.11 1 x Waschpuffer (pH 7,5)
2.2.12 Präparationspuffer
2.2.13 Waschpuffer B
2.2.14 Entfärbelösung/Fixierlösung
2.2.15 Natriumthiosulfatlösung
2.2.16 Silbernitratlösung
2.2.17 Entwicklerlösung
2.2.18 Entwicklerstopplösung
2.2.19 HEPES Puffer (pH 7,2)
2.2.20 Coomassie Färbelösung
2.3 Kulturmedien
2.3.1 HEK Kulturmedium
2.3.2 COS 7 Kulturmedium
2.3.3 COS 7 Konditionierungsmedium
2.3.4 Neuronenmedium
2.3.5 Einfriermedium
2.3.6 Luria Bertani-Medium (LB-Medium)
2.3.7 LB Agarplatten für E. coli Stamm XL1-Blue Bakterienstamm
2.3.8 APP-Fc Medium
2.4 Antikörper/ Sepharose / Plasmide
2.5 Geräte
2.6 Kits
2.7 Software und Hardware
2.8 Bakterienstämme/ Zelllinien/ Mauslinie
2.9 Säulen
2.10 Verbrauchsmaterialien

3.Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Gießen von LB Agar Platten mit Antibiotikum
3.1.2 Re-Transformation kompetenter XL1 Blue E. coli Bakterien
3.1.3 Herstellung einer Vorkultur
3.1.4 Herstellung einer Flüssigkultur
3.1.5 DNS Isolation durch Maxi Präparation
3.2 Zellkulturmethoden
3.2.1 Einfrieren von Zellen
3.2.2 Auftauen von Zellen
3.2.3 Passagieren von Zellen
3.2.4 Aussäen von Zellen
3.2.5 transiente Transfektion mit jetPrime Reagenz
3.2.6 Generierung eines stabil Neurexin1β AS4- Fc exprimierenden Einzelklons
3.2.7 Konditionierung von Medium der stabilen COS7 Zelllinie Neurexin 1β AS4- Fc für eine
Proteinaufreinigung
3.3 Proteinbiochemische Methoden
3.3.1 Immuncytochemie (ICC)
3.3.2 Auswertung der Immuncytochemie
3.3.3 Trans Co-Immunopräzipitation (Trans Co IP)
3.3.4 Proteinbestimmung mit einem Bicinchoninsäure (BCA)- Assay
3.3.5 Herstellung eines 8 % Tris Glycin Gels
3.3.6 SDS-Gelelektrophorese
3.3.7 Western blot und Immunodetektion
3.3.8 Proteinaufreinigung mit einer Protein A Sepharose Säule
3.3.9 Coomassie Färbung
3.3.10 Silbergelfärbung
3.3.11 Bead aggregation assay

4.Ergebnisse
4.1 Test der Spezifität eines α-Neurexin 1β Antikörpers
4.2 Generierung eines hoch exprimierenden stabil transfizierten COS7 Neurexin 1β AS4- Fc Einzelklons
4.3 Proteinaufreinigung des Fusionsproteins Neurexin1β AS4- Fc mittels Affinitätschromatographie (Protein A Säule)
4.3.1 Erste Proteinaufreinigung von Neurexin 1β AS4- Fc
4.3.2 Zweite Proteinaufreinigung von Neurexin 1β AS4- Fc
4.4 Konditioniertes Medium von COS7 Zellen hat keinen Einfluss auf die trans Dimerisierung von Neurexin 1β AS4
4.5 Trans -Co Immunopräzipitation von Volllängen APP mit Neurexin1b AS4-/+ und Neurexin1a AS4
4.6 Immuncytochemische Untersuchung der synaptischen Lokalisation von APP

5. Diskussion
5.1 Ein Antikörper für die Detektion von Neurexin1b
5.2 Selektion eines Neurexin1b AS4- Fc exprimierenden Einzelklons
5.3 Die Proteinaufreinigung
5.4 Neurexin 1β AS4- Fc kann sekretiertes APP binden
5.5. APP bindet weitere Neurexin Isoformen
5.6 APP ist in exzitatorischen Synapsen stärker exprimiert als in inhibitorischen

6. Zusammenfassung

7. Summary

8. Literaturverzeichnis

9. Anhang
9.1 Neuroligin Antikörpertest
9.2 Vektorkarte Fusionsprotein Neurexin 1β AS4- Fc
9.3 Aminosäuresequenz Fusionsprotein Neurexin 1β AS4- Fc:
9.4 Abkürzungsverzeichnis
9.5 Aminosäuren
9.6 Abbildungsverzeichnis
9.7 Tabe11enverzeichnis

10.Danksagung

1. Einleitung

1.1 Morbus Alzheimer

Im Jahre 1907, beschrieb der Deutsche Psychiater und Neuropathologe Alois Alzheimer (gest. 1915) in einer psychiatrischen Einrichtung die Untersuchungen einer Frau im Alter von 51 Jahren, Auguste Deter, die sich auffällig verhielt. Ihm fielen bei ihr Anzeichen von Gedächtnisverlust auf (Stelzmann, Norman Schnitzlein, & Reed Murtagh, 1995). Er beschrieb Sie als desorientiert, launisch und oft verstand sie die Fragen, die ihr gestellt wurden nicht. Mit der Zeit veränderte sich ihre Persönlichkeit stark. Zudem entwickelte sie auditorische Halluzinationen (Stelzmann et al., 1995). Weiterhin zeigte sie sprachliche und schriftliche Schwierigkeiten. 4 ½ Jahre später starb sie an den Folgen der Erkrankung (Stelzmann et al., 1995). Die Krankheit äußerte sich in einer progressiven Demenz mit genereller corticaler Atrophie. Makroskopisch anatomisch fiel ihm das reduzierte Hirngewebe auf mit zusätzlich geweiteten Sulci und reduzierten Gyri (Stelzmann et al., 1995). Heute weiß man, dass die Pathologie der Erkrankung im Wesentlichen auf zwei Proteine im zentralen Nervensystem (ZNS) zurückzuführen ist. Zum einen das Tau Protein, das an der Stabilisierung von Mikrotubuli beteiligt ist. Im gesunden Gehirn haben die Mikrotubuli die Funktion, die Zelle mit den notwendigen Assimilationsedukten zu versorgen und deren Produkte zu entsorgen. Dieses Protein ist im erkrankten Alzheimergehirn hyperphosphoryliert. Dadurch wird das Tau Protein instabil, was darin resultiert, dass auch die Mikrotubuli destabilisiert werden (Goedert & Spillantini, 2006). Das zweite Protein, das an der Alzheimerpathologie beteiligt ist, ist das amyloide Vorläuferprotein (amyloid precursor protein APP). APP wird im amyloidogenen Weg von der γ-Sekretase so prozessiert, dass bei der Spaltung ein Fragment von 40 bzw. 42 Aminosäuren entsteht, das Aβ40/42 (Eggert, Thomas, Kins, & Hermey, 2017). Das extrazelluläre Fragment akkumuliert im Laufe des Lebens und bildet die pathogenen amyloiden Plaques (Eggert et al., 2017). Die Anreicherung kann schon 30 Jahre vor den ersten Symptomen auftreten (Goedert & Spillantini, 2006). Die altersbedingte Form der Alzheimer Erkrankung ist eine der bekanntesten neurodegenerativen Erkrankungen weltweit. Jedes Jahr erkranken Millionen Menschen an der Krankheit (Brookmeyer, Johnson, Ziegler-Graham, & Arrighi, 2007). Die Anreicherung beginnt zunächst im Neocortex, wodurch sich der Gedächtnisverlust erklären lässt.

1.2 Die Pathogenität von APP, die Entstehung des Aβ-Peptids

APP wird nach seiner Synthese auf zwei verschiedene Arten prozessiert. Bei dem ersten Weg wird APP durch die α-Sekretase in das lösliche sAPPα (soluble APP α) und das membranständige 83 Aminosäuren lange C-terminale Fragment (CTF83) gespalten (Eggert et al., 2017). Daraufhin folgt die regulated intramembrane proteolysis (RIP). Bei diesem Prozess spaltet die γ-Sekretase das CTF83, sodass die APP intrazelluläre Domäne (AICD) entsteht, welche als Transkriptionsfaktor fungieren kann (McLoughlin & Miller, 2008). Zudem wird ein weiteres Peptid (p3) gebildet, welches exozytiert wird (Eggert, 2017). Dieser Prozessierungsweg wird nicht amyloidogener Weg genannt und ist der nicht pathogene Weg der APP Prozessierung. Aβ Fragmente entstehen beim amyloidogenen Weg, welche im Gehirn von Alzheimer Patienten akkumulieren. Zunächst wird APP von der β-Sekretase N-terminal gespalten. Dabei entsteht das sekretierte sAPPβ (soluble APPβ) und ein membranständiges C-terminales Fragment aus 99 Aminosäuren (C99) (Eggert, 2017). Nach Entfernung der Ektodomäne kann die γ- Sekretase das C-terminale Fragment (C99) schneiden und es entsteht eine AICD und zusätzlich das sekretierte Aβ40/42. Über die Jahre kann sich dieses Aβ Peptid im Gehirn anhäufen und Aggregate bilden, die in erkrankten Alzheimergehirnen zu finden sind (Renziehausen et al., 2015).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Prozessierungsschema des Amyloiden Vorläuferproteins. Auf der rechten Seite ist der pathogene amyloidogene Weg abgebildet. Dieser Prozessierungsweg bildet das Aβ40/42 und ist mitverantwortlich an der Alzheimer Erkrankung. Im nicht amyloidogenen Weg spaltet die α-Sekretase APP in sAPPα (soluble APP α) und in die CTF83 (C-terminales Fragment 83) Komponente. Daraufhin schneidet die γ-Sekretase das CTF83 in der r egulated intramembrane proteolysis (RIP) in eine APP intracellular domain (AICD) und ein Peptid (p3), welches exozytiert wird. Beim amyloidogenen Weg wird APP durch die β-Sekretase in sAPPβ (soluble APPβ) und in ein C-terminales Fragment 99 (CTF 99) gespalten. Die γ-Sekretase spaltet dann CTF99 in die AICD und in das pathogene Aβ40/42 (Eggert et al., 2017).

1.3 Die APP Genfamilie

Das Typ I Transmembranprotein APP ist ein Protein, das ubiquitär exprimiert wird. Das auf dem Chromosom 21 liegende Protein besitzt unterschiedliche Spleißvarianten und wird an seinen 19 Exonen an Stelle 7/8/15 so gespleißt, dass 8 Isoformen entstehen können (Tanzi, 2012). Die häufigsten APP Formen sind APP 695/751/770. Dabei beschreibt die Zahl hinter dem APP die Anzahl der Aminosäuren, aus denen sich das Protein zusammensetzt (Sandbrink, Masters, & Beyreuther, 1996). APP zeigt ein apparentes Molekulargewicht von 110-130 kDa, was auf die verschiedenen posttranslationalen Modifikationen zurückzuführen ist. Zur APP Genfamilie gehören zwei weitere Mitglieder, die Amyloiden Vorläufer Ähnlichen Proteine 1 and 2 (amyloid precursor like proteins APLP1 and 2). Dabei ist auch APLP2 in allen Zellen zu finden (Wasco et al., 1993), wohingegen APLP1 nur im ZNS lokalisiert ist (Lorent et al., 1995). APP ist jedoch das einzige Mitglied der APP Genfamilie, das die Aβ- Domäne enthält (Müller, Deller, & Korte, 2017). Sowohl für APP, APLP1 als auch für APLP2 wird die extrazelluläre Domäne in eine E1 bzw. E2 Domäne unterteilt. Auf die E1 Domäne folgt eine säurereiche Region (AC), welche hauptsächlich aus Aspartat und Glutamat besteht (Baumkötter, Wagner, Eggert, Wild, & Kins, 2012). Dabei besitzt die E1 Subdomäne eine Wachstumsfaktor ähnliche Domäne (growth factor like domain GFLD) mit einer Heparinbindestelle und eine Kupferbindedomäne (copper binding domain CuBD). Bei bestimmten Spleißformen von APP und APLP2 schließt sich eine Kunitz-Protease- Inhibitor Domäne (KPI) an die säurereiche Region an (C.Müller, 2014).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Strukturschema von APP/APLP1/APLP2. Die APP Genfamilie besitzt eine große extrazelluläre und eine kleinere C-Terminale Domäne, deren YENPTY Motiv sich im Intrazellularraum befindet. Das YENPTY Motiv dient der Clathrin vermittelten Endozytose von APP. Zu sehen ist auch, dass nur APP die Aβ Sequenz besitzt. Die E1 Domäne ist für die Dimerisierungseigenschaft von APP verantwortlich (C.Müller, 2014).

1.4 Die Dimerisierung der Mitglieder der APP Genfamilie

Die Dimerisierung von APP wird durch seine E1- Domäne vermittelt und führt zu cis/trans Interaktionen des Proteins. Dabei kann dies Heparin abhängig erfolgen (Baumkötter et al., 2012). Die cis- Interaktionen haben einen Effekt auf die Prozessierung von APP und damit auch auf die Aβ Produktion (Baumkötter et al., 2012; Eggert et al., 2009),

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Dimerisierungsverhalten von APP. Rechts ist die trans -Interaktion zwischen zwei APP Molekülen links ist die cis -Interaktion abgebildet. Die Interaktion wird durch die E1 Domäne vermittelt (Soba et al., 2005).

Die trans -Dimerisierung hingegen ist eine Interaktion von Proteinen zwischen zwei benachbarten Zellen, sodass Prozesse möglich sind, die an der Zell-Zell Adhäsion oder auch an der Synaptogenese mitwirken (Baumkötter et al., 2012). Es sind sowohl Homo- als auch Heterointeraktionen mit seinen homologen APLP1/2 bekannt (Soba und Kins, 2005). Bisher wurden unterschiedliche physiologische Funktionen für die cis - and trans Dimerisierung der APP/APLPs postuliert. Es wurde gezeigt, dass sowohl cis homo-Dimere von APP (Eggert et al., 2018, 2009) als auch t rans hetero-Dimere von APP mit den APP Homologen APLP1 oder APLP2 (Kaden et al., 2009) die Ab Produktion beeinflussen. Die APP cis -Dimerisierung führt zu Veränderungen der APP Lokalisation (Eggert et al., 2018). Dies kommt wahrscheinlich durch Veränderungen der APP Interaktion mit LRP1 und einem verminderten retrograden Transport mit SorLA zustande (Eggert et al., 2018). LRP1 und SorLA sind beide Risikofaktoren der Alzheimer Krankheit (Eggert et al., 2018, 2017; Kang et al., 2000; Schmidt, Subkhangulova, & Willnow, 2017). Die trans -Dimerisierung von APP dagegen verstärkt die Zell-Zell Adhäsion (Schilling et al., 2017; Soba et al., 2005; Stahl et al., 2014; Wang et al., 2009). In einem co- Kultur Versuch mit APP transfizierten HEK Zellen und Maus Primärneuronen konnte gezeigt werden, dass APP die Bildung von Präsynapsen induziert (Schilling et al., 2017; Stahl et al., 2014; Wang et al., 2009). Dies zeigt, dass APP als synaptisches Adhäsionsprotein (SAM) fungieren kann (Siddiqui & Craig, 2012). Daher können weitere Untersuchungen der trans -Dimerisierung von APP wichtig für die Aufklärung der molekularen Mechanismen der Alzheimer Krankheit sein.

1.5 Synaptische Adhäsionsmoleküle (SAMs)

Die kleinste funktionelle Einheit des ZNS sind die Synapsen (Sweatt, 2016). Die über 100 Milliarden Neurone bilden untereinander, mithilfe der synaptischen Verbindungen mehr als 100 Billionen Verknüpfungsstellen (Bailey, Kandel, & Harris, 2015). Die molekularen Vorgänge spielen sich dabei in dem 12-20 nm breiten synaptischen Spalt ab (Savtchenko & Rusakov, 2007). Hier sind eine Vielzahl an Molekülen lokalisiert, die an der Entwicklung und Differenzierung der Neurone mitwirken (Rudenko, 2017). Eine große Gruppe solcher Moleküle sind die synaptischen Adhäsionsmoleküle (synaptic adhesion molecules SAMs). Zurzeit sind im Menschen rund 490 SAMs bekannt (Zhong, Drgonova, Li, Uhl, & Medicine, 2016). Drei Interaktionsmöglichkeiten solcher Proteine sind beschrieben (Rudenko, 2017). Zunächst die trans gerichtete Interaktion, bei der sich die extrazelluläre Domäne des Proteins über den synaptischen Spalt spannt, um mit seinem Partner eine adhäsive Interaktion einzugehen. Dabei kann diese Interaktion einer Neuron-Neuron Erkennung dienen oder auch Signaltransduktionsprozesse einleiten (Rudenko, 2017). Diese wiederum aktivieren dann Prozesse, die dafür sorgen, dass Neurone weitere Neuriten bilden, Synapsen entstehen, Synapsen stabilisiert und auch degradiert werden (Yin & Yuan, 2015). Neurone und damit auch die synaptischen Verbindungen sind ein plastisches System, das auf die Reize, die von der Umwelt wahrgenommen werden sensibel reagiert (Sweatt, 2016). Beispielsweise führt eine Morphinbehandlung dazu, dass von 175 getesteten SAMs lediglich 30 die Behandlung überstehen (Abul-Husn et al., 2011). Astrozyten spielen eine wichtige Rolle bei der synaptischen Plastizität. Bspw. sorgt das Sekretionsprodukt TSP1 dafür, dass das synaptische Adhäsionsmolekül Neuroligin eine katalytische Wirkung erfährt und es zur beschleunigten Synapsenbildung kommt (Christopherson et al., 2005). Die SAMs wirken so an der Hoch- bzw. Herunterregulierung der synaptischen Aktivität mit. Dies lässt sich an der Langzeitpotenzierung (long term potentiation LTP) bzw. Langzeitdepression (long term depression LTD) beobachten. Nach Eintritt dieser Ereignisse ist die Neuroligin 1/3 Konzentration in den Synapsen erhöht (bei LTP) bzw. erniedrigt (bei LTD) (Whellan et al., 2013). Da die LTP Induktion einen höheren Ca2+ Einstrom bedingt (Martinez & Derrick, 1996), und es dadurch zur Transkription weiterer SAMs wie Leucin reiche wiederholende Transmembranproteine (leucine rich repeat transmembrane proteins LRRTMs) kommt (Rudenko, 2017), bedingen SAMs indirekt die Synthese weiterer SAMs. Die Stabilität der Synapsen wird auch durch die Aktivität verstärkt. Zum Beispiel wird das Adhäsionsmolekül Neurexin1β bei erhöhter Aktivität verstärkt gebildet. Die darauffolgende Interaktion mit Neuroligin sorgt dann wiederum für eine verstärkte Synapsenbildung. Die verschiedenen Varianten von Proteinen ermöglichen eine große Bandbreite an Interaktionsmöglichkeiten. So sind Homo- (mit sich selbst) Semihomo- (mit Mitgliedern

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Schematiscbe Darstellung der Interaktion von Neurexin und Neuroligin und beteiligte intrazellulire ProteiDe. Neurexin und Neuroligin sin die am besten untersuchten synaptischen Adhasionsmolekiile. Hier ist die Intera.ktion gezeigt und auch die Bindung des Neurexin p Dystroglycan, was weitere lntera.ktionen initiieren kann (Yamagata et al. 2003).

derselben Proteinfamilie) oder auch Heterointeraktionen (mit anderen SAMs) moglich (Rudenko, 2017). Dabei verwenden die Proteine verschiedene aktive Domanen wie Immunglobuline, Fibronectine oder auch Leucin reiche Regionen (Rudenk:o, 2017). Ober eine weitere Moglichkeit der Bindung verfiigen die SAMs mit ihrem zytoplasmatischen Teil. Damit konnen sie an Rezeptoren und KanaJ.e binden und diese so in die Plasmamembran der Synapsen integrieren (Rudenko, 2017). Somit kann das Proteinnetzwerk der Synapse verindert werden. Als letzte Interaktion ist die cis-Interaktion zwischen zwei SAMs moglich. Das bedeutet, dass zwei Molekiile derselben Synapse miteinander interagieren, wodurch ein Priikomplex entsteht, der dann von einem dritten Interaktionspartner gebunden werden kann, urn wieder einen trans-Interaktionskomplex zu formen. Zum Beispiel die Bindung von MAM Dominen beinhaltenden GPI Anker Proteinen (MAM domain containing GPI ancor proteins MDGA1) zu Neuroligin 2 (K.. Lee et al., 2013), dass die Entwicklung der inhibitorischen Synapsen reguliert, verhindert die Bindung an Neurexin, wodurch inhibitorische Synapsen abgebaut werden (K. Lee et al., 2013). Die Vielzahl an SAMs und ihre Prozessierungsmoglichkeiten erlauben es dieser Gruppe von Zellmolekiilen, Neurone aufunterschiedlichste Art zu beeinflussen (Rudenko, 2017). Das Fehlen von SAMs, durch Mutationen fiihrt dazu, dass Menschen an Krankheiten wie Autismus (Bourgeron, 2016) oder Schizophrenie (Xiwei Zheng, Cong Bi, Marissa Brooks, 2015) leiden. Deshalb ist es wichtig zu verstehen, wie diese Molekiile funktionieren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Prozesse an der Synapse. In 1 alb ist die Lokalisation bzw. die Synthese der SAMs abgebildet. lc zeigt die Degradierung eines SAM bspw. nach liingerer Inaktivitiit eines Neurons.In 2 und 3 sind trans orientierte Protein-Protein Interaktionen dargestellt. 4 beschreibt die Positionierung innerhalb des synaptischen Spaltes. 5 stellt die Kontrolle der SAMs durch Sekretionsprodu.kte von Astrozyten dar (Rudenko et al. 2013).

1.6 Das synaptische Adhasionsprotein Neurexin

Das Adhasionsmolekill Neurexin besitzt insgesamt drei unterschiedliche Gene NRXN 1/2/3 (Tabuchi & Siidhof, 2002) mit zwei Promotoren, die unabhangig voneinander agieren, sodass zwei Varianten entstehen. Neurexin-a, das ein Molekulargewicht zwischen ca. 160-200 kDa aufweist und dem Neurexin-p, das ein Molekulargewicht zwischen ca. 60-100 kDa zeigt (Kim et al., 2008; Reissner, Runkel, & Missler, 2013). Dabei besitzen die unterschiedlichen Neurexine in der Maus sowie im Menschen unterschiedliche Genloci.

Tabelle 1:Neurexln Genlocl und GengroBe.Chr= Chromosom,AS= Aminosauren,Mbp= Megabasenpaare (Reissner 2013).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Vertebraten besitzen fiinfkonservierte Spleillregionen (alternative spliceside AS) (Reissner et al., 2013). Dabei beinhaltet das a-Neurexin die AS#1-5 und das P-Neurexin die AS#4 & 5. Daher konnen aus den drei Neurexin Genen insgesamt 3908 mogliche Neurexin Spleif3varianten entstehen (Reissner et al., 2013). Die Diversitiit fillrrt zum Schluss, dass Neurexin eine groBe Bandbreite an neuromodulatorischen Aufgaben an der Synapse besitzt, da auch die verschiedenen lsoformen unterschiedliche funktionelle Gruppen besitzen. So haben die a-Neurexine sechs Laminin Neurexin Geschlechtshormon bindende Globulin Domiinen (laminin neurexin sex hormon binding globulin LNS). Dazwischen befinden sich drei epidermale Wachstumsfaktor iihnliche Domiinen. Die P-Neurexine

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Schematische Darstellung der SpleiDsteUen und Dominen von Neurexinl-a und Neurexinl­ β. Abgebildet sind die verschiedenen LNS-Domii.nen die EGF Domii.nen und die Glykosylierungstellen. Zu sehen ist, dass die P-Variante nur eine LNS Domii.ne und die SpleiBstellen 4 und 5 besitzt. Im Gegensatz dazu hat die α.-Variante 6 LNS-Domii.nen und besitzt 5 Spleillstellen (Reissner et al. 2013). TabeUe 2:lnteraldionspartner der Neurexine. Zu sehen sind die jeweiligen Bindungsstellen, die benotigten Spleillstellen fiir die Bindung und ob die Bindung Ca2+ abhlingig ist oder nicht (+ = abhiingig I-= unabhlingig).

Tabelle 2:lntenktionspartner der Neurexine. Zu sehen sind die jeweiligen Bindungsstellen, die benotigten Splei.Bstellen fiir die Bindung und ob die Bindung Ca2 abhingig ist oder ni.cht (+ =abhangig /- =unabhingig)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

haben denselben C-tenninus wie aLNS6, aber besitzen cine einzigartige 37 Histidin Wiederholung (Reissner et al., 2013).Dorch mannigfaltige Umstrukturierung Jronnen Neurexine an Neuroligine biDden (Chanda, Hale, Zhang, Wemig, & Siidhof, 2017), und wirken so an der Synaptogenese und Spezifizierung von Synapsen mit (Boucard et al., 2005). Die Interaktion von postsynaptischem

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

AbbDdung 7: Sehematische Dantellung der Neurexln Lokallllatton ond der Blndung zu potenzlellen lnteraktiooagspartnern.Zu sehen sind einige Proteine,die mit Neurexin interagi.erenundso neuromodulatorische Prozesse initiieren. Es wird ebenfalls gezeigt, dass Neurexin mit anderenProteinen im Intrazellularraum interagiert urn an der Rekrutierung Proteinen an Synapsen mitzuwirk:en. AuBerdem bildet Neurexin bier einen Priikomplex mit a-Dystroglycan urn dann weitere Proteine zu binden die wiederum weitere Signaltransduktionsprozesse einleiten kfumen (Rudenko et al. 2017).

Neuroligin mit präsynaptischen Neurexin-α führt zur Synapsenvergrößerung, wohingegen eine β- Neurexin Bindung in einer Synapsenbildung resultiert (Boucard et al., 2005). Die Bindung von Neurexinen erfolgt durch drei Domänen. Dazu zählt die αLNS2, die αLNS6, sowie die βLNS (Boucard et al., 2005). Die Bindungen können dabei Co-Faktor abhängig sein wie bspw. die Bindung an LRRTM2. Sie wird über ein Ca2+ abhängigen Mechanismus reguliert, der dafür sorgt, dass exzitatorische Synapsen gebildet werden (Ko, Fuccillo, Malenka, & Südhof, 2009). Als erstes entdeckt wurde α- Neurexin als Rezeptor für α-Latrotoxin, das nach seiner Bindung einen massiven Neurotransmitterausstoß zur Folge hat (Y. Ushkaryov, Petrenko, Geppert, & Sudhof, 1992). Diese Entdeckung führte zu der Annahme das Neurexine präsynaptisch lokalisiert sein müssen. Die Annahme wurde dann, mittels knock-out (KO) Experimenten bestätigt (Missler et al., 2003). Andere Studien konnten aber auch zeigen, dass eine kleine Population von Neurexinen an der Postsynapse lokalisiert ist (Kattenstroth, Tantalaki, Sudhof, Gottmann, & Missler, 2004). Die Neurexine besitzen je nach Isoform unterschiedliche spezifische Lokalisationen. So ist das Neurexin 1ß im Gegensatz zu seinen Homologen nur in corticalen Schichten 2 und 3, im Thalamus und in Teilen des Hippocampus zu finden (Püschel & Betz, 1995). Ein Ungleichgewicht von exzitatorischen zu inhibitorischen Strömen durch fehlerhafte Neurexin/Neuroligin Interaktionen ist mit neuropsychiatrischen Störungen, wie Autismus oder auch Schizophrenie assoziiert (Chanda et al., 2017; Ofer Yizhar 2009; Südhof,2008).

1.7 Ziel der Studie

APP ist ein Schlüsselprotein bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung (C.Müller, 2014). Die Bildung von Amyloiden Plaques resultiert in der Degeneration von Neuronen (Goedert & Spillantini, 2006) und sorgt dafür, dass wichtige kognitive Fähigkeiten verloren gehen (Goedert & Spillantini, 2006). Die Physiologie von APP ist bis heute noch nicht vollständig geklärt (Thinakaran & Koo, 2008). Das synaptische Adhäsionsmolekül APP ist an vielen Interaktionen beteiligt (Soba et al., 2005), ebenso wie die Familie der Neurexine (Reissner et al., 2013). APP kann über seine E1-Domäne mit sich und seinen Homologen in trans Orientierung dimerisieren (Soba et al., 2005) und interagiert auch mit Neuroligin und Neurexin (Meleux, 2016). Daher soll aufbauend auf den Ergebnissen von der Masterarbeit von Mathieu Meleux, die Interaktion zwischen dem Fusionsprotein Neurexin1β AS4- Fc, das stabil in COS7 exprimiert wird, und APP untersucht werden.

Hierzu soll aus einem Mischklon eine COS7 Einzelklon Zelllinie hergestellt und selektiert werden welche das Neurexin 1β AS4- Fc in möglichst hohen Mengen sekretiert. Dieses Neurexin 1β AS4- Fc besitzt statt der Transmembrandomäne und der C-terminalen Domäne die variable Region eines IgG Antikörpers (Fc tag). Über diesen tag soll das ins Medium sekretierte Neurexin 1β AS4- Fc in möglichst großen Mengen und großer Reinheit mittels einer Protein A Säule einer Äkta aufgereinigt werden. Das aufgereinigte Protein soll mittels Western Blot, Coomassie Färbung und Silberfärbung nachgewiesen werden. Das aufgereinigte Neurexin 1β AS4- Protein soll daraufhin an magnetische Protein A Sepharose gekoppelt werden und in einem bead aggregation assay getestet werden, ob APP die trans Dimerisierung von Neurexin induziert. Des Weiteren soll mit den Proben des bead aggregations assays die Bindung von Neurexin 1b AS4- an sekretiertes APP in einem Western Blot untersucht werden. Weiterhin soll eine trans Co-Immunopräzipitation in HEK293T Zellen durchgeführt werden, um zu sehen, ob Volllängen APP695 mit verschiedenen Neurexinen in trans Orientierung interagieren kann. Zusätzlich soll per Immuncytochemie an embryonalen Maus Primärneuronen die synaptische Lokalisation von APP untersucht werden.

2.Material

2.1 Chemikalien & Reagenzien

Tabelle 3. Verwendete Chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Puffer, Lösungen & Kulturmedien

Puffer immer im deionisiertem Wasser angesetzt.

2.2.1 4 x SDS Probenpuffer + DTT

- 0,25 M Tris/HCl (pH 6,8)
- 40 % (w/v) Glycerin
- 8 % (w/v) SDS
- 0,02 % (w/v) Bromphenolblau
- 10 % DTT

Zur Herstellung eines 2x Probenpuffers wurde der 4x Probenpuffer mit PBS 1:2 verdünnt.

2.2.2 10 x PBS (Phosphate buffered saline)

- 1,4 M NaCl
- 27 mM KCl
- 100 mM Na2HPO4
- 18 mM KH2PO4

pH 6,8

Für 1x PBS-Lösung wurde 10x PBS, 1:10 mit ddH2O verdünnt.

2.2.3 Lysepuffer

- 50 mM Tris/HCl (pH 7,5)
- 150 mM NaCl
-5 mM EDTA
- 1 % (w/v)

Vor der Zelllyse zuvor Protease Inhibitor mit „ complete“ (Roche) 1:25 zugeben.

2.2.4 10 x SDS Tris/Glycin Gel Laufpuffer

- 0,25 M Tris
- 1,92 M Glycin
- 1 % (w/v) SDS

2.2.5 10 x TBST (Tris buffered saline Tween)

- 0,1 M Tris/HCl (pH 8,0)
- 1,5 M NaCl
- 0,5% (w/v) Tween 20®

Für 1x TBST wird der 10 x Stock 1:10 mit ddH2O verdünnt.

2.2.6 10 x TBS (Tris buffered saline)

-0,1 M Tris/HCl (pH 8,0)
- 1,5 M NaCl

Für 1x TBS den 10 x Stock in ddH2O 1:10 verdünnen.

2.2.7 10 x Transferpuffer

-250 mM Tris
- 1,92 M Glycin
- 0,00125 % SDS

Für 1x Transferpuffer 1:10 mit ddH2O verdünnen und 20 % MeOH hinzugeben.

2.2.8 Eqiulibrierungspuffer (pH 7,2)

- 20 mM HEPES
- 150 mM NaCl

2.2.9 1 x Elutionspuffer (pH 2,5)

- 100 mM Glycin

2.2.10 5 x Bindepuffer (pH 7,4)

- 250 mM Tris/HCl
- 1500 mM NaCl

2.2.11 1 x Waschpuffer (pH 7,5)

- 10 mM Tris

2.2.12 Präparationspuffer

- HBSS
- 20 mM HEPES

2.2.13 Waschpuffer B

- 10 mM Tris/HCl (pH 7,5)
- 500 mM NaCl
- 0,2 % NP40
- 2 mM EDTA

2.2.14 Entfärbelösung/Fixierlösung

- 40 % MeOH
- 10 % Essigsäure
- ddH2O

2.2.15 Natriumthiosulfatlösung

- 0,02 % Natriumthiosulfat
- ddH2O

2.2.16 Silbernitratlösung

- 0,1 % Silbernitrat
- ddH2O

2.2.17 Entwicklerlösung

- 0,04 % Formaldehyd
- 2 % Natriumcarbonat
- ddH2O

2.2.18 Entwicklerstopplösung

- 5 % Essigsäure
- ddH2O

2.2.19 HEPES Puffer (pH 7,2)

- 20 mM HEPES
- 150 mM NaCl
- ddH2O

2.2.20 Coomassie Färbelösung

- 0,2 % Coomassie R250
- 50 % MeOH
- 10 % Essigsäure

2.3 Kulturmedien

2.3.1 HEK Kulturmedium

-DMEM

- 10 % FBS

- 1 % Penicillin/ Streptomycin

2.3.2 COS 7 Kulturmedium

- DMEM
- 10 % FBS
- 1 % Penicillin/ Streptomycin
- 1 % Geneticin G418

2.3.3 COS 7 Konditionierungsmedium

- DMEM
- 1% Penicillin / Streptomycin
- 1 % Geneticin G418

2.3.4 Neuronenmedium

- Neurobasal
- 2 % B27
- 25 mM Glutamat
- 200mM L-Glutamin

2.3.5 Einfriermedium

- DMEM
- 20 % FBS
- 10 % DMSO

2.3.6 Luria Bertani-Medium (LB-Medium)

- 0,5 % (w/v) NaCl
- 1 % Trypton
- 0,5 % (w/v) Hefeextrakt
- ddH2O

pH auf 7,0 mit NaOH einstellen. Zugabe von 100 mg/mL Ampicillin und 30µg/mL Kanamycin.

2.3.7 LB Agarplatten für E. coli Stamm XL1-Blue Bakterienstamm

- 1,4 % Agar (w/v)
- 1 % entsprechendes Antibiotikum
- LB-Medium

2.3.8 APP-Fc Medium

- DMEM
- 1% Penicillin/Streptomycin
- 1% Hygromycin

2.4 Antikörper/ Sepharose / Plasmide

Tabelle 4: Primärantikörper

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 5: Sekundärantikörper

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 6: Sepharosen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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