Efecto del péptido β‐amiloide(25‐35) sobre la expresión génica de receptores glutamatérgicos en rodajas de hipocampo de rata

Índice

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Enfermedad de Alzheimer
1.2. Regiones cerebrales afectadas en la Enfermedad de
Alzheimer
1.2.1. Hipocampo
1.2.1.1. Circuito intrahipocampal
1.2.1.2. Conexiones aferentes
1.2.1.3. Conexiones eferentes
1.2.2. Neurotransmisión glutamatérgica en el hipocampo
1.3. Mecanismos moleculares de la neurodegeneración en laEnfermedad de Alzheimer
1.3.1. Alteración de la función sináptica en los estadíos tempranos de
la Enfermedad de Alzheimer
1.3.2. Péptido β-amiloide
1.3.3. Oligómeros de β-amiloide
1.3.4. Péptido β-amiloide(25-35)
1.4. Neurotoxicidad del β-amiloide
1.4.1. Alteración de la neurotransmisión glutamatérgica
1.4.2. Efectos del β-amiloide sobre la función del hipocampo

2. PLANTEAMIENTO GENERAL Y OBJETIVOS

3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Obtención de muestras de tejido nervioso hipocampal
3.1.1. Animales de experimentación
3.1.2. Aislamiento del cerebro
3.1.2.1. Soluciones de perfusión
3.1.3. Obtención de las rodajas de hipocampo
3.1.4. Preincubación
3.1.5. Incubación de las rodajas de hipocampo con el péptido Aβ(25-35)
3.2. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa (qPCR)
3.2.1 Extracción y purificación del RNA total
3.2.2. Síntesis de cDNA a partir del RNA total
3.2.3. PCR cuantitativa en tiempo real
3.3. Análisis estadístico de los datos

4. RESULTADOS
4.1. Análisis de la calidad del RNA total
4.2. Cuantificación relativa de la expresión génica de subunidades de receptores glutamatérgicos mediante qPCR
4.2.1. Optimización de las qPCR: Selección de cebadores
4.2.2. Cuantificación relativa de subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos

5. DISCUSIÓN
5.1. Efecto del péptido β-amiloide en la integridad del RNAm
5.2. Efecto del péptido β-amiloide sobre la expresión génica de receptores ionotrópicos de glutamato
5.2.1. Expresión desubunidades de receptores AMPA
5.2.2. Expresión de subunidades de receptores NMDA
5.3. Limitaciones del estudio
5.4. Perspectivas futuras

6. RESUMEN Y CONCLUSIONES

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Agradecimientos

A l Dr. Francisco Vives por haber sido tan amable conmigo, gracias a él me puse en contacto con el Dr. Juan de Dios Navarro y la Dra. Lydia Jiménez. Sin ese pequeño acto, nada de esto hubiera sido posible.

A Juande y a Lydia, por haberme dado esta gran oportunidad y haber confiado en mí. Por compartir conmigo la ilusión de comenzar un nuevo proyecto, por enseñarme tantas y tantas cosas, por darme su apoyo en mis momentos de crisis y por ayudarme en todo lo que han podido y en un poco más.

Con ellos he descubierto que la electrofisiología y la biología molecular hacen un equipo perfecto.

A l Dr. Javier Yajeya de la Universidad de Salamanca, por su grandísima generosidad. Y a Mauricio Nava, también de la Universidad de Salamanca, por su gran ayuda con la anatomía del hipocampo.

A mis compis de piso, Bea, Marina y Cristina, por ver que soy una “casper” y aun así seguir intentando relacionarse conmigo. Y especialmente a mi Cuca, por ser tan maja y haberme prestado un poco de su tiempo para contribuir un poquito a este proyecto.

A Oti, a Majo y a Miguel por esas tardes tan buenas de cafés después de clase. Conoceros ha sido genial. Oti, gracias por tu apoyo moral en estos días.

A mi familia, que creo que según van pasando los años y me voy especializando más, ellos tienen menos idea de a qué me dedico. Gracias por escuchar todas las cosas “raras” que os cuento y seguir preguntándome: ¿pero tú qué hacías?, me encanta. Sin vuestro apoyo todo esto no saldría adelante.

A Bernardo, simplemente por todo (“sin ti no soy nada, una gota de lluvia mojando mi cara…”).

1. INTRODUCCION

1.1. Enfermedad de Alzheimer

Las demencias representan un problema epidemiológico de escala mundial debido al grado de envejecimiento de la población. De todos los tipos de demencias descritas hasta la fecha, la enfermedad de Alzheimer (EA) es la más frecuente, representando entre el 50-60% de todos los casos. Según el informe del año 2009 de la Alzheimerʹs disease International, se ha estimado que en 2010 habría 35.6 millones de personas diagnosticadas de demencia, y se prevé que esta cifra se duplicará en 20 años, siendo de 65.7 millones en el año 2030.

La patología de la EA fue descrita por primera vez por Alois Alzheimer en 1907. En secciones teñidas de cerebro post mortem de sus pacientes identificó los dos marcadores de la EA: Placas seniles extracelulares y ovillos neurofibrilares intracelulares. Posteriormente, se identificaron los componentes de estas estructuras histológicas determinándose que las placas seniles estaban formadas por la acumulación de péptido β-amiloide (Aβ) y los ovillos neurofibrilares por la proteína Tau asociada a microtúbulos. Actualmente, éstos siguen siendo los principales marcadores patológicos post mortem de determinación del diagnóstico de EA (Selkoe, 2001).

La EA es una enfermedad neurodegenerativa, crónica y progresiva, que produce alteraciones de la memoria y otros déficits cognitivos. La edad de aparición es heterogénea. Atendiendo a este parámetro la enfermedad se puede clasificar en EA de aparición temprana y de aparición tardía. La EA de aparición temprana es menos frecuente, y se muestra antes de los 60-65 años. Presenta herencia autosómica dominante, y también se le denomina EA familiar. La EA de aparición tardía, se manifiesta después de los 65 años, pero el proceso degenerativo empieza posiblemente 20-30 años antes del inicio clínico de la enfermedad (Borroni et al., 2006). Esta es la forma más común y es de causa desconocida, aunque posiblemente estén implicados factores genéticos y ambientales (Blennow et al., 2006).

Desde el punto de vista clínico la EA se caracteriza por una serie de alteraciones cognitivas como trastornos en el lenguaje, en la percepción, en la orientación y en la memoria (McKhann et al., 1984). En los estadíos tempranos de la EA las alteraciones en la memoria son sutiles, viéndose afectada la capacidad de recordar pequeños acontecimientos de la vida diaria. Sin embargo, en los estadíos finales, los sujetos muestran una incapacidad total y generalmente la muerte es causada por otras enfermedades (Walsh and Selkoe, 2004).

Existen varias hipótesis que intentan explicar los mecanismos subyacentes a los déficits cognitivos y a la neurodegeneración en la EA. Actualmente se cree que el péptido Aβ es el principal responsable de la cascada de eventos que desencadenan estos procesos.

1.2. Regiones cerebrales afectadas en la Enfermedad de Alzheimer

La EA se caracteriza por anomalías cerebrales que afectan de forma selectiva a regiones específicas, como la neocorteza, el área entorrinal, el hipocampo, el núcleo amigdalino, el núcleo basal, el tálamo anterior y varios núcleos monoaminérgicos del tronco del encéfalo (el locus ceruleus y complejo del rafe).

La distribución y la expansión de esas anomalías siguen patrones característicos, que son específicos de área e incluso de célula. Por ejemplo, en el hipocampo, degeneran neuronas piramidales de las regiones CA1 y CA2.

Las anomalías en la corteza entorrinal, el hipocampo y otros circuitos de la corteza temporal interna se consideran factores decisivos para la pérdida de la memoria en la EA. No obstante, las alteraciones en la memoria y la falta de atención también podrían estar relacionadas con anomalías en otras áreas como las áreas de asociación de la neocorteza, que se consideran relacionadas con alteraciones de los sistemas colinérgicos del proséncefalo basal (Milner et al., 1998).

1.2.1 Hipocampo

El hipocampo forma parte de lo que se conoce como formación hipocampal, compuesta adicionalmente por el giro dentado y el subículo. A su vez la formación hipocampal, es un componente del sistema límbico y tiene un papel muy relevante en los procesos de memoria declarativa o explícita, asicomo en la consolidación de la memoria de corto a largo plazo. A continuación se abordarán en profundidad algunas características sobre su conectividad y función (Fig. 1).

1.2.1.1. Circuito intrahipocampal

El hipocampo está formado por una capa de neuronas piramidales las cuales se comunican entre sí a través de neuronas GABAérgicas (basket cells). Las neuronas piramidales se agrupan en tres regiones denominadas CA3, CA2 y CA1 (Fig. 1). Por otro lado, el giro dentado está formado por neuronas granulares, las cuales reciben la información proveniente de la corteza entorrinal a través de la vía perforante y proyectan hacia la región CA3 del hipocampo por medio de las fibras musgosas. Estas fibras musgosas están formadas por los axones de las células granulares y hacen sinapsis con las dendritas apicales de las neuronas piramidales. Las neuronas piramidales de la región CA3 proyectan hacia la región CA1 a través de las colaterales de Schaffer y luego desde la región CA1 las neuronas proyectan hacia el subículo (Leranth and Hajszan, 2007) y de allí nuevamente a la corteza entorrinal (Fig. 1).

1.2.1.2. Conexiones aferentes

Existen tres vías aferentes principales en el hipocampo que fueron mencionadas anteriormente: la vía perforante que conecta con las células granulares del giro dentado; la fibra musgosa que proyecta a CA3 y finalmente, las colaterales de Schaffer, que proyectan hacia la región CA1 (Fig. 1). La corteza entorrinal, es la principal fuente de proyecciones hacia el hipocampo. Además, el hipocampo recibe algunas proyecciones del núcleo septal (Greenstein and Greenstein, 2000). En definitiva, la principal estructura del hipocampo que recibe proyecciones externas es el giro dentado, el cual recibe proyecciones colinérgicas y GABAérgicas desde el septum medial, del área supramamilar, aferencias noradrenérgicas de los núcleos pónticos y locus ceruleus, serotoninérgicas del rafe medial y dopaminérgicas del área tegmental ventral, además de un sistema comisural del hipocampo contralateral (Leranth and Hajszan, 2007).

1.2.1.3. Conexiones eferentes

El hipocampo proyecta principalmente a diferentes áreas circunvecinas como la corteza entorrinal, subículo y núcleo septal. Por otro lado, el hipocampo también puede afectar otras estructuras cerebrales mucho más distantes a través de proyecciones indirectas y circuitos complejos. Entre estas estructuras se encuentran el hipotálamo, cuerpos mamilares (vía conexión recíproca del fornix), y el neocortex (vía circuito de papez). Con respecto al neocortex, se ha descrito el efecto del hipocampo sobre estructuras como giro del cíngulo, a través de sus conexiones con corteza entorrinal y subículo (Greenstein and Greenstein, 2000). Las conexiones recíprocas del hipocampo con muchas de estas estructuras (incluida la amígdala, corteza prefrontal y de asociación) forman lo que se conoce como sistema límbico, como se ha indicado anteriormente, un sistema importante para los procesos emocionales, entre otras funciones cognitivas.

1.2.2. Neurotransmisión glutamatérgica en el hipocampo

Las neuronas piramidales, las células granulares y sus conexiones intrahipocampales son el mayor componente de lo que se conoce como el circuito trisináptico del hipocampo (Fig. 1). Este circuito se caracteriza por ser unidireccional y glutamatérgico (Leranth and Hajszan, 2007). Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Figura. 1. Representación esquemática de una rodaja de hipocampo de roedor. En la parte superior de la figura se indica la localización del hipocampo en el cerebro de roedor. En la parte inferior se señalan las principales regiones vías excitatorias y conexiones sinápticas del hipocampo (Imagen tomada de Purves et al., 2001). La estimulación a alta frecuencia de cualquier punto del circuito aferente aumenta los potenciales postsinápticos excitatorios (PEPS) en las neuronas hipocampales. Este incremento en la eficacia sináptica puede permanecer por horas e incluso días. A este proceso se le denomina potenciación a largo plazo (LTP, long term potentiation) e implica cambios en receptores postsinápticos, cambios presinápticos (es decir en la liberación del neurotransmisor), cambios estructurales en la sinapsis y cambios en la citoarquitectura de la neurona misma (Rampon and Tsien, 2000). La LTP es el modelo básico que nos permite entender parte de los procesos funcionales en los circuitos cerebrales que participan en la formación de la memoria. Es un proceso que depende de la actividad de los receptores glutamatérgicos ionotrópicos N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato (AMPA), y metabotrópicos (mGluR). Al activarse estos receptores se induce una ruta de señalización, en la que en última instancia se modifica la expresión génica. Esto genera cambios a nivel neural, como la alteración de la estructura de la neurona postsináptica, aumentando la expresión de receptores e incluso se podrían generar señales, que de manera retrógrada, aumentaran la cantidad de neurotransmisor liberado por la neurona presináptica. Todo esto, en conjunto, aumenta la eficacia de transmisión sináptica durante largos periodos de tiempo (Milner et al., 1998). De esta manera, la función de los receptores de glutamato en los diferentes puntos de circuito del hipocampo, es indispensable para su función sináptica y, por lo tanto, para procesos cognitivos más complejos.

1.3. Mecanismos moleculares de la neurodegeneración en la Enfermedad de Alzheimer

La EA es una de las diversas enfermedades neurodegenerativas que presentan un mecanismo patológico común, donde alteraciones conformacionales proteicas conllevan una agregación y acumulación de proteínas en el sistema nervioso central y, como consecuencia, la muerte neuronal (Bucciantini et al., 2002). Estos desórdenes conformacionales proteicos con deposición de agregados en el sistema nervioso, son comunes a la EA, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y las encefalopatías espongiformes transmisibles (Soto, 2003) La característica general de estos desórdenes es la implicación de proteínas que adoptan plegamientos conformacionales alternativos y estables, ricos en hojas β, que promueven su agregación y acumulación en los tejidos en forma de depósitos fibrilares.

La demencia en la EA está asociada al proceso de neurodegeneración que inicialmente se caracteriza por la pérdida en el número de sinapsis y prosigue con la muerte de neuronas en regiones específicas del cerebro (ver sección 1.2).

1.3.1 Alteración de la función sináptica en los estadíos tempranos de la Enfermedad de Alzheimer

La pérdida de sinapsis en el neocortex y el sistema límbico parece ser el mejor correlato morfológico de los déficits observados en los estadíos medios y tardíos de la EA. Sin embargo, muchos pacientes en los estadíos tempranos de la enfermedad no muestran un declive significativo en número de sinapsis (Kelly et al., 2005;Terry, 2004). Por ello, se ha propuesto que un estado de disfunción sináptica, esto es, una alteración de la función sináptica "normal", podría explicar los déficits cognitivos observados en los estadíos tempranos de la EA y, de este modo, preceder a la pérdida de sinapsis, la acumulación de placas, la formación de ovillos y la neurodegeneración (Selkoe, 2002). Sin embargo, los mecanismos que subyacen a estos déficits funcionales siguen siendo desconocidos.

Actualmente la hipótesis con mayor relevancia manejada para explicar los déficits cognitivos de la EA es la hipótesis amiloídica o amiloide, donde se postula que la acumulación progresiva de una proteína, el péptido β-amiloide, juega un papel central en la génesis de la EA (Selkoe, 2001).

1.3.2 Péptido β-amiloide

El Aβ deriva de la proteína precursora del β-amiloide (APP) que es una proteína transmembrana. Se origina tras realizar dos cortes secuenciales en el dominio transmembrana de APP por las enzimas proteolíticas β-secretsa, en primer lugar, seguido de γ-secretasa. La longitud del fragmento Aβ depende del punto de corte de la γ-secretasa en el dominio transmembrana de APP, originándose principalmente fragmentos de 38, 40 (Aβ40) o 42 (Aβ42) aminoácidos. Para que la γ-secretasa realice su función, es necesaria la presencia de otras cuatro proteínas, formándose un complejo proteico. El complejo está formado por la presilina (PS1), presilina 2 (PS2), nicastrina, APH1 y PSEN2 (Fig. 2B).

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Figura 2. Vías de procesamiento de la proteína precursora amiloide, APP. A. Vía no amiloigénica de proteolisis de APP, llevada a cabo por un primer corte en el dominio transmembrana por la enzima proteolítica α-secretasa, impidiéndose la formación del Aβ. B. Origen del Aβ por escisión anormal de APP, a partir de dos cortes consecutivos, primero por la β-secretasa y seguidamente por el complejo de la γ-secretasa. Dependiendo del sitio de corte del complejo γ-secretasa, el Aβ tendrá diferentes tamaños. Las mutaciones en el gen de la APP incrementan la proteolisis de APP por la β-secretasa. Y mutaciones en los genes de las PS1 y PS2 (genes PSEN1 y PSEN2, respectivamente), producen un incremento de la actividad de la γ-secretasa. En ambas situaciones, se produce un aumento en la producción del Aβ. Cuando el Aβ se libera al espacio extracelular se agrega formando oligómeros (ver sección 1.3.3; Patterson et al., 2008).

El Aβ liberado predominante en el plasma sanguíneo y en el líquido cefalorraquídeo es el Aβ40 (~90%) seguido del Aβ42 (Kuppuswamy et al., 1993). A pesar de la mayor presencia del Aβ40, estudios i n vivo revelan que el componente principal de las placas amiloides es el Aβ42, en forma de agregados fibrilares, y se ha propuesto que Aβ42 desempeña un papel fundamental en la formación de las placas. De hecho, modelos de ratones transgénicos que expresan Aβ42 llegan a desarrollar placas amiloides, mientras que los modelos de Aβ40 no las desarrollan (McGowan et al., 2005). In vitro, Aβ42 presenta menor solubilidad y mayor propensión a formar fibrillas, y en cultivos de neuronas se ha visto que es más tóxico que Aβ40. Las últimas evidencias apuntan a que la toxicidad no viene determinada tanto por los niveles Aβ42, sino más bien por una alteración de la relación Aβ42/40, a favor de la producción de Aβ42 (Jan et al., 2008;Bitan et al., 2003).

Por otro lado, en el procesamiento no amiloigénico de APP, el primer corte es realizado dentro del dominio transmembrana (el del péptido Aβ) por la α-secretasa, liberándose un largo dominio de APP soluble, y dejando anclado a la membrana el dominio C-terminal. A este nivel, corta el complejo de la γ-secretasa, liberando al citosol un pequeño dominio C-terminal (Fig. 2A; Chow et al., 2009).

1.3.3. Oligómeros de β-amiloide

El Aβ se libera de la membrana celular en forma de monómeros de distintos tamaños, que se agregan y forman oligómeros. A su vez, los oligómeros forman fibrillas de unos 7-10 nm en forma de lámina β, que junto con oligómeros individuales darán lugar a las placas amiloides extracelulares insolubles (Fig. 3; Walsh and Selkoe, 2007).

En los últimos años la hipótesis amiloide formulada inicialmente ha variado. En un principio esta hipótesis establecía que los depósitos de Aβ eran los desencadenantes de la pérdida de sinápsis y la muerte neuronal, y por tanto de los déficits cognitivos asociados a la EA. Sin embargo en los últimos años se

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Figura 3. Esquema de la formación de las fibrillas del Aβ y acumulación en placas en cerebro humano y en ratón transgénico para APP. El Aβ (monómeros solubles) al polimerizar forman oligómeros de diferentes tamaños. Estos oligómeros se agregan en fibrillas insolubles en forma de lámina β que darán lugar a los depósitos de placas amiloides que se observan en los pacientes con EA (Imagen modificada de Weiner and Frenkel, 2006).

ha modificado debido a que en muchos casos la cantidad de depósitos extracelulares de Aβ y la severidad de los síntomas asociados a la EA no se correlacionan necesariamente (Terry, 2004). La actual hipótesis sugiere que las formas solubles, en mayor medida que las conformaciones fibrilares tardías, podrían interferir con el funcionamiento de ciertas redes neuronales, alterando la función sináptica entre células nerviosas (Klein, 2002;Peña et al., 2010;Shankar et al., 2008;Soto, 2003). Los oligómeros y monómeros solubles jugarían un papel fundamental sobre todo en los estadíos tempranos de EA (Haass and Selkoe, 2007;Lacor et al., 2007;Walsh and Selkoe, 2007), de forma que provocaría la alteración del funcionamiento de los circuitos neuronales llevando a un estado de disfunción sináptica, que probablemente comience mucho antes de la aparición de los síntomas clínicos (Borroni et al., 2006).

Además, los depósitos de Aβ podrían servir de reservorios de los oligómeros solubles tóxicos, que podrían estar dispuestos para ser activados y desensamblados por el contacto con lípidos (Martins et al., 2008).

1.3.4. Péptido β-amiloide (25-35)

El estudio de las propiedades patofisiológicas del Aβ puede realizarse a partir de la utilización de análogos sintéticos. El Aβ(25–35) es, entre otros, uno de los análogos utilizados para realizar estos estudios. Es un péptido de once aminoácidos, que corresponde a un pequeño fragmento de Aβ(1–40) y Aβ(1–42). Representa la región biológicamente activa del Aβ, y mantiene las mismas propiedades biológicas y físicas, entre ellas la toxicidad, que los monómeros completos Aβ40 y Aβ42 (Kaminsky et al., 2010). Concretamente, se ha visto que la toxicidad del Aβ(25–35) en cultivos de neuronas de hipocampo (Pike et al., 1995) y en rodajas hipocampales (Peña et al., 2010) es muy similar a la de Aβ(1–40) y Aβ(1-42) (Bi and Sze, 2002).

1.4. Neurotoxicidad del β-amiloide

1.4.1. Alteración de la neurotransmisión glutamatérgica

Recientemente se ha mostrado que el Aβ soluble aislado directamente de cerebros de pacientes con EA induce, potente y consistentemente, varios fenotipos de la EA implicando principalmente a la transmisión sináptica glutamatérgica a través de mGluR y NMDA (Shankar et al., 2008). Por otra parte, se ha propuesto que el efecto del Aβ podría estar mediado por un incremento en la endocitosis del receptor NMDA (Lacor et al., 2007). Además, se ha comprobado que la depresión de la transmisión glutamatérgica, mediada por receptores AMPA/Kainato, provocada por el Aβ está mediada por la modulación de los canales de calcio de tipo L en la amígdala (Ashenafi et al., 2005). En cambio, en el septum medial, la depresión inducida por Aβ de las respuestas excitatorias está mediada tanto por canales de calcio tipo L como por receptores muscarínicos M1 (Santos-Torres et al., 2007).

Además se ha postulado que la toxicidad del Aβ implique a receptores glutamatérgicos mGluR1 interfiriendo en la regulación de la transmisión GABAérgica (Tyszkiewicz and Yan, 2005).

1.4.2. Efectos del β-amiloide sobre la función del hipocampo

Como anteriormente se ha comentado, la LTP hace referencia a una forma de plasticidad, en la cual la eficiencia de la transmisión sináptica permanece incrementada a lo largo del tiempo. La LTP fue descrita inicialmente en el hipocampo. Existen evidencias de que diferentes formas solubles del Aβ, entre ellos el Aβ(1-42) y sus fragmentos Aβ(25-35) y Aβ(31-35), pueden inhibir la inducción de LTP en el hipocampo de roedores (Freir et al., 2001). Este efecto puede ser dependiente de los receptores de glutamato tipo NMDA, entre otros mecanismos (Chen et al., 2002). En otros estudios, ratones transgénicos que sobreexpresan APP, y por lo tanto tienen incrementados los niveles de Aβ, presentan deficiencias en tareas de aprendizaje y memoria (Mucke et al., 2000). Animales transgénicos que producen altos niveles de Aβ, así como aquellos a los que se les administra Aβ de manera exógena, presentan deterioro en diferentes tipos de memoria dependientes de la función del hipocampo (Kotilinek et al., 2002).

Por otro lado, estudios i n vitro en cultivos de neuronas de hipocampo incubadas con Aβ, ponen de manifiesto diferentes mecanismos de neurotoxidad de Aβ. Entre los mecanismos descritos, mencionar la generación de estrés oxidativo, formación de ovillos neurofribrilares, disfunción mitocondrial, inactivación de la bomba Na+/K+ ATPasa y la activación de moléculas pro-apoptóticas (Maccioni et al., 2001;Varadarajan et al., 2000).

Otro de los factores que afecta la funci6n del hipocampo antes de los procesos de muerte celular, es la disfunci6n simiptica. En este sentido el Af3 afecta considerablemente tanto a la actividad colinergica, como a la glutamatergica del hipocampo (Gasparini and Dityatev, 2008;Maccioni et al., 2001).

2. PLANTEAMIENTO GENERAL Y OBJETIVOS

Se ha propuesto que los déficits cognitivos observados en los estadíos tempranos de la EA podrían estar producidos por la presencia de oligómeros y monómeros solubles de Aβ. Su presencia induciría un estado de disfunción sináptica, previo a la aparición de los síntomas clínicos, que alteraría el funcionamiento de los circuitos neuronales relacionados con el aprendizaje y la memoria.

Nuestra hipótesis de trabajo propone que el mecanismo de acción de las formas solubles del péptido Aβ podría afectar al patrón de expresión génica de distintos tipos de receptores neuronales implicados en la neurotransmisión glutamatérgica en el hipocampo.

Planteamos, por tanto, como objetivo principal de este proyecto investigar la neurotoxicidad inducida por el Aβ sobre la expresión de receptores glutamatérgicos en el hipocampo de mamíferos. Este objetivo general se puede desglosar en los siguientes objetivos específicos:

1. Determinar si los procedimientos de extracción de RNA total a partir de rodajas de hipocampo afectan a la integridad del mismo.
2. Determinar si la fracción soluble del Aβ, en concreto el fragmento biológicamente activo Aβ(25-35), modifica el patrón de expresión génica de las subunidades de los receptores glutamatérgicos.

El procedimiento experimental que se llevará a cabo para alcanzar estos objetivos será la realización de estudios in vitro utilizando muestras de hipocampo de rata incubadas con el péptido Aβ(25-35), y se analizarán distintas subunidades de receptores glutamatérgicos utilizando una técnica de cuantificación de la expresión génica, concretamente la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR).

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Obtención de muestras de tejido nervioso hipocampal

3.1.1. Animales de experimentación

Los estudios de expresión génica de las distintas subunidades de receptores ionotrópicos glutamatérgicos se realizaron en rodajas de hipocampo de ratas Wistar de 30-40 gramos (3-5 semanas), de ambos sexos, enviados desde el animalario de la Universidad de Valladolid. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices españolas (BOE 67/8509-12, 1988) y la regulación de la Unión Europea (86/609/UE) para el uso de animales de laboratorio.

3.1.2. Aislamiento del cerebro

Los animales se sacrificaron por decapitación e inmediatamente se procedió a la extracción de cerebro. La piel se diseccionó para que el cráneo quedara expuesto, y se retiró hueso craneal con ayuda de una gubia, hasta que quedaron al descubierto los lóbulos olfatorios, los hemisferios cerebrales y la mayor parte del cerebelo. Durante todo el procedimiento, y con la finalidad de preservar en condiciones óptimas el tejido, el cerebro se mantuvo constantemente húmedo y frío (entre 2-4°C) mediante la aplicación con una pipeta Pasteur gota a gota, de solución de Krebs modificada (ver Tabla 1) burbujeada con gas carbógeno (95% O2; 5% CO2).

Una vez se extrajo el encéfalo, se seccionó el nervio óptico y el tallo cerebral, y se sumergió en solución de Krebs modificada mantenida entre 2-4°C, también burbujeada con gas carbógeno. Transcurrido ese tiempo, se procedió al tallado y a la obtención de rodajas de hipocampo de acuerdo al atlas de Paxinos and Watson, 2007.

3.1.1.2. Soluciones de perfusión

Para la realización de los experimentos se emplearon dos tipos de soluciones de Krebs. Desde la decapitación del animal hasta la obtención de las rodajas se utilizó una solución de Krebs modificada. Para la incubación se utilizó la solución de Krebs normal (Tabla 1).

Tabla 1. Composición de las soluciones de Krebs empleadas en la obtención e

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En todo momento, las soluciones se burbujearon con gas carbógeno con

el fin de mantener adecuados el aporte de oxígeno y el pH de las mismas (pH ≈ 7.2). Todos los productos utilizados en la elaboración de las soluciones fueron de la marca comercial Sigma (Reino Unido).

La disminución de la concentración de Na+ en la solución de Krebs modificada, tuvo como finalidad minimizar la entrada del mismo al interior celular y, por tanto, la despolarización de las neuronas, sobre todo durante la obtención de los cortes. Por otra parte, la sustitución de NaCl por sacarosa auna concentración de 205 mM tuvo como objetivo conservar la osmolaridad total de la solución.

3.1.3. Obtención de las rodajas de hipocampo

Tras el aislamiento de cerebro, rápidamente se realizó el tallado de la pieza. Para ello, el cerebro se situó sobre una placa de Petri agregando continuamente solución de Krebs modificada burbujeada con carbógeno, como se ha descrito anteriormente. Con una cuchilla se realizó un primer corte perpendicular a la línea antero-posterior del cerebro, a nivel del quiasma óptico seguido de un segundo corte, paralelo al anterior, a nivel del colículo inferior. El bloque se apoyó por la parte anterior y se realizó un tercer corte paralelo a la línea antero-posterior, del 10-20% del volumen total de la parte más dorsal del cerebro (Fig. 4). El bloque final obtenido se fijó con cianoacrilato (Ceys SA, España) sobre una base de aluminio por la parte dorsal, quedando la parte anterior cortical orientada hacia la cuchilla del vibratomo. Se obtiene de esta forma el llamado “corte mágico” del hipocampo (Bischofberger et al., 2006), conservando en unas condiciones óptimas los circuitos hipocampales en la rodaja.

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Figura 4. Representación esquemática del cerebro de rata. Las líneas discontinuas numeradas indican el orden y el lugar de tallado del cerebro (Imagen modificada del Atlas de Paxinos y Watson, 2007).

La pieza se rodeó con bloques de agar al 2 % de unos 5 mm aproximadamente de espesor y de su misma altura. Los bloques de agar sirvieron para que durante el corte de la pieza no se desplazara el tejido nervioso. A continuación utilizando el vibratomo (Fig. 5) se realizaron cortes horizontales de 300-350 μm de espesor conteniendo el hipocampo en ambos hemisferios. De cada cerebro tallado se obtuvieron 10-14 muestras de hemisferio cerebral conteniendo las secciones de hipocampo. Los cortes se recogieron en una placa de Petri y se mantuvieron en solución de Krebs modificada entre 3-4ºC, burbujeada con carbógeno (Fig. 6A).

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Figura 5. Vibratomo y detalle del corte de cerebro en la obtención de rodajas. A. Vibratomo y partes que lo componen detalladas. B. Detalle de la realización de una rodaja de cerebro.

3.1.4. Preincubación

Una vez obtenidas, las rodajas se tallaron manualmente para diseccionar el hipocampo. El hipocampo se delimitó cortando y desechando el tejido circundante (Fig. 6B). Una vez se delimitaron las rodajas de hipocampo, se recogieron y se preincubaron, durante al menos diez minutos desde la disección de la última rodaja, en una placa de Petri con solución de Krebs normal burbujeada con gas carbógeno a Tª ambiente.

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Figura 6. Tallado de las rodajas de cerebro para preincubación. A. Almacenaje de las rodajas de cerebro en una placa de Petri con solución de Krebs modificada fría, burbujeada con gas carbógeno. B. Tallado de la rodaja de cerebro mediante la realización de tres cortes (líneas negras punteadas), delimitando así el hipocampo para su posterior preincubación en Krebs normal.

3.1.5. Incubación de las rodajas con el péptido Aβ(25-35)

La rodajas se incubaron en condiciones control (en solución de Krebs normal) y en presencia de Aβ(25-35) 1 μM (Tocris, Reino Unido). En ambos casos, las incubaciones se realizaron a distintos tiempos (0, 30 y 120 min; Fig. 7).

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Figura 7. Representación esquemática del procedimiento de incubación de las rodajas de hipocampo. El tratamiento control corresponde a la incubación en solución de Krebs normal. El tratamiento Aβ(25-35), corresponde a la incubación con solución de Krebs normal con Aβ(25-35) 1 μM. Las rodajas se incubaron durante 30 ó 120 min. En tiempo cero las rodajas de hipocampo no tuvieron tratamiento.

3.2. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa (qPCR)

La cuantificación de los niveles de expresión génica de subunidades de receptores glutamatérgicos se llevó a cabo mediante la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real. 3.2.1. Extracción y purificación del RNA total La extracción y aislamiento del RNA total de las rodajas de hipocampo se llevó cabo usando Trizol (Invitrogen, Reino Unido) y columnas de homogeneización Qiashredder (Qiagen, Alemania). Seguidamente, se realizó la purificación del RNA total con el Kit de purificación por columna RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania).

Además, se llevó a cabo un tratamiento adicional con DNasa I (Qiagen,Alemania), para eliminar la posible contaminación por DNA y maximizar la pureza del RNA.

Tras la obtención del RNA total de cada rodaja se procedió a la cuantificación del mismo, midiendo en un espectrofotómetro para pequeños volúmenes a 260 nm (Nanodrop 2000c, ThermoScientific, EEUU), obteniendo los datos de la concentración del RNA total de cada muestra (en ng/μl).

A continuación se analizó la calidad del RNA, en base a la pureza e integridad del RNA obtenido, utilizando el sistema de análisis de calidad por electroforesis automatizada Experion System (Bio-Rad, EEUU). Este procedimiento fue realizado por la Unidad de Genómica del Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” (IPBLN, Granada). La integridad y la pureza del RNA viene indicada por el RQI (RNA Quality Indicador) que es un dato numérico entre 10 (RNA intacto) y 1 (RNA altamente degradado).

3.2.2. Síntesis de cDNA a partir del RNA total

La síntesis de cDNA se realizó mediante la técnica de retrotranscripción en dos etapas. En la primera etapa, se agregaron cantidades iguales de 0.198 μg de RNA total, random nonamers 2 μM (Sigma, Reino Unido), oligo dT 2 0 1 μM (Promega, EEUU) y dNTPmix (mezcla de los cuatro dNTPs) 0.5 μM, (Promega, EEUU) en un volumen final de 13 μl, y se mantuvieron en el termociclador (T- profesional, Biometra, Alemania) durante 5 min a 65°C. Seguidamente se depositaron las muestras en hielo durante 5 min. En la segunda etapa se llevó a cabo la retrotranscripción añadiendo a la mezcla anterior Buffer First-Strand 5X (Invitrogen, Reino Unido), DTT 0.1 M Inhibidor de ribonucleasa 40 unidades/μl (Promega, EEUU) y Superscript TM III RT (Invitrogen, Reino Unido) en un volumen final de 20 μl. Las condiciones que se siguieron en el termociclador fueron de 25°C durante 5 min, 50°C durante 50 min y 70°C durante 15 min.

3.2.3. PCR cuantitativa en tiempo real.

Las qPCR (PCRs cuantitativas) se realizaron con el equipo AB7500 (Applied Biosystems, EEUU) utilizando Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EEUU) para cada par de cebadores específicos (ver secuencias en Tabla 2) para cada gen estudiado (por ejemplo, genes que codifiquen para las subunidades de receptores ionotrópicos de glutamato o los genes de referencia) Se incluyeron siempre muestras de cDNA control(obtenidas sin transcriptasa) y muestras sin cDNA.

Tabla 2. Secuencias de los cebadores utilizados.

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Negro : Genes de referencia; A z u l : Subunidades del receptor NMDA; Verde : Subunidades del receptor AMPA; Marrón : receptor colinérgico muscarínico. S: sentido; A: antisentido

Las eficiencias (E) de amplificación de las PCRs se calcularon para cada gen a partir de curvas estándar obtenidas mediante diluciones seriadas. Las reacciones se realizaron por triplicado para 4 replicados biológicos (4 animales) y la expresión de cada gen se normalizó a la expresión del gen de referencia β-Actina. Los cambios en los niveles de expresión génica se cuantificaron de acuerdo al método de Pfaffl (Pfaffl, 2001), considerando los valores de CT (cycle threshold) y las E de las PCRs para los genes diana y de referencia. El ratio de la expresión relativa de los genes diana respecto al gen de referencia se calculó por medio de la fórmula: ratio = Ediana ΔCTdiana(control-tratado) ⁄ ErefΔCTref(control-tratado). La especificidad de los productos de la PCR se determinó por análisis de las curvas de disociación. Las secuencias de los cebadores se diseñaron a partir de bases de datos de secuencias (NCBI) usando el servicio Sigma Genosys Probe Design (Sigma, Reino Unido) o a partir de secuencias previamente publicadas.

3.3. Análisis estadístico de los datos

Todas las pruebas estadísticas se realizaron con el programa SPSS v12 para Windows. Para la comparación tanto de los valores de RQI como de los ratios de expresión génica se aplicaron las pruebas paramétricas apropiadas (t de Student o ANOVA de una o dos vías seguido del análisis post hoc adecuado). Si los datos no siguieron una distribución normal se usaron las pruebas no paramétricas equivalentes.

4. RESULTADOS

4.1. Análisis de la calidad del RNA total

El RNA total fue extraído y purificado de rodajas de hipocampo y se sometió a un tratamiento con DNasa I para maximizar su pureza. Se obtuvieron 44 muestras de RNA total y se analizó la integridad del 91% de las mismas a partir del valor de RQI (calculado a partir de los electroferogramas obtenidos mediante el sistema de electroforesis automatizada Experion System, Bio-Rad, EEUU).

Como se ilustra en la Figura 8, un electroferograma muestra el perfil de RNA de degradación de los RNA ribosomales, de acuerdo a la premisa de que con el transcurso del tiempo éstos se van degradando y acumulando como pequeños RNA de bajo peso molecular (aparecen en el electroferograma como picos). En concreto, el RQI se calcula en base a las áreas del electroferograma correspondientes a las regiones 28S, 18S y pre-18S (Fig. 8A,C,E). Para la comparación de las distintas calidades del RNA en las muestras de hipocampo, en la Figura 8 se muestran tres ejemplos de los electroferogramas y las imágenes de los geles virtuales correspondientes a tres muestras de RNA total con RQI distintos.

Como se muestra en la Tabla 3 los valores de RQI obtenidos se dividieron en cuatro grupos (definidos según criterio establecido en el laboratorio); RQI menores a 6 (RNA bastante degrado), RQI entre 6 y 7.5 (RNA algo degrado), RQI entre 7.5 y 8.5 (RNA de buena calidad) y RQI mayores a 8.5 (RNA de excelente calidad). El 50 % de las muestras de RNA total tuvieron un RQI mayor a 8.5 (Tabla 3).

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Figura 8. Medida de la calidad del RNA total extraído de rodajas de hipocampo. A, C y Emuestran los electroferogramas, donde se representa la fluorescencia con respecto al tiempo (s) de reacción, correspondientes a los perfiles de RNA total de muestras de hipocampo. El primer pico que aparece en los 3 perfiles corresponde al marcador de peso molecular. B, D y F representan las imágenes de los geles virtuales de cada muestra. Se representa el marcador de peso molecular en el carril izquierdo y la muestra de RNA en el carril derecho. A. Perfil de RNA con un RQI de 9.1. Los picos corresponden a las subunidades ribosomales 18S y 28S. En este caso, no se observan en el perfil pequeños picos que muestren degradación del RNA. B. Hay dos bandas correspondientes a los RNA ribosomales 28S y 18S, respectivamente. El mayor grosor de la banda correspondiente a 28S indica mayor concentración con respecto al 18S. C. Perfil de RNA con un RQI de 7.1. Se indican con flechas los diferentes picos correspondientes a fragmentos degradados de RNA, que atendiendo al tamaño, aparecen en diferentes momentos a lo largo del tiempo. D. En la muestra se señalan con flechas los fragmentos degradados de diferentes tamaños. E. Perfil de RNA con RQI de 2.1. Se observa una curva correspondiente a RNA muy degradado. F. Es indistinguible cualquier tipo de banda. 18S y 28S: Subunidades ribosomales 18S y 28S, respectivamente; L: Marcador de peso molecular; M1, M2 y M3: Tres muestras de RNA total de hipocampo distintas.

Tabla 3. Índice de la calidad del RNA total extraído (RQI) de rodajas de hipocampo y porcentaje de muestras que hay en los rangos de RQI propuestos.

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Al comparar la integridad del RNA de las rodajas de hipocampo sin tratamiento con el de las rodajas de hipocampo incubadas con Aβ(25-35), no se encontraron diferencias significativas (p =0.989). Tampoco se hallaron diferencias en la integridad del RNA atendiendo el tiempo de incubación (p =0.798; F(4,35)=0.413).

Finalmente, el criterio para la selección de las muestras de RNA a utilizarpara la síntesis de cDNA y análisis de la expresión génica fue un valor de RQI igual o mayor a 7.00. Se incluyeron 20 muestras (n=20) de 4 animales diferentes. De estas 20 muestras, el 65% tenían un valor de RQI mayor a 8, es decir, un RNA de muy buena calidad.

4.2. Cuantificación relativa de la expresión génica de subunidaes de receptores glutamatérgicos mediante qPCR

Para determinar si el Aβ(25-35) induce cambios en la expresión génica en rodajas de hipocampo de rata, se cuantificó el RNAm de diferentes subunidades de receptores glutamatérgicos mediante la técnica de qPCR.

4.2.1. Optimización de las qPCRs: Selección de cebadores

Como se indicó en el apartado 3.2.3 de la sección de Material y Métodos, se calculó la eficiencia (E) de amplificación para cada pareja de cebadores en nuestras muestras de hipocampo. Para ello, se realizaron curvas estándar a partir de diluciones seriadas del cDNA. La E se calcula a partir de la pendiente de la recta de regresión resultante. En la Tabla 4 se recogen las E obtenidas (expresadas en porcentaje) cuyos valores variaron entre 99.2 − 116.6 % en función del cebador evaluado. También a partir de las curvas estándar se calculó el valor del coeficiente de determinación (R2, Tabla 4), que nos indica el ajuste de los datos a la recta de regresión.

Junto con la reproducibilidad de los replicados medidos, un valor de R2 mayor a 0.980 y una E entre 90 − 105%, son los indicadores de una qPCR optimizada. Como se observa en la Tabla 4 los cebadores para los genes que codifican para las subunidades de receptores GluR1, NR2A, NR2B, NR1, el receptor muscarínico M1, los genes de referencia β-Actina y subunidad ribosomal 18S, funcionaron de forma óptima. Sin embargo, los cebadores para los genes GAPDH y GluR2, no produjeron una amplificación adecuada.

Una vez determinadas las eficiencias de amplificación de los cebadores, en el presente estudio de expresión génica de subunidaes de receptores ionotrópicos glutamatérgicos, se seleccionaron los genes que codifican para las subunidades NR2A, NR2B y GluR1 para el desarrollo de las qPCR. Como gen de referencia se seleccionó el gen de la β−Actina.

4.2.2. Cuantificación relativa de la expresión de subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos

La cuantificación relativa de la expresión génica se llevó a cabo a partir de la normalización de los niveles de expresión de las distintas subunidades con la expresión del gen de la β-Actina (la expresión génica de este gen de referencia no se ve afectada ni por el tiempo de incubación, ni el tratamiento con Aβ; p =0.646; F(4,15) =0.634).

Tabla 4. Concentraciones de los cebadores sentido y antisentido utilizados para cada gen y los R2 y E (%) obtenidos en las qPCR de las curvas estándar.

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Negro: genes de referencia; Azul: subunidades del receptor NMDA; Verde: subunidades del receptor AMPA; Marrón: receptor colinérgico muscarínico; R 2 : coeficiente de determinación; E (%): eficiencia de amplificación; √; qPCR optimizada; X: qPCR sin optimizar.

En la figura 9 se muestra la expresión relativa (en valores de porcentaje)de las subunidades NR2A, NR2B y GluR1 (Fig. 9A,B,C), tanto en condiciones control como en presencia Aβ(25-35) a los distintos tiempos de incubación.

No se encontró variación significativa de los niveles de RNAm de las subunidades NR2B y GluR1 por efecto del tiempo, ni tras el tratamiento con Aβ(25-35) (Fig. 9B-C; NR2B, p =0.061, F(4,15)=3.388; GluR1, p =0.573, F(4,15)=0.578).

Por el contrario, los niveles de RNAm de la subunidad NR2A disminuyeron con el tiempo de incubación (Fig. 9A; p =0.001, F (2,9)=16.329) reduciéndose en un 20% en condiciones control y un 35% a los 120 min. El tratamiento con Aβ(25-35) evitó esta disminución a los 30 min (Fig. 9A, p =0.021), es decir, Aβ(25-35) aumentó la cantidad de RNAm de la subunidad NR2A tras 30 min de incubación. Este efecto no se mantuvo a los 120 min.

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Figura 9. Porcentaje de expresión relativa de receptores glutamatérgicos: subunidades

NR2A, NR2B y GluR1 en rodajas de hipocampo de rata. La expresión relativa se ha normalizado con la expresión constitutiva del gen de referencia β-Actina. En todos los casos se representa la cuantificación relativa en % de la expresión génica en condiciones control y con Aβ(25-35), en función del tiempo (min). En todos los casos, en tiempo cero se considera 100% de expresión génica.*, p 0.05. A. Expresión génica de la subunidad NR2A. B. Expresión génica de la subunidad NR2B. C. Expresión génica de la subunidad GluR1.

5. DISCUSIÓN

En el presente trabajo se ha llevado a cabo un análisis del efecto del Aβ(25-35) sobre la expresión génica de las subunidades NR2A y NR2B del receptor NMDA y la subunidad GluR1 del receptor AMPA, en rodajas de hipocampo de rata.

5.1. Efecto del β-amiloide en la integridad del RNAm

A partir del análisis de la calidad del RNA en el presente trabajo se ha determinado que el tratamiento con Aβ(25-35) 1 μM en rodajas de hipocampo de rata no afecta a la integridad del mismo, indicando que se trata de un modelo adecuado para el estudio de la variación de los niveles de RNAm inducido porel péptido.

5.2. Efecto del β-amiloide sobre la expresión génica de receptores ionotrópicos de glutamato

Aunque existe bastante controversia sobre los mecanismos que emplea el Aβ para producir la alteración de la neurotransmisión glutamatérgica, se encuentra ampliamente aceptado que se modifican las funciones de los receptores de NMDA y AMPA (Gasparini and Dityatev, 2008;Parameshwaran et al., 2008). En el presente trabajo se ha analizado si esta alteración podría estar mediada por un cambio en la expresión de las subunidades que conforman estos receptores.

5.2.1. Expresión de subunidades de receptores AMPA

Los receptores AMPA están formados por cuatro subunidades (GluR1-4). La unidad funcional es un tetrámero. La activación del receptor AMPA esta mediada únicamente por glutamato. Las propiedades del receptor dependen de las subunidades GluR1, GluR3 y GluR4, mientras que la subunidad GluR2 le confiere impermeabilidad al calcio (Kew and Kemp, 2005).

En el presente estudio no se han hallado diferencias en los niveles de RNAm del gen de GluR1 provocadas por Aβ(25-35). Estos resultados estarían de acuerdo con otros autores que tampoco encuentran diferencias en la expresión génica de GluR1 y GluR2, ni el giro dentado, ni en el hipocampo, de cerebros de enfermos de Alzheimer en estadíos tempranos, moderados y severos (Carter et al., 2004). Sin embargo, se ha sugerido que existe una disminución del RNAm de GluR1 en el giro dentado, pero no en el hipocampo en cerebros de pacientes de EA avanzado (Pellegrini-Giampietro et al., 1994). En nuestro estudio, dado que se han utilizado rodajas de hipocampo completo, no podemos descartar que el Aβ tenga efectos específicos para cada región de la estructura hipocámpica.

5.2.2. Expresión de subunidades de receptores NMDA

El receptor NMDA es un complejo proteico compuesto por subunidades NR1, NR2 (A, B, C o D) y NR3 (A, B), en diferentes combinaciones. La conformación mayoritaria es un tetrámero formado por dos dímeros, uno de NR1 y otro de NR2. Su expresión varía tanto en el tiempo como en el área cerebral. En las primeras etapas del desarrollo predomina la expresión de NR2B y NR2D mientras que en cerebro adulto predomina la expresión de NR2A y NR2C (Kohr, 2006). Las subunidades NR1 y NR2A se expresan ampliamente por todo el cerebro, mientras que NR2B se expresa de manera mayoritaria en el cerebro anterior, y co-localiza con NR2A en la corteza cerebral, hipocampo y núcleo estriado. La subunidad NR2C se localiza mayoritariamente en cerebelo, tálamo y bulbo olfatorio (Wenzel et al., 1995). La diferente composición de subtipos de NR2 confiere a los receptores de NMDA características fisiológicas y farmacológicas específicas, incluyendo sensibilidad al Zn+2, H+ y poliaminas, apertura del canal e interacciones con proteínas intracelulares de señalización celular. La activación de los receptores de NMDA requiere la unión simultánea de dos co-agonistas, el glutamato y la glicina. La glicina se une a las subunidades NR1 y NR3, mientras que el glutamato se une a NR2 (Kohr,2006;Paoletti and Neyton, 2007). Se han estudiado las posibles funciones de las distintas subunidades, principalmente de las subunidades NR2A y NR2B, y los resultados obtenidos son diversos. En rodajas de hipocampo de rata se ha visto que la subunidad NR2A tiene un papel fundamental en la plasticidad y en la mediación de la respuesta de los receptores NMDA, en concreto en la LTP (Li et al., 2007). No obstante, otros estudios consideran que en este tipo de respuesta estarían implicadas más subunidades (Berberich et al., 2005).

En el presente análisis de los niveles de RNAm de subunidades del receptor NMDA en hipocampo de rata tras el exposición al Aβ(25-35), hemos encontrado que la expresión génica de NR2B no varió, mientras que la expresión génica de NR2A sí se vio afectada. En concreto, la expresión del NR2A aumentó por efecto del Aβ. Este resultado podría explicar la aparición del estado de disfunción sináptica en el hipocampo que se postula para explicar los efectos del Aβ en los estadíos tempranos de la EA. La alteración crónica de esta subunidad induciría un desbalance funcional en la LTP, lo que podría a su vez subyacer a los déficits cognitivos observados en las etapas iniciales de la EA (Selkoe, 2002). Además se ha visto que una LTP alterada por una sobreactivación de los canales NMDA puede ser reestablecida usando un bloqueante específico de los mismos, la memantina, a concentraciones terapéuticamente relevantes que mejoran los síntomas y ralentizan la progresión de la EA en pacientes (Danysz et al., 2000).

Otros autores, sin embargo, han determinado una disminución en la cantidad de RNAm de NR2B, pero no en NR2A en las etapas tempranas de la EA (Mishizen-Eberz et al., 2004). Por otro lado, también se han encontrado diferencias de acuerdo a las áreas estudiadas, observándose una disminución tanto en los niveles de NR2A como en los de NR2B en el hipocampo de cerebros post mortem (Bi and Sze, 2002). Por el contario, otros estudios no encuentran variaciones en los niveles de RNAm de NR1, NR2B y NR2A entre hipocampos de pacientes de EA en estadios moderados y severos (Mishizen-Eberz et al.,2004). Además, en otras aproximaciones experimentales (por ejemplo, tras la inducción de isquemia cerebral) se han encontrado diferencias entre los niveles de expresión génica de las subunidades dentro de las distintas regiones del hipocampo (Dos-Anjos et al., 2009b).

5.3. Limitaciones del estudio

Como se ha descrito anteriormente existen resultados diversos, y en ocasiones opuestos, del efecto del Aβ sobre la expresión génica de subunidades de receptores glutamatérgicos. Esta diversidad puede deberse a las diferencias entre los distintos procedimientos experimentales utilizados. Algunos factores a tener en cuenta son el tipo de estudio a realizar, por ejemplo, la utilización de cultivos celulares, tejido cerebral animal o humano, rodajas completas o secciones concretas del tejido, etc. También puede contribuir a esta alta variabilidad el tipo de Aβ utilizado (Aβ40, Aβ42, Aβ25-35), si éstos son sintéticos o naturales, el estado de oligomerización, la concentración y el tiempo de incubación, entre otros.

En el presente trabajo se han utilizado rodajas de hipocampo incubadas con Aβ(25-35) 1 μM. Esta decisión se tomó basándonos en estudios similares, en los que, utilizando dicha concentración, observan los efectos tóxicos del Aβ (Ashenafi et al., 2005;Peña et al., 2010). Sin embargo, otros autores (Santos- Torres et al., 2007) generan los efectos tóxicos del Aβ a concentraciones más altas que en nuestro estudio que podrían haber tenido efectos adicionales sobre la expresión génica en el hipocampo.

Otro factor influyente puede ser la utilización del hipocampo completo, en lugar de secciones de sus regiones. Como han visto otros autores, pueden existir variaciones específicas en los niveles de RNAm de las regiones CA1 y CA3 (Dos-Anjos et al., 2009a). Así, al utilizar el hipocampo completo se pueden haber "diluido" algunas variaciones en los niveles de expresión. Por otro lado, el tiempo mínimo de incubación de las rodajas de hipocampo con Aβ en estetrabajo fue de 30 min, dado que en estudios previos electrofisiológicos realizados en el laboratorio los efectos tóxicos del Aβ no aparecen antes de los 20 min (Navarro-López JD, Comunicación personal).

Finalmente cabe resaltar que además de los efectos del Aβ sobre la función sináptica en los sistemas de neurotransmisión glutamatérgica a través de receptores ionotrópicos de NMDA (Lacor et al., 2007;Shankar et al., 2007) y AMPA (Ashenafi et al., 2005) podrían estar implicados otros tipos de receptores o canales. Entre ellos, receptores de glutamato metabotrópicos (Tyszkiewicz and Yan, 2005), receptores muscarínicos M1 (Caccamo, 2006;Santos-Torres et al.,2007), canales de potasio, y/o la bomba Na+/K+-ATPasa (Sultana and Butterfield,2008).

5.4. Perspectivas futuras

Tras la realización de este trabajo, y de acuerdo con los resultados obtenidos, nos proponemos desarrollar con mayor amplitud los siguientes aspectos.

En primer lugar, dada la heterogeneidad de resultados en el campo de estudio, pretendemos incorporar a futuros experimentos los péptidos Aβ(1-42) y Aβ(1-40). Además, está previsto incorporar el Aβ de secuencia inversa, Aβ(35-25), como control negativo de los experimentos. Con esto pretendemos controlar esta variable y descartar algunos resultados existentes en la bibliografía, corroborando los obtenidos con Aβ(25-35).

En segundo lugar consideramos que mediante el análisis del RNAm obtenemos una valiosa visión global de la situación del sistema pero no nos ofrece información sobre la expresión de la proteína para la que codifica ese RNAm, la funcionalidad del receptor o la propia neurotransmisión. En este sentido, prevemos realizar un abordaje multidisciplinar en el que, junto con los estudios de expresión génica de las subunidades de los distintos receptores,dise:fiaremos estudios electrofisiol6gicos, que aporten datos de la funcionalidad de los receptores y su participaci6n en la neurotransmisi6n hipocampica, asicomo estudios inmunohistoquimicos y de Western blot que nos proporcionen informacion sobre la localizaci6n de los receptores.

6. RESUMEN Y CONCLUSIONES

Existen cada vez más evidencias que sugieren que en los estadíos tempranos de la EA se produce una desregulación de los receptores de glutamato, tanto ionotrópicos como metabotrópicos, producida por el Aβ. Esta situación puede llevar a un estado de disfunción en la transmisión sináptica glutamatérgica que explicaría los déficits cognitivos tempranos observados en el inicio de la enfermedad.

Los resultados obtenidos en este estudio muestran la inducción de la expresión de la subunidad NR2A del receptor NMDA en el hipocampo como un nuevo mecanismo de esta alteración de la función sináptica mediada por el Aβ.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Alzheimerʹs disease International L (2009) Alzheimer's Disease International Consortium, World Alzheimer Report.

2. Ashenafi S, Fuente A, Criado JM, Riolobos AS, Heredia M, Yajeya J (2005) Beta-Amyloid peptide25-35 depresses excitatory synaptic transmission in the rat basolateral amygdala ʺin vitroʺ. Neurobiol Aging 26:419-428.

3. Berberich S, Punnakkal P, Jensen V, Pawlak V, Seeburg PH, Hvalby O, Kohr G (2005) Lack of NMDA receptor subtype selectivity for hippocampal long-term potentiation. J Neurosci 25:6907-6910.

4. Bi H, Sze CI (2002) N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2A and NR2B messenger RNA levels are altered in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimerʹs disease. J Neurol Sci 200:11-18.

5. Bischofberger J, Engel D, Li L, Geiger JR, Jonas P (2006) Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc 1:2075-2081.

6. Bitan G, Kirkitadze MD, Lomakin A, Vollers SS, Benedek GB, Teplow DB (2003) Amyloid beta -protein (Abeta) assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize through distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 100:330-335.

7. Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (2006) Alzheimerʹs disease. Lancet 368:387-403.

8. Borroni B, Di LM, Padovani A (2006) Predicting Alzheimer dementia in mild cognitive impairment patients. Are biomarkers useful? Eur J Pharmacol 545:73-80.

9. Bucciantini M, Giannoni E, Chiti F, Baroni F, Formigli L, Zurdo J, Taddei N, Ramponi G, Dobson CM, Stefani M (2002) Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature 416:507-511.

10. Caccamo A (2006) M1 receptors play a central role in modulating AD- like pathology in transgenic mice.

11. Carter TL, Rissman RA, Mishizen-Eberz AJ, Wolfe BB, Hamilton RL, Gandy S, Armstrong DM (2004) Differential preservation of AMPA receptor subunits in the hippocampi of Alzheimerʹs disease patients according to Braak stage. Exp Neurol 187:299-309.

12. Chen QS, Wei WZ, Shimahara T, Xie CW (2002) Alzheimer amyloid beta- peptide inhibits the late phase of long-term potentiation through calcineurin-dependent mechanisms in the hippocampal dentate gyrus. Neurobiol Learn Mem 77:354-371.

13. Chow VW, Mattson MP, Wong PC, Gleichmann M (2009) An Overview of APP Processing Enzymes and Products. Neuromolecular Med.

14. Danysz W, Parsons CG, Mobius HJ, Stoffler A, Quack G (2000) Neuroprotective and symptomatological action of memantine relevant for Alzheimerʹs disease--a unified glutamatergic hypothesis on the mechanism of action. Neurotox Res 2:85-97.

15. Dos-Anjos S, Martinez-Villayandre B, Montori S, Perez-Garcia CC, Fernandez-Lopez A (2009a) Early modifications in N-methyl-D-aspartate receptor subunit mRNA levels in an oxygen and glucose deprivation model using rat hippocampal brain slices. Neuroscience 164:1119-1126.

16. Dos-Anjos S, Martinez-Villayandre B, Montori S, Regueiro-Purrinos MM, Gonzalo-Orden JM, Fernandez-Lopez A (2009b) Transient global ischemia in rat brain promotes different NMDA receptor regulation depending on the brain structure studied. Neurochem Int 54:180-185.

17. Freir DB, Holscher C, Herron CE (2001) Blockade of long-term potentiation by beta-amyloid peptides in the CA1 region of the rat hippocampus in vivo. J Neurophysiol 85:708-713.

18. Gasparini L, Dityatev A (2008) Beta-amyloid and glutamate receptors.Exp Neurol 212:1-4.

19. Greenstein B, Greenstein A (2000) Color Atlas of Neuroscience.Neuroanatomy and Neurophysiology. New York. 2000: Thieme Stuttgart.

20. Haass C, Selkoe DJ (2007) Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimerʹs amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol 8:101-112.

21. Jan A, Gokce O, Luthi-Carter R, Lashuel HA (2008) The ratio of monomeric to aggregated forms of Abeta40 and Abeta42 is an important determinant of amyloid-beta aggregation, fibrillogenesis, and toxicity. J Biol Chem 283:28176-28189.

22. Kaminsky YG, Marlatt MW, Smith MA, Kosenko EA (2010) Subcellular and metabolic examination of amyloid-beta peptides in Alzheimer disease pathogenesis: evidence for Abeta(25-35). Exp Neurol 221:26-37.

23. Kelly BL, Vassar R, Ferreira A (2005) Beta-amyloid-induced dynamin 1 depletion in hippocampal neurons. A potential mechanism for early cognitive decline in Alzheimer disease. J Biol Chem 280:31746-31753.

24. Kew JN, Kemp JA (2005) Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure and pharmacology. Psychopharmacology (Berl) 179:4- 29.

25. Klein WL (2002) ADDLs & protofibrils--the missing links?

26. Kohr G (2006) NMDA receptor function: subunit composition versus spatial distribution. Cell Tissue Res 326:439-446.

27. Kotilinek LA, Bacskai B, Westerman M, Kawarabayashi T, Younkin L, Hyman BT, Younkin S, Ashe KH (2002) Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimerʹs disease. J Neurosci 22:6331-6335.

28. Kuppuswamy D, Dalton M, Pike LJ (1993) Serine 1002 is a site of in vivo and in vitro phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem 268:19134-19142.

29. Lacor PN, Buniel MC, Furlow PW, Clemente AS, Velasco PT, Wood M, Viola KL, Klein WL (2007) Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimerʹs disease. J Neurosci 27:796-807.

30. Leranth C, Hajszan T (2007) Extrinsic afferent systems to the dentate gyrus. Prog Brain Res 163:63-84.

31. Li R, Huang FS, Abbas AK, Wigstrom H (2007) Role of NMDA receptor subtypes in different forms of NMDA-dependent synaptic plasticity. BMC Neurosci 8:55.

32. Maccioni RB, Munoz JP, Barbeito L (2001) The molecular bases of Alzheimerʹs disease and other neurodegenerative disorders. Arch Med Res 32:367-381.

33. Martins IC, Kuperstein I, Wilkinson H, Maes E, Vanbrabant M, Jonckheere W, Van GP, Hartmann D, DʹHooge R, De SB, Schymkowitz J, Rousseau F (2008) Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J 27:224-233.

34. McGowan E, Pickford F, Kim J, Onstead L, Eriksen J, Yu C, Skipper L, Murphy MP, Beard J, Das P, Jansen K, Delucia M, Lin WL, Dolios G, Wang R, Eckman CB, Dickson DW, Hutton M, Hardy J, Golde T (2005) Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron 47:191-199.

35. McKhann G, Drachman D, Folstein M, Katzman R, Price D, Stadlan EM (1984) Clinical diagnosis of Alzheimerʹs disease: report of the NINCDS- ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimerʹs Disease. Neurology 34:939- 944.

36. Milner B, Squire LR, Kandel ER (1998) Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron 20:445-468.

37. Mishizen-Eberz AJ, Rissman RA, Carter TL, Ikonomovic MD, Wolfe BB, Armstrong DM (2004) Biochemical and molecular studies of NMDA receptor subunits NR1/2A/2B in hippocampal subregions throughout progression of Alzheimerʹs disease pathology. Neurobiol Dis 15:80-92.

38. Mucke L, Masliah E, Yu GQ, Mallory M, Rockenstein EM, Tatsuno G, Hu K, Kholodenko D, Johnson-Wood K, McConlogue L (2000) High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation. J Neurosci 20:4050-4058.

39. Paoletti P, Neyton J (2007) NMDA receptor subunits: function and pharmacology. Curr Opin Pharmacol 7:39-47.

40. Parameshwaran K, Dhanasekaran M, Suppiramaniam V (2008) Amyloid beta peptides and glutamatergic synaptic dysregulation. Exp Neurol 210:7-13.

41. Patterson C, Feightner JW, Garcia A, Hsiung GY, MacKnight C, Sadovnick AD (2008) Diagnosis and treatment of dementia: 1. Risk assessment and primary prevention of Alzheimer disease. CMA 178:548-556.

42. Paxinos G, Watson C (2007) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. San Diego: Academic Press.

43. Pellegrini-Giampietro DE, Bennett MV, Zukin RS (1994) AMPA/kainate receptor gene expression in normal and Alzheimerʹs disease hippocampus. Neuroscience 61:41-49.

44. Peña F, Ordaz B, Balleza-Tapia H, Bernal-Pedraza R, Marquez-Ramos A, Carmona-Aparicio L, Giordano M (2010) Beta-amyloid protein (25-35) disrupts hippocampal network activity: role of Fyn-kinase. Hippocampus 20:78-96.

45. Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29:e45.

46. Pike CJ, Walencewicz-Wasserman AJ, Kosmoski J, Cribbs DH, Glabe CG, Cotman CW (1995) Structure-activity analyses of beta-amyloid peptides: contributions of the beta 25-35 region to aggregation and neurotoxicity. J Neurochem 64:253-265.

47. Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, Katz LC, LaMantia AS, McNamara JO, Williams SM (2001) Neuroscience 2th Edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates, Inc.

48. Rampon C, Tsien JZ (2000) Genetic analysis of learning behavior-induced structural plasticity. Hippocampus 10:605-609.

49. Santos-Torres J, Fuente A, Criado JM, Riolobos AS, Heredia M, Yajeya J (2007) Glutamatergic synaptic depression by synthetic amyloid beta- peptide in the medial septum. J Neurosci Res 85:634-648.

51. Selkoe DJ (2001) Alzheimerʹs disease: genes, proteins, and therapy.Physiol Rev 81:741-766.

52. Selkoe DJ (2002) Alzheimerʹs disease is a synaptic failure. Science 298:789-791.

53. Shankar GM, Bloodgood BL, Townsend M, Walsh DM, Selkoe DJ, Sabatini BL (2007) Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J Neurosci 27:2866- 2875.

54. Shankar GM, Li S, Mehta TH, Garcia-Munoz A, Shepardson NE, Smith I, Brett FM, Farrell MA, Rowan MJ, Lemere CA, Regan CM, Walsh DM, Sabatini BL, Selkoe DJ (2008) Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimerʹs brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med 14:837-842.

55. Soto C (2003) Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci 4:49-60.

56. Sultana R, Butterfield DA (2008) Alterations of some membrane transport proteins in Alzheimerʹs disease: role of amyloid beta-peptide. Mol Biosyst 4:36-41.

57. Terry RD (2004) Tangles precede plaques but donʹt cause them. Neurobiol Aging 25:741-742.

58. Tyszkiewicz JP, Yan Z (2005) beta-Amyloid peptides impair PKC- dependent functions of metabotropic glutamate receptors in prefrontal cortical neurons. J Neurophysiol 93:3102-3111.

59. Varadarajan S, Yatin S, Aksenova M, Butterfield DA (2000) Review: Alzheimerʹs amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity. J Struct Biol 130:184-208.

60. Walsh DM, Selkoe DJ (2004) Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimerʹs disease. Neuron 44:181-193.

61. Walsh DM, Selkoe DJ (2007) A beta oligomers - a decade of discovery. J Neurochem 101:1172-1184.

62. Weiner HL, Frenkel D (2006) Immunology and immunotherapy of Alzheimerʹs disease. Nat Rev Immunol 6:404-416.

63. Wenzel A, Scheurer L, Kunzi R, Fritschy JM, Mohler H, Benke D (1995) Distribution of NMDA receptor subunit proteins NR2A, 2B, 2C and 2D in rat brain. Neuroreport 7:45-48.

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