Der Einfluß des Radikal-Scavengers U74006F auf Mikrozirkulation, Leukozytenadhärenz und Plasmaextravasation im Mesenterium der Ratte

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung
1.1 Denotation und klinische Bedeutung: Sepsis, SIRS, MODS
1.2 Intestinale Mikrozirkulation bei Endotoxinämie
1.3 Sauerstoffradikale in der Pathogenese der Sepsis
1.4 U74006F - ein experimenteller Ansatz zur Sepsistherapie
1.5 Fragestellung der Arbeit

2 Material und Methodik
2.1 Versuchstiere
2.2 Chirurgische Eingriffe und Anästhesie
2.2.1 Implantation der intravasalen Katheter und Tracheotomie
2.2.2 Präparation des Mesenteriums
2.2.3 Induktion der Endotoxinämie
2.3 Technischer Versuchsaufbau
2.3.1 Experimentelles Monitoring
2.3.2 Intravitale Fluoreszenzmikroskopie und Videotechnik
2.3.3 Auswerteeinheit
2.4 Meßverfahren für die Mikrozirkulation
2.4.1 Messung der Erythrozytengeschwindigkeit
2.4.2 Leukozyten-Endothel-Interaktionen
2.4.3 Quantifizierung der Plasmaextravasation und der Gefäßdurchmesser
2.4.4 Hämatologische Parameter und Säure-Basen-Haushalt
2.5 Versuchsdesign
2.6 Statistische Analyse

3 Ergebnisse
3.1 Hämodynamische Parameter/ Vitalwerte
3.1.1 Arterieller Mitteldruck
3.1.2 Herzfrequenz
3.1.3 Atemfrequenz
3.1.4 Erythrozytengeschwindigkeit
3.1.5 Gefäßdurchmesser
3.1.6 Volumetrischer Blutstrom
3.1.7 Wandscherraten („shear forces“)
3.2 Leukozyten-Endothel-Interaktionen
3.2.1 Leukozytenadhärenz
3.2.2 Leukozytenemigration
3.2.3 Extravasation von FITC-markiertem Albumin
3.3 Hämatologische Analysen
3.3.1 Systemische Leukozytenzählung
3.3.2 Systemische Thrombozytenzahl
3.3.3 Hämoglobin, Hämatokrit, Erythrozytenzahl
3.4 Blutgasanalyse und Säure-Base-Status
3.4.1 pH-Werte
3.4.2 Arterieller Sauerstoffpartialdruck
3.4.3 Arterieller Kohlendioxid-Partialdruck

4 Diskussion
4.1 Kritik von Methodik und Materialien
4.2 Diskussion der Ergebnisse
4.2.1 Hämodynamik/ Vitalwerte
4.2.2 Leukozyten-Endothel-Interaktion
4.2.3 Plasmaextravasation (capillary leak)
4.2.4 Hämatologische Veränderungen
4.2.5 Blutgasanalyse und Säure-Basen-Haushalt

5 Zusammenfassung

6 Literaturverzeichnis

7 Lebenslauf

8 Danksagung

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 EINLEITUNG

1.1 Denotation und klinische Bedeutung: Sepsis, SIRS, MODS

Entzündungsreaktionen sind komplexe Antworten des Organismus auf verschiedenste endo- und e- xogene Noxen und Traumata. In Abhängigkeit von Dauer und Stärke der Noxe oder des Traumas sowie der Immunlage des Patienten kann sich dieser Zustand in systemischem Ausmaß manifestieren. Dieser Status der „Ganzkörperentzündung“ ist ein kongruentes klinisches Syndrom verschiedenster Ätiologien. So können ausgedehnte Ischämien, hämorrhagischer Schock, Pankreatitis, Polytrauma und Verbrennung ebenso wie verschiedene Infektionen (bakteriell, viral, parasitär) ab einem be- stimmten Ausmaß zu einem ähnlichen oder sogar identischen klinischen Bild führen. Dieser stereoty- pe Symptomenkomplex geht von einer exzessiven und inadäquaten Produktion von Entzündungsme- diatoren durch aktivierte Leukozyten aus und wird nach neuester, international gültiger Definition, un- abhängig von der Ursache, als SIRS (systemic inflammatory response syndrome) bezeichnet [Bone et al. 1992]. Die bisherige Uneinigkeit über das Krankheitsbild „Sepsis“ und seine Einschlußkriterien drückt sich unter anderem in international äußerst divergierenden Angaben zu Inzidenz und Mortalität aus. Daher wurde eine neue und differenzierte Begriffsbestimmung notwendig. Die Sepsis versteht sich nach dieser Definition der American Thoracic Society und der Society of Critical Care Medicine als Systemantwort auf eine Infektion und ist Teilbereich des SIRS. Einschlußkriterien sind Hypo- o- der Hyperthermie, Tachykardie, Hyperventilation und Leukozytose/Leukopenie, wobei zwei oder mehr Merkmale zutreffen müssen. Die Sepsis dient exemplarisch vielen experimentellen Modellen zur Erforschung der wahrscheinlich gemeinsamen Pathogenese und Pathophysiologie des SIRS. Es be- stehen hierbei keine klinischen, morphologischen oder biochemischen Unterschiede zwischen Patien- ten mit Sepsis (septischer Fokus und Bakteriämie) und SIRS (kein Fokus, keine Bakteriämie) [Nast- Kolb et al. 1991; Goris et al. 1985].

Infektionen und die daraus resultierenden systemischen Reaktionen des Körpers stellen immer noch eine der wichtigsten Ursachen nosokomialer Morbidität und Mortalität vor allem chirurgischer Pati- enten dar [Madoff et al. 1985]. In Industriestaaten entwickeln 5 bis 8 von 1000 hospitalisierten Pati- enten eine Sepsis [Martin 1991; Lode et al. 1989; Lode et al. 1983]. Die Prävalenz bei Intensivpati- enten liegt angesichts der meist schwerwiegenden Grundkrankheit und der bekannten Infektgefähr- dung kritisch Kranker höher und wird in der Literatur zwischen 3 % und 24 % [Brun-Buisson et al. 1995; Rangel-Frausto et al. 1995; Dragsted und Quvist 1989; Hennemann 1985], in einem Fall so- gar mit 49 % [Pittet et al. 1995] angegeben¹. Trotz neu entwickelter Antibiotika-Produkte und pro- gressiver Technik auf den Intensivstationen konnte die Mortalität der Sepsis in den letzten 30 Jahren nicht wesentlich gesenkt werden und liegt unverändert bei 10 bis 20 %, im Fall des septischen Schocks bei über 60 % [Gomez et al. 1995; McLauchlan et al. 1995; Ziegler et al. 1991; Centers for Disease Control 1990; Lode et al. 1989]. Die hohe Mortalität steht dabei nur mittelbar in Zu- sammenhang mit dem auslösenden Ereignis, da dieses mittlerweile durch intensive Therapie oft rasch beherrscht wird. Ebenso gibt es keine Korrelation mit dem Vorhandensein einer Bakteriämie - Pati- enten im SIRS mit positiven, respektive negativen Blutkulturen haben gleiche Mortalitätsraten - son- dern es ist hauptsächlich bedingt durch das Ausmaß der konsekutiven Organschäden [Brun-Buisson et al. 1995; Lode et al. 1989; Ponting et al. 1987; Goris et al. 1985]. Mit einer gewissen Latenz können sich Aktivierungs- und Kaskadensysteme verselbständigen und zur Insuffizienz einzelner Or- gane wie Lunge (ARDS), Niere und Leber sowie konsekutiv zum Versagen ganzer Organsysteme führen (Multiple organ failure - MOF, neuerdings MODS - Multiple organ dysfunction syndrome) [Bone et al. 1992]. Diese gefürchtete Komplikation ist mit einer Letalität von 30 bis 100 % die Haupttodesursache allgemeinchirurgischer und traumatologischer Patienten unter Intensivtherapie [Deitch 1992b; Ruokonen et al. 1991b; Goris et al. 1985b].

Gegenwärtig ist das Verhältnis von grampositiven zu gramnegativen Keimen etwa ausgeglichen, während noch vor 30 Jahren grampositive Erreger eindeutig dominant waren. Gleichzeitig nehmen nosokomiale Infektionen durch Erreger wie koagulase-negative Staphylokokken, methicillin-resistenter Staph. aureus (MRSA) und Enterokokken weltweit zu [Wildmer 1994].

1.2 Intestinale Mikrozirkulation bei Endotoxinämie

Man geht heute davon aus, daß für die Entwicklung des MODS primär Alterationen im Bereich der Mikrozirkulation pathogenetisch sind [Vollmar et al. 1993]. Diese können klinisch über die Normalisierung makrohämodynamischer Parameter hinaus andauern und durch direkte Effekte auf die zelluläre Ebene das Parenchym schädigen [Mebmer und Kreimeier 1989].

Eine besondere Rolle in der Entstehung dieses Organschadens kommt dabei den Leukozyten zu. Durch R. J. H. Dutrochet (1824) und W. Addison (1843) wurde erstmals beschrieben, daß einige zirkulierende weiße Blutzellen die Tendenz zeigen, an Wänden von Blutgefäßen zu haften, und daß sich die Zahl dieser adhärenten Zellen bei entzündlichen Prozessen stark erhöht [Grant 1973]. Die enorme pathologische Bedeutung, die den Leukozyten neben ihrer Rolle in der Infektabwehr für die Entwicklung einer systemischen Entzündungsreaktion (SIRS) zukommt, ist jedoch erst seit einiger Zeit in den Mittelpunkt der Sepsisforschung gerückt. Deutlich wird ihre Rolle für die Entwicklung ei- nes MODS in Studien, welche aufzeigen, daß durch blockierte Leukozytenadhärenz, entweder durch genetischen Adhäsionsmolekülmangel [Xu et al. 1994] oder durch experimentelle Leukopenie [Heath et al. 1986; Shasby et al. 1982; Flick et al. 1981; Heflin und Brigham 1981] ein Organscha- den verhindert werden kann. Weiterhin belegen Studien mit der endotoxinresistenten C3H/HeJ- Maus, daß ein Endotoxinschock ohne Zellen der hämatopoetischen Stammreihe nicht enstehen kann [Michalek et al. 1980]. Diese genmutierten Tiere mit einer LPS-Insensitivität überleben die Applika- tion immenser Endotoxindosen, erlangen jedoch wieder normale LPS-Sensitivität, wenn ihnen Kno- chenmark „gesunder“, endotoxin-empfindlicher Mäuse transplantiert wird [Ross et al. 1985; Watson et al. 1977].

Um ihre Aufgaben in der Infektabwehr zu erfüllen, sind Leukozyten mit einer Anzahl von bakteriziden Mechanismen ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, eine große Anzahl inflammatorischer Mediato- ren wie vasoaktive Substanzen, Peptide, Proteasen und reaktive Sauerstoffspezies zu generieren und freizusetzen [Fujishima und Aikawa 1995; Weiss 1989]. Den Leukozyten ist es möglich, die Gefäße zu verlassen [Harlan 1985] und auch im angrenzenden Gewebe ihrer Phagozytose-Tätigkeit nachzu- kommen. Dafür bedarf es zunächst jedoch einer Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten (PMN) zur Exprimierung von Adhäsionsmolekülen. Neben Zytokinen, vor allem TNF-a [Djeu et al. 1990], Komplementkomponenten, insbesondere C5a [Thijs und Hack 1992], und Platelet Activa- ting Factor (PAF) können auch mikrobakterielle Toxine (z.B. Peptoglykan von grampositiven Bakte- rien) diese Reaktion auslösen. Letztlich ist das Lipopolysaccharid (LPS) aus der Membran gram ne- gativer Bakterien (Endotoxin) jedoch einer der potentesten Trigger für diese Stimulation [Guthrie et al. 1984; Dahinden et al. 1983].

Endotoxin (ETX) ist ein thermostabiler Lipoprotein-Carbohydrat-Komplex und bewirkt neben di- rekten Schäden am Endothel [Meyrick et al. 1986] eine Anregung von Monozyten und Makropha- gen zur Freisetzung von Mediatoren [Michie et al. 1988]. Es wird entweder spontan durch Bakterien abgegeben [Andersen und Solberg 1984] oder infolge der Zellysis (z.B. durch Antibiotika) freige- setzt [Cohen und McConnell 1985]. Der Mechanismus der Erkennung von LPS weicht dabei vom üblichen „Ligand-Rezeptor“-Modell ab, da ein Plasmaprotein und ein Plasma/Membranglykoprotein involviert sind. Die Bindung von Endotoxin erfolgt dabei durch LPS-bindende Proteine (LBP), mit denen es Komplexe formt, an das membrangebundene Antigen (m)CD14 auf der Zelloberfläche von Makrophagen, Monozyten und stimulierten segmentkernigen Leukozyten [Schuman et al. 1990; Wright et al. 1990] sowie an den löslichen CD14-Rezeptor (sCD14) im Plasma [Wright 1995; Schütt und Schumann 1993; Schuman et al. 1990]. LBP in seiner Funktion wirkt dabei eher kataly- tisch für den Transport: LPS bindet an sCD14 auch in Abwesenheit von LBP [Sundan et al. 1994], jedoch mit viel geringerer Affinität. LPS-bindende Proteine fungieren auch als Opsonine - sie binden an die Oberfläche von Bakterien oder an LPS-beschichtete Erythrozyten und steuern so die Adhäsi- on dieser Partikel an Makrophagen [Wright et al. 1989]. Ob ohne Transportproteine oder beschleu- nigt durch LBP - die Komplexbildung von CD14 und LPS führt in jedem Fall zu einer Aktivierung der monocytären Zelle und veranlaßt diese zur weiteren Produktion proinflammatorischer Mediato- ren wie Zytokine (TNF-a, Il-1, Il-6), Eicosanoide, Komplementfaktoren, PAF, Phospholipase A2, freien Sauerstoffradikalen [Schütt und Schumann 1993; Wright et al. 1990] und Adhäsionsmolekü- len. Endothelzellen exprimieren zwar kein CD14 auf ihrer Oberfläche, reagieren dennoch genauso auf eine LPS-Exposition mit der Bildung von Adhäsionsmolekülen [Dustin und Springer 1988] sowie mit der Sekretion von Mediatoren [Jirik et al. 1989; Libby et al. 1986]. Für diese Immunantwort der Endothelzellen auf Endotoxin scheint das lösliche CD14 (sCD14) essentiell zu sein [Arditi et al. 1993].

Eine normale Leukozytenfunktion erfordert die Membranadhäsion an verschiedene Zellen und Gewebekomponenten. Adhäsion ist notwendig für Migration, Phagozytose, Emigration aus dem hämatopoetischen Pool, Anheftung an postkapilläre Venolen sowie Leukozyt-Leukozyt und LeukozytThrombozyt-Aggregation. Durch Untersuchungen an Patienten mit einem bestimmten genetischen Proteindefekt wurden eine Anzahl heterodimerer Glykoproteine entdeckt, die für eine Adhärenz essentiell sind [Harlan 1985; Ross et al. 1985].

Adhäsionsmoleküle können sowohl auf aktivierten Leukozyten als auch auf Endothelzellen exprimiert werden. Dabei sind drei Klassen von Adhäsionsmolekülen für Leukozyten-Endothel-Interaktionen bedeutend:

Selektine findet man sowohl auf Leukozyten, als auch auf Endothelzellen. Es können drei Unterklas- sen differenziert werden: E-Selektin (ELAM-1, CD62E), ein endotheliales Selektin, wird durch Sti- muli wie TNF-a, IL-1 und Endotoxin exprimiert und ist von einer de novo-Proteinsynthese abhän- gig. P-Selektin (CD62P,PADGEM,GMP-140) findet man auf Thrombozyten [Stenberg et al. 1985; Hsu-Lin et al. 1984] sowie in den Weibel-Palade-Körperchen von Endothelzellen [Bonfanti et al. 1989; McEver et al. 1989]. Von dort kann es nach entsprechender Stimulation (Histamin, TNF-a) schnell an die Zelloberfläche freigesetzt werden und zur Adhäsion von PMN beitragen [Patel et al.

1991; Geng et al. 1990]. L-Selektin (CD62L, LECAM-1) ist auf den meisten Lymphozyten, Neutrophilen und Monozyten präsent und hat besondere Bedeutung für frühe Stadien der PMNAdhäsion. Da L-Selektin nach initialer Aktivierung wieder durch Proteolyse abgestoßen werden kann, ist nach erfolgter Adhäsion eine erneute Ablösung der PMN vom Endothel möglich [Talbott et al. 1994; Berg und James 1990].

Unter dem Einfluß lokal freigesetzter inflammatorischer Mediatoren kommt es zu multiplen Interakti- onen der Selektine mit Carbohydrate-Gegenstrukturen und somit zur Verlangsamung vorbeifließen- der PMN. Zwar sind die Bindungskräfte nur von geringer Affinität, allerdings ist das „rolling“ der Leukozyten Voraussetzung für eine feste Adhärenz am Endothel, für die die Gruppe der Integrine bedeutsam ist [Ley et al. 1997; Talbott et al. 1994; Andrian von et al. 1991]. Die Integrine sind eine Gruppe von Transmembran-Proteinen und befinden sich auf der Oberfläche von allen Leukozyten. Sie besitzen eine gemeinsame b-Einheit und variable a-Einheiten. Momentan sind 8 b- und 15 a- Subeinheiten bekannt [Talbott et al. 1994]. Die wichtigsten Integrine für die Adhärenz von PMN am Endothel sind die b2-Integrine, die aus der gemeinsamen b-Untereinheit (CD18) und einer der drei a-Untereinheiten (CD11a, CD11b, CD11c) bestehen und somit ab-Heterodimere bilden. Dabei spielt der CD11b/CD18-Komplex die zentrale Rolle für die Leukozyten-Endothel-Interaktion, da aktivierte Leukozyten von diesem im Vergleich zu den beiden anderen Antigenen um Zehnerpotenzen mehr exprimieren. Er findet sich vor allem auf PMN, Monozyten und natural killer cells [Arnaout 1990]. Die Liganden für die leukozytären Integrine auf den Endothelzellen und damit dritte Gruppe von Adhäsionsmolekülen sind die Proteine der Immunoglobulin-Gruppe und zwar ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) und PECAM-1 (platelet-endothelial cell adhesion molecule, CD31). Die Expri- mierungsrate dieser Proteine steigt unter dem Einfluß inflammatorischer Stimuli (Endotoxin, TNF, IL- 1, IF) stark an. ICAM-1 ist Ligand für CD11a/CD18 und CD11b/CD18, während ICAM-2 nur mit CD11a/CD18 bindet. ICAM-1 und ICAM-2 sind bedeutsam für Adhäsion und Emigration von Neutrophilen [Smith et al. 1988], während PECAM-1 die transendotheliale Migration von adhären- ten PMN in vitro und in vivo erleichtern soll [Müller et al. 1993; Vaporciyan et al. 1993].

Neben hämodynamischen Veränderungen, die zur Abnahme der Wandscherraten insbesondere in postkapillären Venolen führen, ist es vor allem die Exprimierung von Adhäsionsmolekülen auf PMN und Endothelzellen, welche eine Margination von zumeist polymorphnukleären Neutrophilen (PMN) verursacht [Tangelder et al. 1995]. Physiologischerweise kommt es durch die verlangsamte Fließge- schwindigkeit in Venolen gelegentlich zur lockeren Adhärenz („rolling“), aber nur selten zum manifes- ten Anheften („sticking“) dieser Leukozyten an das Endothel der Gefäße. Diese Adhärenz ist jedoch zufällig und eine normale Leukozytenfunktion erfordert diese Membranadhäsion an andere Zellen (Leukozyt-Leukozyt, Leukozyt-Thrombozyt) sowie an Gewebebestandteile. Sie ist Bedingung für Phagozytose und Emigration und somit essentiell für die immunologische und antimikrobielle Tätigkeit der Granulozyten. Im Rahmen des SIRS versagt jedoch diese Regulation und es kommt zur massiven Adhärenz von PMN am Endothel. Diese überschießende, inadäqate Aktivierung resultiert in einer enormen Steigerung des O2-Verbrauchs („respiratory burst“) und der Produktion von reaktiven Sauerstoffverbindungen [Kurose et al. 1993; Redl et al. 1993; Clark 1990] sowie Mediatoren und zytotoxischen Substanzen, die als hauptverantwortlich für den sepsisbedingten Endothelschaden gel- ten. Sie werden aus den granulozytären Lysosomen durch Exozytose in das extrazelluläre Milieu [Fu- jishima und Aikawa 1995; Weiss 1989] und durch die Haftung an der Gefäßwand unmittelbar an den Endothelzellen freigesetzt. Für den resultierenden Zellschaden sind dabei primär zwei Klassen von leukozytären Inhaltsstoffen relevant: proteolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffverbindungen [Weiss 1989]. Die freigesetzten Produkte des Arachidonsäurewegs führen zur Adhärenz -„sticking“- von weiteren Zellen [Gurtner und Burke-Wolin 1991], so daß letztlich ein circulus vitiosus entsteht. Daß bei diesem komplexen klinischen Bild Antibiotika nur in einzelnen Fällen (nachgewiesene Infek- tion als Ursache des SIRS) und auch dann nur bedingt (Freisetzung von Endotoxin in großen Men- gen durch Antibiotika-induzierte Bakteriolyse) nützlich sind, gilt als erwiesen [Dofferhoff und Buys 1995].

Seit einiger Zeit konzentriert sich die Sepsisforschung daher auf Therapieansätze in der Immun- und Mediatormodulation.

1.3 Sauerstoffradikale in der Pathogenese der Sepsis

Zu den prinzipiellen Mechanismen, mit denen Granulozyten im Rahmen akuter inflammatorischer Re- aktionen zum Gewebeschaden beitragen, zählt neben der extrazellulären Sekretion lysosomaler En- zyme [Harlan 1985] auch die Produktion reaktiver Sauerstoffradikale. Diese werden im Verlauf ent- zündlicher Prozesse aus aktivierten neutrophilen Granulozyten freigesetzt und ihre Quantität ist so z.B. bei septischen Patienten stark erhöht [Machiedo et al. 1989; Takeda et al. 1984]. Die mehrfach ungesättigten W-6- und W-3-Fettsäuren (PUFA) von Biomembranen sind sensitive Angriffspunkte für die hochreaktiven Sauerstoffradikale und können durch diese in einer Kettenreaktion degeneriert werden (Lipidperoxidation). Die Integrität der Endothelmembranen wird dadurch derart verändert, daß ein lokales kapilläres Leck mit Austritt von Granulozyten (Migration), Flüssigkeit und Makromo- lekülen in das Interstitium entsteht [Weiss 1989; Shasby et al. 1983]. Die Folge ist ein Zellschaden in primär nicht infiziertem Gewebe und später das Versagen von multiplen Organen [Lehr und Arfors 1994; Hernandez et al. 1987]. Der Zytotoxizität von Sauerstoffradikalen steht in vivo eine Anzahl von körpereigenen protektiven Mechanismen und Substanzen wie Glutathion, a-Tocopherol, As- corbinsäure und anderen intrazellulären antioxidativen Substanzen [Hoover et al. 1988] oder der Scavenging-Effekt von Erythrozyten [Forslid et al. 1989] gegenüber, so daß Gewebeschäden durch Radikale letztlich das Ergebnis einer Imbalance zwischen prooxidativen und antioxidativen Substan- zen sind.

Vorläufer dieser hochreaktiven Oxidantien ist das Superoxid-Radikal (O2-), welches vor allem wäh- rend der Reaktion von Hypoxanthin zu Xanthin durch die Xanthin-Oxidase entsteht und physiolo- gischerweise auch von Endothelzellen in geringem Ausmaß produziert wird [Ratych et al. 1987].

1.4 U74006F - ein experimenteller Ansatz zur Sepsistherapie

Die bekannten inhibitorischen Effekte ultrahoher Steroid-Dosen auf die Initation und Propagation der Lipidperoxidation im ZNS [Hall 1992; Hall 1982] führten 1987, ausgehend vom Methylprednisolon, zur Entwicklung einer Substanz, die imstande war, Sauerstoffradikale zu neutralisieren und die Lipid- peroxidation zu hemmen [Hall et al. 1987]. Die Substitution von Aminogruppen am 21- Kohlenstoffatom des Methylprednisolon inaktiviert den Kortikosteroid-Rezeptor und steigert die in- hibitorische Lipidperoxidations-Potenz der Substanz im Vergleich zu Methylprednisolon um den Faktor 10⁴ [Braughler et al. 1987b].

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Abbildung 1-1- Methylprednisolon

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Abbildung 1-2- Tirilazadmesylate

Die Substanz U74006F, 21-[4-(2,6-di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]-16a-methyl- pregna-1,4,9(11)-triene-3,20-dione monomethansulfonate oder Tirilazad (Freedox®, Fa. Upjohn, Kalamazoo, USA) gehört zur Klasse der 21-Aminosteroide (Lazaroide). Diese Gruppe von chemi- schen Verbindungen besitzt antiinflammatorische Potenz auf das zentrale Nervensystem, jedoch ohne die klassischen gluko- oder mineralokortikoiden Effekte von Methylprednisolon [Buttgereit et al. 1995; Braughler et al. 1987; Braughler et al. 1987] und wurde ursprünglich zur Akuttherapie ischä- mischer und traumatischer Läsionen des zentralen Nervensystems entwickelt [Hall et al. 1984]. In verschiedenen Tiermodellen zu Ischämie-Reperfusion und Sepsis wurde gezeigt, daß Tirilazad fähig ist, Lipid-Peroxyl- und Phenoxyl-Radikale zu neutralisieren [Braughler und Pregenzer 1989], die Akkumulation von neutrophilen Granulozyten zu vermindern [Semrad et al. 1993] und endotheliale Strukturen zu schützen [Eversole et al. 1993; Stanley et al. 1993; Braughler und Pregenzer 1989]. Weiterhin supprimiert es die Produktion von Eicosanoiden und TNF - wichtige Mediatoren für die Ausbildung der Sepsis - [Semrad et al. 1993], verhindert weitgehend das Entstehen einer Laktatazi- dose [Zhang et al. 1995; Rose und Semrad 1992] und erhöht signifikant die Überlebensrate nach ei- ner Endotoxinämie bei Hunden, Kälbern und Ratten [Zhang et al. 1995; Rose und Semrad 1992; Powell et al. 1991]. Eine aktuellere Studie konnte zeigen, daß Tirilazad zwar keinen Einfluß auf die sepsisspezifische Hämodynamik hat, aber eine akute Lungenschädigung bei Sepsis verhindert [Na- kayama et al. 1998]. In vitro -Studien zeigten, daß sich U74006F durch den hoch-lipophilen Ste- roidteil in Membranen einlagert und die antioxidative Aktivität im wesentlichen auf folgenden Mecha- nismen beruht:

(1) Abfangen („Scavenging“) von Produkten der Lipid-Peroxidation
(2) Scavenging von verschiedenen Sauerstoffradikalen
(3) Erhöhung der Membran-Rigidität und -stabilität
(4) Potenzierung der antioxidativen Wirkung von a-Tocopherol (Vitamin E)
(5) Reduktion der Freisetzung von Peroxidations-induzierter Arachidonsäure

[Braughler und Pregenzer 1989a; Braughler et al. 1987a; Braughler et al. 1987a]

Tirilazad ist unter dem Handelsnamen Freedox" in großen Teilen Europas (u.a. Österreich, Schweiz, Schweden, Dänemark, Norwegen, Finnland, Ungarn, Polen) als Antioxidant nach Aneurysma- bedingter Subarachnoidalblutung (SAB) bei männlichen Patienten zugelassen. Bei dieser Indikation konnte die Mortalität um 88 % gesenkt werden [Kassell et al. 1996]. Frauen metabolisieren die Substanz wesentlich schneller als Männer, so daß bei ihnen eine höhere Dosierung angebracht ist.

1.5 Fragestellung der Arbeit

Der Einfluß von U74006F auf eine Adhärenz von Leukozyten an das Endothel und eine eventuell damit verbundene Plasmaextravasation bei einer Endotoxinämie sind bisher in vivo nicht geprüft worden. Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit den Einfluß von Tirilazad auf die LeukozytenEndothel-Interaktion, das makromolekulare Leakage und die Mikrohämodynamik während des bakteriellen Endotoxinschocks zu untersuchen. Dafür nutzten wir die Möglichkeit der in vivo Videomikroskopie postkapillärer Venolen. Da es sich bei der Sepsis um ein komplexes, systemisches und multifaktorielles Krankheitsbild mit vielen Variablen handelt, welches sich mit in vitro Zellstudien oder Computermodellen nicht befriedigend reproduzieren läßt, war der Einsatz eines Tiermodells in diesem Zusammenhang unerläßlich.

2 MATERIAL UND METHODIK

2.1 Versuchstiere

Die in die Versuchsreihe aufgenommenen männlichen Wistar-Ratten waren zum Zeitpunkt der Untersuchung 8-10 Wochen alt. Ihr Körpergewicht betrug 200 bis 300g. Im Tierstall herrschten eine Umgebungstemperatur von 25 °C und eine Luftfeuchtigkeit von 50 %. Die Tiere hatten in ihren Käfigen bis 12 Stunden vor Versuchsbeginn freien Zugang zu Futter (Altromin 1324-Haltungsdiät für Ratten und Mäuse, Altromin GmbH, Lage, BRD), Wasser ad libitum und waren einem 12stündig wechselnden Hell-Dunkel-Rhythmus ausgesetzt.

Die Tiere standen unter ständiger veterinärmedizinischer Kontrolle der Versuchstieranlage im Theoretikum der Universität Heidelberg; die Anforderungen nach § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz wurden bei den Experimenten eingehalten.

2.2 Chirurgische Eingriffe und Anästhesie

Alle chirurgischen Präparationen am Tier wurden in Allgemeinanästhesie durchgeführt. Dazu war es nötig, das Tier zunächst in einer Inhalationsanästhesie (Äther zur Narkose, Hoechst AG Frankfurt, BRD) in ausreichender Sedierung zu wiegen und schließlich mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobar- bital (Nembutal", Sanofi, Düsseldorf, BRD), intraperitoneal injiziert, zu anästhesieren. Im Laufe des Versuchs konnte die Anästhesie nachlassen. Die Narkosetiefe wurde daher kontinuierlich mit dem Zwischenzehen- und Ohrreflex überprüft. Bei positivem Reflex erfolgte eine Nachinjektion von 0,6 mg Pentobarbital intravenös.

2.2.1 Implantation der intravasalen Katheter und Tracheotomie

Nach Rasur und Desinfektion des Präparationsfeldes wurde die Haut am Hals etwa 1 cm quer inzi- diert. Danach wurden die Vena jugularis externa dextra und die Arteria carotis communis sinistra schonend freipräpariert, mit Seidenfäden der Stärke 6/0 kranial ligiert und kaudal angeschlungen. Nun wurden die Gefäße mit einer Pinzette angehoben und mit einer mikrochirurgischen Schere einge- schnitten. Mit einer Katheter-Einführhilfe wurde je ein mit 0,9% NaCl-Lösung gefüllter Polyethylen- katheter (Venenkatheter; Innendurchmesser 0,5 mm, Außendurchmesser 0,9 mm, B.Braun AG, Melsungen, BRD) bis in die Vena cava superior bzw. den Arcus aortae vorgeschoben. Die Aspirati- on von Blut (venös) bzw. eine pulsierende Blutsäule im Katheter (arteriell) zeigten die intravasale Po- sition an. Der vorgelegte kaudale Knoten konnte nun geknüpft und die Gefäße somit fixiert werden. Als nächstes wurde die Trachea dargestellt, an einer Knorpelspange eingeschnitten und ein Silikonschlauch von 2 mm Durchmesser etwa 0,5 cm bis zur Bifurcatio tracheae vorgeschoben. Kondensierung am Katheter und symmetrische Atemexkursionen zeigten die korrekte Lage des Tubus an. Der Tubus wurde abschließend in der Trachea fixiert (Seide, 6/0) und die Halsinzision mit Einzelknopfnähten (Vicryl, geflochten, 4/0) verschlossen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-1: Darstellung der Präparation mit zentralen Kathetern in Vena jugularis externa und Arteria carotis, Tracheotomie und Intubation sowie Verschlußder Inzision mit Seidenfäden 4/0

2.2.2 Präparation des Mesenteriums

Die Präparation erfolgte in Anlehnung an die von Zweifach etablierte Methode [Zweifach 1973]. Nach Rasur und Desinfektion wurde das Abdomen über eine mediane Laparotomie eröffnet. Um auch kleinste Blutungen zu vermeiden, die eine spätere Mikroskopie unmöglich machen würden, wurden nach der Hautpräparation Muskulatur und Peritoneum im Bereich der Linea alba mit dem e- lektrischen Messer (T400C, Erbe Elektromedizin GmbH, Tübingen, BRD) auf einer Länge von etwa 1 cm durchtrennt. Danach wurde eine terminale Ileumschlinge mit dem dazugehörigen Meso kurz vor dem Coecum aufgesucht und sehr vorsichtig mit zwei Stieltupfern ausgelagert. Dabei wurde beson- ders darauf geachtet, daß es zu keiner Torsion des Darmes oder zur Kompression von Gefäßen kam. Der letzte Mesoileumbereich proximal des Caecums ist besonders gut und konstant kapillarisiert: Die für die Untersuchung prädestinierten Kapillargefäße durchziehen hier das transparente Meso, wo sie nicht von Fettzellen umgeben sind und somit ohne weitere Präparationen der Untersuchung zugänglich sind. Meist findet man sie in der Nähe der größeren Arkadengefäße des Ileums, wo man sie mit bloßem Auge gerade noch erkennen kann. Es war daher möglich, schon während der Präparation die später zu mikroskopierenden Gefäße auszuwählen und andere Darmabschnitte im physiologischen Milieu des Abdomens zu belassen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-2: Kapillargef äß e im Mesenterium, Vergr öß erung ca. 40-fach

2.2.3 Induktion der Endotoxinämie

Nach Beendigung der Präparationen und den Basismessungen zum Zeitpunkt 0 min wurde Lipopoly- saccharid von Escherichia coli, Serotyp 026:B6 (L-3755; Sigma Chemicals, Deisenhofen, BRD) in 0,9 % NaCl-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,4mg/ml, 10⁷ IU LPS/mg gelöst und durch kontinuierliche intravenöse Infusion (Compact Infusion Pump, Model 975, Harvard Apparatus Inc., Southnatick, USA) von stündlich 2 mg/kg/Körpergewicht eine Endotoxinämie induziert. Die Tiere der Kontrollgruppe D erhielten äquivalente Volumina 0,9 % NaCl-Lösung infundiert.

2.3 Technischer Versuchsaufbau

2.3.1 Experimentelles Monitoring

Das Tier wurde nach den Präparationen auf eine spezielle Plexiglas-Bühne gelegt, wo es fixiert und das ausgelagerte Mesenterium auf einer Mikroskopierfläche von etwa 4 cm² ausgelagert werden konnte. Es wurde sofort begonnen, den Darm mit einer bikarbonat-gepufferten und mit CO2 und N2 im Verhältnis 5 % : 95 % äquilibrierten Elektrolytlösung (Ringer®) zu superfundieren. Diese Superfusionslösung wurde mit einem Temperaturregelverstärker (Fa. Böhm, Malsch, BRD) kontinuierlich gemessen und konstant auf 37° C gehalten.

Eine rektale Temperatursonde und der arterielle Katheter wurden zur kontinuierlichen Überwachung von Kerntemperatur und arteriellem Mitteldruck über entsprechenden Aufnehmer (Medex Transdu- cer MX 860, Fa. Corotec Medizintechnik GmbH, Klein-Winternheim, BRD) an einen Überwa- chungsmonitor (Servomed-Monitor, Hellige GmbH, Freiburg, BRD) angebracht. Anhand der Peaks der arteriellen Druckkurve ließ sich simultan die Anzahl der Kontraktionen und somit die Herzfre- quenz auszählen.

2.3.2 Intravitale Fluoreszenzmikroskopie und Videotechnik

Bei dem verwendeten Mikroskop handelte es sich um ein für unsere Abteilung modifiziertes Intravitalmikroskop (Orthoplan; Leica GmbH, Wetzlar, BRD), für das wir ein Wasserimmersions-Objektiv (Achroplan 40/0.75W; Zeiss, Jena, BRD) benutzten. Das ausgelagerte Mesenterium wurde für die Leukozytenzählung durch Transillumination mit einer 150 Watt Halogen-Kaltlichtquelle (KL 1500 e- lectronic; Schott, Wiesbaden, BRD) betrachtet.

Für die Darstellung der Fluoreszenzmarker (Erythrozytengeschwindigkeit, Plasmaextravasation) nutzten wir einen Fluoreszenz-Auflicht-Illuminator (Ploemopak 2; Leica, Wetzlar, BRD) mit einer Quecksilber-Höchstdrucklampe (100W2; Osram, München, BRD), einen I3-Filterblock zur Blauanregung und einen N2.1-Filterblock zur Grünanregung (Leica GmbH, Wetzlar, BRD). Um die Präparation und die Filter zu schonen, wurde ein Hitzeschutzfilter (KG1; Leica GmbH, Wetzlar, BRD) in den Strahlengang eingebracht.

Die mikroskopischen Bilder wurden durch eine hochempfindliche schwarz-weiß-Restlichtkamera (CF 8/1; Kappa Meßtechnik, Gleichen, BRD) mit einer Geschwindigkeit von 50 Halbbildern pro Sekunde aufgenommen. Die Bilder konnten gleichzeitig auf einem Trinitron-Monitor (PVM 1444QM; Sony Corp., Tokyo, Japan) betrachtet und mittels eines Super-VHS-Recorders (AG- 7350-E; Panasonic-Matsuhita Corp., Osaka, Japan) auf Videobänder (S-VHS 180 min, Maxell, Japan) aufgezeichnet werden. Mit einem Videozeitgenerator (TC-30-Generator; Alpermann und Velte) konnten weiterhin aktuelles Datum, Zeit und Versuchsnummer in das Bild eingeblendet und aufgezeichnet werden. Somit war es einerseits möglich, die entsprechenden Videos für die Auswer- tung zu identifizieren und andererseits auch in veränderter Abspielgeschwindigkeit („slow-motion”) eine genaue Zeitaussage zu ermöglichen. Eine Venole mit einem mittleren Durchmesser von 30 µm stellte sich auf dem Monitor mit einem Diameter von ca. 3 cm dar. Die absolute Vergrößerung der Mikroskop-Monitor-Einheit kann daher mit etwa 1000fach angegeben werden. Durch die Wahl des Objektivs, die Super-VHS-Technik und hochauflösende Monitore konnten Abstriche im Auflö- sungsvermögen, welche durch die enorme Vergrößerung und die Aufzeichnung der Aufnahmen auf Videoband entstanden, verringert werden.

2.3.3 Auswerteeinheit

Die aufgezeichneten Videos wurden nach dem Experiment („Off-Line“) mittels eines S-VHS- Videorecorders in einen Personalcomputer (486 DX, 33MHz, 8MB RAM) eingelesen. Mit einer speziellen Software für die Mikrozirkulationsanalyse (CAPIMAGE; Ingenieurbüro Dr. Zeintl GmbH, Heidelberg, BRD) wurden die Videos ausgewertet. Dazu wurden die entsprechenden Videobilder im Rechner digitalisiert, auf einem Großmonitor wiedergegeben und konnten mit einem Grafiktablett (Graphic Table MM III 1201, Summa Graphics, Seymour, USA) und einer „Maus“ bearbeitet wer- den.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-3 - Schematischer Meßplatzaufbau (nach Secchi 1997)

Insgesamt ermittelten wir folgende Parameter, die im einzelnen noch erläutert werden:

- Geschwindigkeit einzelner Erythrozyten
- Zahl der adhärenten Leukozyten
- Zahl der emigrierenden Leukozyten
- Durchmesser postkapillärer Venolen und
- Extravasation von Plasma.

2.4 Meßverfahren für die Mikrozirkulation

Zur Erfassung der Mikrozirkulation in den postkapillären Venolen nutzten wir die Möglichkeit, korpuskuläre Bestandteile des Blutes sowie Plasma mit Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren, so kontrastiert mikroskopisch darzustellen und simultan auf Video aufzuzeichnen. Mit geeigneter Software können diese Videos ausgewertet und verschiedenste Parameter ermittelt werden, wodurch sich quantitative und qualitative Aussagen über die Mikrozirkulation treffen lassen.

2.4.1 Messung der Erythrozytengeschwindigkeit

Die mittlere Geschwindigkeit der Erythrozyten (v RBC) wurde „Off-Line“, also nach dem eigentlichen Versuch, nach der “Frame-to-Frame”-Methode bestimmt. Dafür mußten zunächst die Zellen vor dem Versuch markiert werden:

Erythrozyten von Spenderratten wurden mit einem rot fluoreszierenden Membranfarbstoff (Red fluo- rescent cell linker kit PKH26-GL; Sigma Chemical, Deisenhofen, BRD) nach einer Methode von Horan et al. 1994 konjugiert. Für die Färbung modifizierten wir die Methode für unsere Belange wie folgt:

Der Spenderratte wurden unter Heparinzusatz ca. 2 ml Blut über den zentralen arteriellen Katheter entnommen. Dieses Vollblut wurde mit einer temperaturgeregelten Zentrifuge bei 25°C und 2000 U/min für 10 Minuten separiert und das Plasma danach abpipettiert. Nun folgte eine Suspensierung des Zellpellets in 10 ml saurem "Alsever"-Puffer:

Zusammensetzung von Alsever`s Puffer in 1000 ml Aqua dest.:

- 20,50 g Dextrose
- 8,00 g Zitronensäure-[trisodium salt dihydrate] (C-7254; Sigma Chemical, Deisenhofen, BRD)
- 0,55 g Zitronensäure [Free acid, anhydrous] (C-0759; Sigma Chemical Deisehofen, BRD)

Mit NaOH und HCl auf pH 6,2 und mit NaCl auf 290 mosm eingestellt.

Dieser "Waschvorgang" wurde insgesamt dreimal durchgeführt und anschließend einmal mit einem alkalischen "Bicine"-Puffer wiederholt.

Zusammensetzung von Bicine-Puffer in 1000 ml Aqua dest.:

- 3,264 g Bicine [N,N-bis(2-Hydroxyethyl)glycin] (B-3876; Sigma Chemicals, Deisenhofen, BRD)
- 7,815 g NaCl
- 10,0 ml 1N NaOH

Mit NaOH auf pH 8,3 und mit NaCl auf 290 mosm eingestellt.

Der letzte Überstand wurde möglichst vollständig abpipettiert. Die verbliebenen Zellen wurden zu 5 µl PKH-26-Farbstoff, der in 1 ml "Diluent C" gelöst war, gegeben. Nach 5 Minuten stoppt man die Färbung durch Zugabe von äquivalenter Menge Plasma. Nach einer weiteren Minute Inkubation wurden die gefärbten Erythrozyten erneut in 10 ml Bicine-Puffer suspendiert, danach zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Dieser Waschvorgang wiederholte sich mindestens 5 mal bzw. solange, bis der Überstand frei von Farbstoff war. Danach wurden die Zellen wieder mit 0,9 % NaCl-Lösung in gleichem Volumenverhältnis resuspendiert. Diesem Gemisch wurde CPD (Citrat-phosphat- dextrose; C-7165, Sigma Chemicals, Deisenhofen, BRD) im Verhältnis 10 : 1,4 zur Antikoagulation und zur Deckung des Energiebedarfs der Erythrozyten zugesetzt. Die gefärbten Zellen wurden unter Lichtschutz und bei 1 - 6 °C aufbewahrt und konnten ca. 10 Tage verwendet werden. Der Farbstoff wird von den Zellen aufgenommen und es resultiert eine starke und stabile Fluoreszenz im Grünlicht. Die so präparierten Erythrozyten wurden den Versuchstieren vor Beginn des Experiments in einer Menge von 0,5 ml/kg Körpergewicht intravenös injiziert. Unter entsprechender Grünanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop konnten nun im Blutstrom einzelne fluoreszierende Erythrozyten dargestellt werden.

Für die Geschwindigkeitsmessung nutzten wir das rechnerunterstützte Mikrozirkulations- Analysesystem CAPIMAGE (Ingenieurbüro Dr. Zeintl GmbH, Heidelberg, BRD) und die zu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Beginn der Endotoxin-Infusion aufgenommenen Videos. Der Computer übernimmt vom laufenden Videofilm Bildpaare (Frames) mit festgelegtem Zeitabstand und legt sie digitalisiert als zwei Einzelbilder zur Bearbeitung ab. Nach Starten des Pro- gramms konnte mit dem Digitalisierbrett und einem Fadenkreuzkursor ein einzelner fluoreszierender Erythrozyt markiert werden, und der Computer präsentierte sofort das zweite gespeicherte, digitale Bild. Der eben gekennzeichnete Erythrozyt hat eine neue Position und wird erneut markiert. Danach erscheint wieder das erste Bild, und ein weiterer Erythrozyt kann markiert oder das Videoband mit- tels Zufallsgenerator an eine neue Stelle vorgespult werden. Die Distanz (s) von der Position des E- rythrozyten im ersten Bild zur Position desselben Erythrozyten im zweiten Bild, dividiert durch das bekannte Zeitintervall zwischen den Bildern (t = 20 ms), ergibt die Geschwindigkeit (vRBC) .

Durch die Mittelung von 10 bis 20 Erythrozyteneinzelmessungen an verschiedenen Gefäßpositionen erhält man die Mittlere Erythrozytengeschwindigkeit (v RBC). Den Volumetrischen Blutstrom (Q V) bestimmt man aus dem Produkt von v RBC und der Venenquerschnittsfläche unter der Annahme, daß die Blutgefäße uniform sind, annähernd zylindrische Form besitzen und D v der Durchmesser des Gefäßes ist: [Endrich 1988; Koo und Liang 1979].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Wandscherrate bezieht sich auf die hydrodynamische Kraft, mit der ein Leukozyt passiv vom Blutstrom bewegt und somit vom Endothel abgelöst wird. Sie ist abhängig vom Durchmesser des Gefäßes und der Blutzellgeschwindigkeit und ergibt sich, basierend auf der Newtonschen Definition über laminare Strömungen [Lipowsky et al. 1988; House und Lipowsky 1987]:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4.2 Leukozyten-Endothel-Interaktionen

Das Verhalten der Leukozyten wurde mittels Transilluminations-Mikroskopie dargestellt. Die Zahl der adhärenten und emigrierenden Leukozyten wurde off-line durch die Wiedergabe der Videobilder ermittelt. Leukozyten galten als adhärent („Sticker“), wenn sie sich in einem Zeitraum von 30 Sekun- den weder bewegten noch vom Endothel ablösten und wurden als Zellen pro Quadratmillimeter Ge- fäßinnenfläche ausgedrückt. Emigrierende Leukozyten definierten sich dann als neu erscheinende Leukozyten außerhalb der Venole. Auch sie wurden ausgedrückt als Zellen pro Quadratmillimeter Gefäßoberfläche.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-4: Darstellung von locker adhärenten PMN - "Rollern" - (schwarze Pfeile) und fest anhaftenden "Stickern" (weiße Pfeile). Adhärente PMN sind eindeutig zu identifizieren, da sich Erythrozyten aufgrund ihrer hö- heren Geschwindigkeit nicht darstellen (nach Secchi 1997).

2.4.3 Quantifizierung der Plasmaextravasation und der Gefäßdurchmesser

Eine im Verlauf der Sepsis auftretende Schädigung des Endothels zeigt sich unter anderem als Austritt von Plasma in das Interstitium. Um dieses „Leck“ entlang der Mesenterialvenolen zu quantifizieren, wurde den Tieren 15 Minuten vor jedem Experiment 50 mg/kg Körpergewicht Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiertes bovines Albumin (FITC-Albumin; Sigma Chemicals, Deisenhofen, BRD), gelöst in 0,9 % NaCl-Lösung, intravenös injiziert. Dadurch stellte sich unter Blauanregung ein optimaler Kontrast zwischen dem Interstitium (dunkel) und den plasmadurchströmten Gefäßen (hell) dar. Plasmaaustritte wurden nun un- ter monochromatischem Licht als fluoreszierende Bereiche im Interstitium entlang der Venole sichtbar. Weiterhin war es mit dieser Methode möglich, die Gefäße computerunterstützt exakt zu vermessen sowie Aussagen über die Gefäßmorphologie zu treffen. Die auf Video aufgenommenen Fluoreszenz-Bilder wur- den digitalisiert und mit einem computerunterstützten Mikrozirkulations-Analyse-System (CAPIMAGE; In- genieurbüro Dr. Zeintl GmbH, Heidelberg, BRD) ausgewertet. Für die Quantifizierung der Extravasation wurde dabei wie folgt verfahren: Der Fluoreszenz-Intensität im Gefäß und angrenzenden Gewebe wurden vom Computer Grauwerte von 1 (schwarz, keine Fluoreszenzaktivität) bis 255 (weiß, maximale Fluores- zenz) zugeordnet. Jede Venole wurde in Einzelsegmenten gemessen: jeweils drei im Gefäß selbst [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] sowie drei im direkt angrenzenden Interstitium [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] entlang der Venole. Die Werte wurden jeweils gemittelt und die Albumin-Extravasation als Verhältnis der intravasalen zu den interstitiellen Grauwerten [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] zu den [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Beginn der Endotoxin-Infusion angegeben.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-5 - Darstellung einer postkapillären Venole (d=30 µ m) markiert mit FITC-Albumin. Extravasation des Markers nach 2 h Endotoxinapplikation im rech- ten Bild. Vergr öß erung etwa 1000-fach.

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¹ Die unterschiedlichen Angaben beruhen hauptsächlich auf den verschiedenen Sepsis-Definitionen der Autoren und der diffe- rierenden Zusammensetzung der Intensivstationen hinsichtlich des Krankengutes.