Untersuchung zur Charakterisierung schneller Denaturierungskinetiken von Enzymen im Zeitbereich von Millisekunden bis Sekunden

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Theorie
2.1 Wärmeleitung und thermische Relaxationszeit
2.2 Bewegungsgleichung eines Fluids
2.3 Bewegungsgleichung eines fallenden Wassertropfens
2.4 Das Cr,Tm,Ho:YAG Lasersystem
2.5 Lichtverteilung in Tropfen bei Bestrahlung
2.6 Thermische Proteindenaturierung
2.7 Das Modellenzym alkalische Phosphatase
2.8 Nachweis der Proteinaktivität

3 Temperatursprungexperimente mit Kapillaren
3.1 Konzept
3.2 Material und Methoden
3.3 Ergebnisse
3.4 Diskussion

4 Laserinduzierter Temperatursprung in kleinen Wassertrop- fen
4.1 Konzept
4.2 Vorversuche
4.3 Konstruktion der klimatisierten Fallstrecke
4.4 Test der klimatisierten Fallstrecke
4.5 Diskussion

5 Zusammenfassung und Ausblick

6 Anhang

7 Danksagung

8 Literaturverzeichnis

1 Einleitung

Seit den 60er Jahren wird in vielen Gebieten der Medizin die lineare Absorpti- on des Laserlichts im Gewebe benutzt, um dort gezielt Energie zu deponieren, die dann eine Koagulation oder Ablation bewirken. Bei Fokussierung des La- serlichts liegt die untere Grenze für die Präzision thermischer Gewebseffekte aufgrund der Beugung des Lichts bei 0, 5 bis 1 µm. Durch die selektive Ab- sorption der Laserstrahlung in bestimmten Zielstrukturen im Gewebe kann im Prinzip die räumliche Präzision der Energiedeponierung weiter erhöht werden. Die Laserenergie wird dabei nur am Ort der absorbierenden Struktu- ren deponiert, deren räumliche Ausdehnung damit die prinzipiell erreichbare Präzision vorgibt. Die Temperaturerhöhung in die umgebenden Areale durch Wärmeleitung kann weitgehend vermieden werden, wenn die Laserpulsdauer die thermische Relaxationszeit des Absorbers nicht übersteigt (sog. ther- mischer Einschluß)²¹. Die thermische Relaxationszeit skaliert dabei mit dem Quadrat des Absorberdurchmessers und ist umgekehrt proportional zu den Wärmeleitungseigenschaften des Absorbermediums. In der Lasermedi- zin wird dieses Prinzip unter anderem bereits bei der selektiven Schädigung stark absorbierender Zellen im retinalen Pigmentepithel ausgenutzt⁷.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Entwicklung ei- nes Temperatursprungexperiments sind Teil eines von der Deutschen For- schungsgemeinschaft geförderten Projekts über laser-induzierte thermische Gewebseffekte. Ziel dieses Projektes ist es, grundlegende Erkenntnisse über laser-induzierte thermische Gewebseffekte bei kurzzeitigem Erhitzen des Ge- webes zu erlangen. Als Schadensmechanismus bei thermischer Zellschädigung wird allgemein eine Denaturierung der in der Zelle enthaltenen Proteine an- genommen. Die Frage, inwieweit Gewebe und Zellen sich thermisch selektiv schädigen lassen, ist also über die Notwendigkeit eines thermischen Einschlus- ses direkt an die Frage gekoppelt, in welchen Zeitskalen eine thermische Pro- teindenaturierung möglich ist und welche Temperaturen dazu erforderlich sind¹⁹,²⁸. Die bereits vorhandenen Kenntnisse der Denaturierungskine- tiken der Proteine im Zeitbereich von Sekunden bis Stunden sollen in dem DFG-Projekt bis in kürzere Zeitbereiche erweitert werden¹⁸. Das im Rah- men dieser Arbeit entwickelte Experiment soll über ein Temperatursprung- verfahren die Denaturierungskinetiken von ausgewählten Proteinen im Be- reich von Millisekunden bis Sekunden zugänglich machen. Allgemein bietet sich der dabei zu konstruierende Aufbau auch als Instrument zur Untersu- chung von temperaturabhängigen chemischen Reaktionen an. Im Folgenden werden verschiedene Möglichkeiten von Temperatursprungexperimenten dar- gelegt und miteinander verglichen.

Eine verbreitete Methode beruht auf einer elektrischen Entladung eines Kondensators durch die Probenflüssigkeit. Die zu untersuchende Lösung wird mit einem Elektrolyt versetzt, um eine ausreichende Leitfähigkeit der Lösung zu erreichen. Ein Nachteil bei der Durchführung dieser Art von Tem- peratursprungexperimenten ist das Auftreten hoher elektrischer Feldstärken, die die Proben zusätzlich beeinflussen können. Die Temperatursprungzeiten, die mit diesem Aufbau und Probevolumina von weniger als 1 ml realisiert werden können, liegen typischerweise im Bereich von 250 µs bis 1 s, die Tem- peraturerhöhungen zwischen ∆T = 10 − 50K²⁹. Ein schnelles Abkühlen ist mit diesem Aufbau nicht möglich.

Eine weitere Methode, um Temperatursprungexperimente durchzuführen, besteht in der Kopplung des Probenvolumens an externe Wärmebäder. Im einfachsten Fall wird das Probevolumen in einer Trägervorrichtung durch schnelles Tauchen in das Wärmebad gebracht und nach einer definierten Zeit t wieder entfernt. Die typischen, im Einklang mit der Wärmeleitung zu er- haltenden Temperatursprungzeiten, liegen im Bereich von 500 ms bis 800 ms, bei einer Temperaturerhöhung von 60K bis 80K³¹. Schwierig gestaltet sich bei dieser Art von Temperatursprungexperimenten das anschließende schnelle Abkühlen. Die Trägervorrichtung mit der Probe muß hierfür schnell in ein Kältebad transportiert werden. Mechanisch ist diese Art von Tempe- ratursprungexperimenten mit anschließender schneller Abkühlung für Zeiten t < 1s schwer zu realisieren.

Bei Experimenten mit einem laserinduzierten Temperatursprung kann ein kleines Volumen einer wässrigen Lösung durch Absorption eines Laserpulses schnell aufgeheizt werden. Die erreichbare Sprungtemperatur hängt ab von der zur Verfügung stehenden Pulsenergie des Lasersystems. Eine homoge- ne Erwärmung ist dann gegeben, wenn das zu erwärmende Volumen auf die Absorption der Laserstrahlung angepasst wird. Zum Durchführen von Tem- peratursprungexperimenten in kleinen Volumina stellt ein Cr,Tm,Ho:YAG Lasersystem durch die starke Absorption von µa = 25¹ cm inWassereinen guten Kompromiß zwischen benötigter Pulsenergie und Größe des Meßvolu- mens dar. Mit diesem Laser kann mit einigen hundert Millijoule Pulsenergie ein Meßvolumen von wenigen Mikrolitern auf¹⁰⁰ ◦C homogen erwärmt wer- den. Allerdings begrenzt die Abkühlung dieses kleinen Volumens die Meßzeit auf maximal 5 Millisekunden²¹. Für die Durchführung von Experimenten mit Temperatursprüngen im Zeitbereich von Millisekunden bis Sekunden ist dieses System nicht geeignet.

Für den angestrebten Zeitbereich von Millisekunden bis Sekunden erge- ben sich für Temperatursprungexperimente zwei verhältnismäßig einfach zu realisierende Ansätze, die im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf den zu erreichenden Zeitbereich und prinzipielle Realisierbarkeit untersucht werden sollen.

1. Der Temperatursprung wird durchgeführt in einer dünnwandigen Ka- pillare kleineren Querschnitts, die innen von der zu untersuchenden Flüssigkeit durchströmt und von außen in Wärmebädern geheizt oder gekühlt wird. Eine gleiche Verweildauer der einzelnen Fluidelemen- te der Lösung muß in den Zonen erhöhter Temperatur gewährleistet sein, genauso wie ein schneller Temperaturanstieg innerhalb der ge- samten Kapillare, um auch Temperatursprungzeiten von wenigen Mil- lisekunden realisieren zu können. Die zu erreichenden Sprungtempe- raturen können durch das Wärmebad von außen vorgegeben werden. Die Sprungzeiten sind einerseits abhängig von der erreichbaren Ge- schwindigkeit der strömenden Lösung und andererseits limitiert durch die Zeit, die die Wärmeleitung benötigt, um die Lösung in der Kapilla- re zu erwärmen. Es kann durch den kontinuierlichen Fluß der Lösung ein hoher Probendurchsatz erwartet werden.

Bei der Realisierung des Experiments ergaben sich grundsätzliche Probleme alle diese Anforderungen gemeinsam über einen weiten Zeitbereich zu erfüllen. Um einen möglichst großen Zeitbereich der Sprungzeit mit einem Aufbau abzudecken, wurde eine weiterer Aufbau entwickelt.

2. Über die Absorption eines Laserpulses eines Cr,Tm,Ho:YAG Lasersy- stems wird ein frei fallender Wassertropfen aufgeheizt, der nach dem Zurücklegen einer bestimmten Fallstrecke in einen gekühlten Auffang- behälter fällt. Für einen Tropfendurchmesser von wenigen zehn Mi- krometern kann mit einem Lasersystem eine homogene Erwärmung gewährleistet werden. Die zu erreichende Sprungzeit kann bestimmt werden über die Länge der Fallstrecke des frei fallenden Wassertrop- fens in Luft. Um ein schnelles Abkühlen oder Verdunsten der Tropfen zu vermeiden, müssen die Tropfen durch Luft mit einer Luftfeuchte von fast 100% und einer Temperatur, die der Sprungtemperatur entspricht, fallen.

Die Erreichbarkeit dieser Konzepte soll zudem nach Möglichkeit an einem Modellsystem qualitativ demonstriert werden.

2 Theorie

2.1 Wärmeleitung und thermische Relaxationszeit

Die zeitliche und räumliche Entwicklung einer Temperaturverteilung inner- halb eines Volumens wird durch die Wärmeleitungsgleichung beschrieben:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Gln. 1 ist T die Temperatur, α die thermische Diffusivität des Mediums, t die Zeit, Q die Rate, mit der pro Zeit- und Volumeneinheit Wärme erzeugt wird und K die Wärmeleitfähigkeit des Mediums. Die Wärmeleitfähigkeit und thermische Diffusivität sind stoffspezifisch und hängen über die Dichte ρ und die Wärmekapazität c voneinander ab.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zur Lösung dieser Gleichung müssen neben den Parametern α und dem Quell- term auch noch die entsprechenden zeitlichen und räumlichen Randbedingun- gen bekannt sein. Allgemein kann diese partielle Differentialgleichung nicht analytisch gelöst werden. Für einige Spezialfälle lassen sich jedoch geschlos- sene Lösungen finden. Mit diesen kann die Temperaturentwicklung in vielen Fällen abgeschätzt werden. Aufgrund der Linearität der Differentialgleichung können einzelne Lösungen der Gleichung superponiert werden, solange das Volumen bezüglich der thermischen Eigenschaften homogen ist.

Abkühlung einer unendlich ausgedehnten Ebene Für eine eindimensionale Geometrie kann Gln. 1 vereinfacht werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Wird in einer Schicht der Stärke l Wärme mit einer konstanten Rate Q produziert, die von der Temperatur unabhängig ist, kann Gln. 3 über einen Tausch der Variablen in eine homogene Form überführt werden. Mit den Randbedingungen, daß im Bereich für x > 0 zum Zeitpunkt t = 0 die An- fangstemperatur T = 0 ist und daß über die Grenze x = 0 kein Wärme- fluß stattfindet, kann die Temperatur innerhalb und außerhalb des Bereiches

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Durch Spiegelung der Lösung an der Ebene bei x = 0 erhält man gleichzei- tig die Lösung für ein Volumen von x = −l bis x = l, in dem mit konstanter Rate Q Wärme produziert wird, die dann bei x = −l und x = l in das geheizte Volumen diffundiert. Aufgrund der Symmetrie gilt für die Lösung, daß∂T ∂x beix=⁰ verschwindet.DamitfindetandieserStelleauchkein Wärmestrom statt, und damit ist auch die notwendige Randbedingung der Lösung in Gln.⁴ und Gln.⁵ erfüllt.

Abkühlzeit eines zylindrischen Volumens

Im Folgenden soll abgeschätzt werden, welche Zeit Wärme benötigt, um aus einem zylindrischen Volumen abzufließen, dessen Radius im Verhältnis zur Länge klein ist. Dazu sei ein unendlich langer Zylinder mit dem Radius R der Anfangstemperatur T0 betrachtet, dessen Umgebung die Temperatur 0 aufweist. Zur Lösung des Problems wird der in Gln. 1 angegebene Quellterm gleich null gesetzt. Mit den Randbedingungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ist es möglich, die Temperatur auf der Zylinderache zu jeder beliebigen Zeit t anzugeben⁹:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Mit dieser Lösung kann die Abkühlzeit des betrachteten zylindrischen Volumens leicht abgeschätzt werden. Die Zeit, in der die Temperatur auf der Zylinderachse aufT⁰ e abgefallenist,ergibtsichzu:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Verschärft man die Bedingungen und fordert einen Abfall der Temperatur auf ⁹⁰ % der vorgegebenen Anfangstemperatur, so erhält man als Abschätzung (vgl. Gln.⁸ ):

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Temperaturverlauf in einem geheizten sphärischen Volumen Eine geschlossene Lösung kann auch für eine homogen geheizte Kugel mit der thermischen Diffusivität α1 und der Wärmeleitfähigkeit K1, die in ein unendliches Medium der mit Diffusivität α2 und Wärmeleitfähigkeit K2 ein- gebettet ist, gefunden werden⁹. Der Radius der Kugel sei R. In dieser Kugel wird ab dem Zeitpunkt t = 0 Wärme mit der Rate Q erzeugt. Dieses System kann in sphärischen Polarkoordinaten mit den Differentialgleichun- gen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für die Temperatur außerhalb der Kugel existiert eine ähnliche Lösung.

Aufgrund der Linearität der partiellen Diffentialgleichungen, die die Wärmeleitung beschreiben, können einzelne Lösungen superponiert werden, um bestimmte Rahmenbedingungen zu erfüllen. So läßt sich die Lösung Tpq für einen Quellterm, der nur während einer Zeit τ Wärme produziert, durch Addition zweier Lösungen Tp, bei denen zur Zeit t = 0 eine konstante unendlich andauernde Wärmeproduktion beginnt, gewinnen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Auf diesem Wege kann aus den Lösungen der Gln. 15 und Gln. 17 der Temperaturverlauf während und nach dem Aufheizen, wie es z. B. durch einen Laserpuls geschehen kann, berechnet werden.

2.2 Bewegungsgleichung eines Fluids

Die allgemeine Bewegung eines Fluids wird beschrieben durch die NavierStokes Gleichung³⁵:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei ist % die Dichte des Fluids,

[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

u die Geschwindigkeit, f die Mas senkraft pro Volumeneinheit, p der Druck und µ die Viskosität. In Gln. 18 beschreiben %ddt und f die von außen angreifenden Kräfte, die dem Volu- [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

men bzw. der Masse des Fluids proportional sind (z. B. : f = % g mit g als Fallbeschleunigung). Durch grad p werden die Kräfte beschrieben, die auf Druckgefälle zurückzuführen sind, µ∆ u bezeichnet die an einem Volumenelement des Fluids angreifenden Reibungskräfte. Dies beinhaltet sowohl die Wechselwirkung der einzelnen Teilvolumina des Fluids untereinander als auch die Wechselwirkung mit äußeren Einflüssen.

Laminare Strömung in Kapillaren

Bei einer laminaren Rohrströmung eines Fluids sind die Strömungsge- schwindigkeit und der Druck innerhalb eines räumlich festgehaltenen Vo- lumenelements unter stationären Randbedingungen zeitlich konstant.

Für den Spezialfall einer laminaren Strömung durch ein gerades Rohr mit kreisförmigem Querschnitt kann die folgende Annahme gemacht werden: der Druckabfall ∆p ist über jedem Querschnitt konstant. Die Geschwindigkeits- komponenten in radialer Richtung sowie in Umfangsrichtung sind null. Per Definition falle die Rohrachse mit der x-Achse zusammen, r sei die radiale Komponente. Die Geschwindigkeitskomponente des Fluids in axialer Rich- tung wird mit u bezeichnet und ist nur abhängig vom Radius r. Gln. 18 vereinfacht sich mit den obigen Annahmen beträchtlich. In Zylinderkoordi- naten ergibt sich eine Differentialgleichung, bei der alle Größen nur noch von x und r abhängen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Lösung von Gln. 19 mit den Randbedingung u = 0 für r = R ergibt eine parabolische Geschwindigkeitsverteilung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die maximale Geschwindigkeit umax ist proportional zum Druckabfall ∆p über die Länge l der Kapillare:

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Die mittlere Geschwindigkeit umitt wird durch Mittelung des Volumenstroms über die Querschnittsfläche im Rohr bestimmt zu:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der laminare VolumenflußdVdt einesFluidsergibtsichdurchIntegrationder Geschwindigkeit u(r) über den Radius und ist auch als Hagen-Poiseuille- Gleichung bekannt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der VolumenflußdVdt istproportionalzurviertenPotenzdesRadius,direkt proportional zum Druckabfall und umgekehrt proportional zur Länge des Rohres.

Turbulente Strömung in Kapillaren

Eine turbulente Strömung ist dadurch gekennzeichnet, daß selbst unter stationären Randbedingungen die Geschwindigkeit und der Druck in einem festgehaltenen Volumenelement im Fluid nicht zeitlich konstant sind, sondern mit hoher Frequenz unregelmäßig um ihren zeitlichen Mittelwert schwanken.

Das Auftreten von verschiedenen Strömungsformen wurde zum ersten Mal von O. Reynolds in einem durchströmten Rohr mit Hilfe eines eingefädelten Tintenfadens beobachtet³⁴. Ab einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit kann es, abhängig von der Viskosität und dem Rohrdurchmesser, zu einem Umschlag der laminaren Strömung in eine turbulente Strömung kommen.Der Umschlagspunkt von laminarer zu turbulenter Strömung kann durch die Reynolds-Zahl Re charakterisiert werden.

Laminares Strömungsprofil Turbulentes Strömungsprofil

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2. 1:Mittlere Geschwindigkeitsverteilung bei laminarer und turbulenter Rohrströmung³⁵.

Die Reynoldszahl Re ist ein Maß für das Verhältnis von Trägheits- zu Reibungskräften an einem infinitesimalen Volumenelement des Fluids. Es gilt³⁵:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

d ist der Durchmesser des Rohres. Die Dichte % und Viskosität µ können zusammengefaßt werden zur dynamischen Viskosität ν

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Umschlag von laminarer zu turbulenter Rohrströmung beginnt ab einer Reynoldszahl von ca. 2600, es können sich in speziellen Fällen aber auch laminare Strömungen bei Reynoldszahlen über 50000 ausbilden. Ei- ne kleine Störung des Flusses in diesem instabilen laminaren Fall, z. B. durch Strömungshindernisse oder Wandrauhigkeiten, führt zu einem sofortigen Um- schlagen des Flusses von laminar nach turbulent. Abb. 2. 1 zeigt die beiden verschiedenen mittleren Geschwindigkeitsverteilungen im Falle von turbulen- ter und laminarer Rohrströmung. Die mittlere Geschwindigkeitsverteilung einer laminaren Strömung besitzt ein parabolisches Profil, die Geschwindig- keitsverteilung einer turbulenten Rohrströmung besitzt ein quasi rechteckiges Geschwindigkeitsprofil¹³.

Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Strömung im laminaren Fall für Reynoldszahlen Re¿ 2600 durch Strömungshindernisse (sogenannte Stol- perstellen) zu beeinflussen. Diese Modifikationen erzeugen Wirbelkeime, die jedoch nach einer charakteristischen Weglänge, die im Falle einer lamina- ren Rohrströmung dem zwanzigfachen Rohrdurchmesser entspräche, wieder abklingen.

2.3 Bewegungsgleichung eines fallenden Wassertrop fens

Mit einem laserinduzierten Temperatursprung kann ein frei fallender Wasser- tropfen mit dem Durchmesser von d = 50 µm quasi instantan erhitzt werden. Bei der Annahme, daß sich dieser nach dem Erhitzen nicht mehr abkühlt, kann die Fallhöhe berechnet werden, die notwendig ist, um ein Temperatur- sprungexperiment im Bereich von Millisekunden bis Sekunden zu realisieren.

Mit dem folgenden Ansatz über die am Wassertropfen angreifenden Kräfte erhält man:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fg bezeichnet die am Wassertropfen angreifende Gewichtskraft m· g, a ist die Beschleunigung. Die Reibungskraft FR ist in diesem Fall abhängig davon, welchen Wert die Reynoldszahl des umströmten Wassertropfens annimmt. Im Falle von Reynoldszahlen ReKugel ¿ 100 gilt das Stokes’sche Reibungs- gesetz

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

R ist der Radius des Wassertropfens und u die Geschwindigkeit. Für Reynoldszahlen ReKugel À 100 gilt das Reibungsgesetz nach Newton

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Gln.²⁹ ist A die angeströmte Fläche des Wassertropfens. Die Reynoldszahl eines kleinen sphärischen Wassertropfens mit dem Radius R =⁴⁰ µm, der sich mit einer Anfangsgeschwindigkeit von u0 = 3m s inLuftbewegt,berech- net sich nach Gln.²⁴ zu ReKugel ≈ 8 − 10. Die Reibungskraft kann deshalb mit Hilfe von Gln. 28 berechnet werden und ist direkt proportional zur Ge- schwindigkeit u(t) des fallenden Wassertropfens. Einsetzen von Gln. 28 in Gln. 27 ergibt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diese Gleichung stellt eine Differentialgleichung erster Ordnung dar, die über einen Lösungsansatz mit anschließendem Umformen und Auflösen nach der Variable u(t) gelöst werden kann:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach Einsetzen von Gln.³² in Gln.³¹ und anschließender Integration über die Zeit t erhält man die Ortsabhängigkeit x(t) eines mit der Anfangsge- schwindigkeit u0 frei fallenden Wassertropfens mit der Anfangsbedingung x(t = 0) = 0.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4 Das Cr,Tm,Ho:YAG Lasersystem

Im nahen Infrarot-Bereich stehen verschiedene gepulste Lasersysteme in Wel- lenlängenbereichen, bei denen Wasser eine hohe Absorption aufweist, zur Verfügung.

Abbildung 2. 2: Energieniveauschema des Cr:Tm:Ho:YAG - Laserkristalls. Die thermische Besetzung der einzelnen Niveaus bei Zimmertemperatur ist auf der rechten Seite der Darstellung in Prozent angegeben²⁶.

Für das Erhitzen des Tropfens wurde ein Cr,Tm,Ho:YAG Lasersystem ge- wählt, weil Pulsenergien von bis zu 500 mJ und ein Absorptionskoeffizient im Bereich von µa = 25¹ cm eineausreichendhohe,homogeneEnergiedeponierung in Wasserschichten von⁵⁰ µm zulässt. Die Pulslänge des freilaufenden Lasers im Bereich von tPuls = 250 − 300 µs garantiert bei Temperatursprungexpe- rimenten im Bereich von ms − s eine hinreichend kurze Anstiegszeit bei der Erwärmung in der dünnen Wasserschicht. Die in den Wirtskristall Yttrium- Aluminium-Granat (YAG, Y3Al5O12) eindotierten Ionen Holmium (Ho³ + )

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

und Thulium (Tm³ + ) gehören zur Gruppe der Seltenen Erden. Sie sind als dreifach positive Ionen in den Kristall eingebaut und besitzen die Konfigu- ration des Edelgases Xenon mit zusätzlich 10 bzw. 12 Elektronen in der 4f Schale. Die scharfen Absorptions- und Emissionslinien des Kristalls lassen sich den Übergängen der nicht abgeschlossenen 4f Unterschale zuordnen. Für ein effektives Pumpen mit Blitzlampen wird der Laserkristall zusätz- lich mit Cr³ + und Tm³ + dotiert²⁴. Das breite Absorptions-Spektrum der Cr³ + -Ionen verbessert die Effizienz der Absorption. Der Energieübertrag der Tm³ + -Ionen auf die Ho³ + -Ionen ermöglicht eine effektive Ausnutzung der Anregungsenergie. Die unteren Laserniveaus des Holmium-Lasers sind bei Zimmertemperatur teilweise thermisch besetzt; es ist deshalb ein effi- zientes Pumpen notwendig, um die benötigte Inversion des Laserübergangs zu erreichen. In Abb. 2. 2 ist schematisch das Energieniveauschema eines Cr,Tm,Ho:YAG-Kristalls dargestellt.

Das Blitzlampenlicht wird von den Cr³ + -Ionen breitbandig absorbiert und danach über einen strahlungslosen Übergang nach ca. 0, 1 − 1 ms auf den Zustand³ F4 des Thuliums übertragen. Über eine Kreuzrelaxation mit den simultanen Übergängen von³ F4 −[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]³ H4 und³ H6 −[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]³ H4 in benachbar- ten Tm³ + -Ionen entstehen aus jedem Anregungsphoton zwei der angeregten Zustände³ H4. Die Anregungsenergie wird nach ca. 10 µs zu einem Teil auf die Ho³ + -Ionen übertragen. Die Laseremission findet statt beim Übergang ⁵ I7 −[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]⁵ I8. Da das⁵ I7 Niveau entartet ist, sind verschiedene Laserübergän- ge möglich. Das emittierte Laserlicht besitzt eine Wellenlänge im Bereich von λ = 2, 1 µm²⁶. Je nach Wahl der Reflektivität des Auskoppelspiegels und Veränderung der Resonatorkonfiguration kann die Laserwellenlänge im Bereich von λ = 2, 1275 bis 2, 0899 µm variieren⁸,¹¹.

2.5 Lichtverteilung in Tropfen bei Bestrahlung

Bei der Bestrahlung von Wassertropfen mit kollimiertem Laserlicht treten durch Brechung und Totalreflexion der Lichtstrahlen an der Grenzfläche Luft- Wasser abgeschattete Bereiche und Bereiche mit stark erhöhter Intensität auf (vgl. Abb. 2. 3).

Abbildung 2. 3: Schematische Darstellung des Strahlenganges bei ein- und doppelseitiger Bestrahlung eines Wassertropfens mit kollimiertem Laserlicht. Durch Brechung kommt es auf der der Lichtquelle abgewandten Seite des Tropfens zu einer Überhöhung der Lichtintensität auf der Achse, während weiter außen liegende Bereiche abgeschattet sind.

Die Lichtverteilung in den Tropfen mit dem Radius von einigen 10 µm kann mittels geometrischer Optik unter Berücksichtigung des Brechungs-, des Reflexions- und des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet werden³⁰,³³. Ein Vergleich der so erhaltenen Intensitätsverteilung innerhalb der Wasser- tropfen mit Berechnungen, denen die Mie-Theorie zu Grunde gelegt wurde, zeigen keine signifikanten Abweichungen voneinander¹⁰. Aus der Licht- verteilung im Wassertropfen kann die deponierte Energie über die folgende Beziehung berechnet werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Gln. 34 ist I die Strahlungsflußdichte des Lichts, µa ist der Absorptions- koeffizient und EAbs die Energiedichte aufgrund der Absorption. Um eine Abschätzung der zu erwartenden geometrischen Ausmaße der abgeschatteten Bereiche zu erlangen, wurde mit einem vorhandenen Pro- gramm eine Berechnung zur Intensitätsverteilung in einem kleinen Tropfen mit 50 µm Durchmesser durchgeführt, der von einer Lichtquelle mit einem vollen Öffnungswinkel von 25◦ bestrahlt wird, welche Photonen unter einem Winkel von γ = 25◦ statistisch verteilt, emittiert. Das Programm erzeugt Lichtstrahlen und verfolgt diese auf ihrem Weg durch den vorgegebenen 3- dimensionalen Körper, bis sie auf eine vorgegebene Referenzfläche treffen oder absorbiert werden. Trifft ein Lichtstrahl auf eine Grenzfläche, wer- den die neue Ausbreitungsrichtung und die neue Intensität mit Hilfe des Lambert-Beer’schen Gesetzes und den Fresnel’schen Formeln berechnet. Bei der Unterschreitung einer bestimmten Intensität des Strahls wird ein neuer Strahl innerhalb der Lichtquelle und des Aperturwinkels mit einem zufäl- lig ausgewählten Startpunkt und einer zufällig ausgewählten Startrichtung gestartet. Um die Energieerhaltung zu gewährleisten, wird bei Unterschrei- tung der minimalen Intensität mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit w die Intensität um den Faktor ngehoben. Die während der Berechnungen gespeicherten Matrizen der Photonenwege können nach dem Ablauf der Simulation zur Berechnung der räumlichen Lichtverteilung ausgewertet werden (siehe Anhang: Ablaufplan für Monte-Carlo-Simulationen).

2.6 Thermische Proteindenaturierung

Proteine sind Makromoleküle, die aus Aminosäuren aufgebaut sind. Ihre räumliche Konformation wird eingeteilt in Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Durch die Primärstruktur wird die Sequenz der Aminosäu- ren beschrieben. Die Sekundärstruktur beschreibt die 3-dimensionale An- ordnung benachbarter Aminosäuren aufgrund sterischer Wechselwirkungen. Beispiele der Sekundärstruktur sind die α-Helix und die β- Faltblattstruk- tur. Die Tertiärstruktur beschreibt die räumliche Anordnung der durch die Sekundärstruktur beschriebenen Untereinheiten. Sie wird durch Wechsel- wirkungen oder Bindungen weit entfernter Aminosäuren untereinander und Wechselwirkung der Aminosäuren mit den Lösungsmitteln bestimmt. Eine Quartärstruktur der Proteine beschreibt die räumliche Anordnung mehrerer Polypeptidketten untereinander.

Die räumliche Struktur wird durch eine empfindliche Balance von stabi- lisierenden und destabilisierenden Wechselwirkungen bestimmt. Die für die Funktionalität der Proteine wichtige räumliche Struktur kann daher leicht durch eine Temperaturerhöhung oder Änderung des pH-Wertes zerstört wer- den. Das Protein geht von seinem nativen Zustand N über in den entfalteten Zustand D. Die Entfaltung ist im Prinzip reversibel, wenn die ursprüngli- chen Bedingungen wiederhergestellt werden. In erster Näherung kann die Entfaltung beschrieben werden durch einen Ratenprozeß.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei sind k1(T ) und k2(T ) die Ratenkonstanten für die Entfaltung bzw. Rückfaltung der Proteine in einem Zwei-Zustand-Prozeß. Eine Renaturie- rung ist abhängig vom jeweilig untersuchten Protein und den vorherrschen- den Versuchsbedingungen. Es existieren Proteine, die sich wieder zurück- falten und somit ihre biologische Funktion wiedererlangen können. Ist dies nicht der Fall, liegt eine irreversible Denaturierung des Proteins vor. Ursa- chen für eine irreversible Denaturierung können eine mögliche Aggregation der entfalteten Proteine oder ein irreparabler Bruch der kovalenten Bindung sein. Die irreversible Denaturierung kann durch folgendes Modell beschrieben werden²⁷:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2. 4: Energieschemata zur Proteindenaturierung. Die Temperatur Ts kennzeichnet den Bereich, in dem die Enzyme stabil im nativen Zustand vorliegen. Die Enzyme weisen die Enthalpien auf, die durch die Zustände N, Z oder U gekennzeichnet sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Gln. 36 beschreibt U einen Zwischenzustand, der sich zum nativen Protein N zurückfalten kann und D ist der Zustand der irreversiblen Denaturierung. Der zweite Schritte U * D der Reaktion beschreibt eine irreversible Veränderung des Enzyms.

Faltung, Stabilität und Entfaltung von Proteinen können an Hand des Verlaufs der freien Enthalpie F des Proteins und seiner Umgebung veran- schaulicht werden (vgl. Abb. 2. 4) Hierbei werden alle Freiheitsgerade in einer Konformationskoordinate zusammengefasst. Befindet sich das Protein im nativen Zustand N in einem globalen Minimum der freien Enthalpie, so ist dieser Zustand thermodynamisch stabil. Bei einer Temperaturerhöhung ver- ändert sich der Verlauf von F. Der entfaltete Zustand kann eine geringere freie Enthalpie als der native Zustand besitzen, so daß sich N nur noch in einem lokalen Minimum befindet. Bei der Überwindung der Energiebarriere ∆F‡ geht das Protein in den entfalteten Zustand über. Die Ratenkonstan- ten für die Entfaltung der Proteine können über die Theorie der aktivierten Zwischenzustände berechnet werden²³. Für die Berechnungen wird ange- nommen, daß sich das System mit einem hypothetischen Zustand auf dem Maximum der Energiebarriere im Gleichgewicht befindet. Von dort reagiert es mit einer gewissen Rate (Wahrscheinlichkeit pro Zeiteinheit) k⁰ zu dem entfalteten Zustand. Hieraus folgt für die Ratenkonstante kD wobei C2 das Verhältnis der Besetzung des Zustands Z zur Besetzung des Zwischenzustand N angibt. Das Besetzungsverhältnis ist im Gleichgewicht durch den Unterschied ∆F‡ der freien Energie gegeben:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

R ist die universelle Gaskonstante. Aus der statistischen Thermodynamik kann für k⁰ der AusdruckkTh abgeleitetwerden[[6]].Damitfolgt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der erste Term auf der rechten Seite in Gln. 41 beschreibt eine lineare Temperaturabhängigkeit der Reaktionsrate, die aber gegenüber der expo- nentiellen Temperaturabhängigkeit vernachlässigbar ist. In der Praxis wird der Term der linearen TemperaturabhängigkeitkTh zusammengefaßtmitdem

Term e R zu einem temperaturunabhängigen Faktor Z0. Der Parameter ∆H in Gln. 41 ist experimentell nicht direkt bestimmbar, deshalb wird die experimentell zugängliche Aktivierungsenergie Ea, die direkt aus der Reaktion bestimmt werden kann, anstelle von ∆H in Gln. 41 eingefügt. Damit ergibt sich die sogenannte Arrheniusgleichung die eine exponentielle Abhängigkeit der Reaktionsrate von der reziproken Temperatur beschreibt¹.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Ist das Reaktionsschema bekannt, können Ratengleichungen aufgestellt werden, die die Änderung der Konzentration vom nativen und entfalteten Zustand mit der Zeit beschreiben, wenn das System aus dem Gleichgewicht gebracht wird. Für die Reaktion nach Gln. 35 ergeben sich folgende Raten- gleichungen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]