Heterologe Expression des Maus Odorant-Bindeproteins 2b

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Versuchstier (Mus musculus familiaris domesticus)
2.1.2 Geräte
2.1.3 Chemikalien
2.1.3.1 Allgemeine Substanzen
2.1.3.2 Spezielle Produkte und Kits für die Molekularbiologie
2.1.3.3 Klonierungsvektoren
2.1.3.4 Oligonukleotide
2.1.3.5 DNA und RNA modifizierende Enzyme
2.1.4 Bakterienstämme
2.2 Methoden
2.2.1 RT- PCR-Analysen
2.2.1.1 Gewebepräparation zur RNA-Isolierung
2.2.1.2 RNA-Isolation mit NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel)
2.2.1.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)
2.2.1.4 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der PCR
2.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
2.2.1.5.1 Gießen des Agarosegels
2.2.1.5.2 Vorbereitung der RT-PCR-Proben
2.2.1.5.3 Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente
2.2.1.5.4 Sichtbarmachen und Ausschneiden der DNA-Banden
2.2.2 Klonierung amplifizierter DNA-Fragmente
2.2.2.1 Aufreinigung der DNA aus dem Agarose-Gel
2.2.2.2 Restriktionsverdau von Insert und Vektor
2.2.2.2.1 Verdau der Vektoren
2.2.2.2.2 Verdau der Inserts
2.2.2.3 Poly - Adenylierung
2.2.2.4 Ligation
2.2.2.5 Elektrokompetente Bakterienzellen
2.2.2.5.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen
2.2.2.5.2 Transformation elektrokompetenter Bakterienzellen
2.2.2.6 Chemisch kompetente Bakterienzellen
2.2.2.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen
2.2.2.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterienzellen
2.2.2.7 Ausplattieren der transformierten Bakterien
2.2.2.8 Selektion der Bakterienkolonien
2.2.3 Isolierung und Restriktionsanalyse rekombinanter Plasmide
2.2.3.1 Minipräparation
2.2.3.2 Midipräparation
2.2.3.3 Restriktionsanalyse
2.2.4 Sequenzierung klonierter DNA
2.2.4.1 Sequenzierung
2.2.4.2 Analyse der Sequenzdaten
2.2.5 Expression und Aufreinigung von mOBP2b
2.2.5.1 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pET22b
2.2.5.1.1 Überprüfung der Proteinexpression über IPTG-Induktion
2.2.5.1.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (pET22b)
2.2.5.1.3 Periplasmatische Aufreinigung
2.2.5.2 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pQE-
2.2.5.2.1 Überprüfung der Proteinexpression
2.2.5.2.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (pQE-32)
2.2.5.2.3 His-Tag Aufreinigung über Ni-Affinitätschromatografie
2.2.5.3 Charakterisierung der Proteine mit der SDS-PAGE
2.2.5.3.1 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.2.5.3.2 Färbung der Gele mit Coomassie-Brilliant-blue (CBb)

3. Ergebnisse
3.1 Identifizierung des OBP2b Gens der Maus in der NCBI Gen- Datenbank
3.1.1 Identifizierung der Signalsequenz
3.2 Oligonukleotid - Primer für die PCR
3.2.1 Klonierung in den Vektor pQE-
3.2.1.1 PCR-pQE-30-forward-Primer (G324)
3.2.1.2 PCR-pQE-32-reverse-Primer (G325)
3.2.2 Klonierung in den Vektor pET-22b (+)
3.2.2.1 PCR-pET22b-forward-Primer (G340)
3.2.2.2 PCR-pET22b-reverse-Primer (G323)
3.3 PCR - Amplifikation der mOBP2b - Gensequenz aus der cDNA
3.4 Klonierung in Vektor pGEM-T
3.5 Klonierung der Expressionskonstrukte
3.5.1 Klonierung in pQE-
3.5.2 Klonierung in pET22b
3.6 Expression von mOBP2b in E.coli BL-
3.6.1 Expression über das pET22b-Vektorsystem
3.6.1.1 Überprüfung der Expression in E.coli BL21 (pET22b)
3.6.1.2 Proteinaufreinigung aus dem pET22b-Expressionssystems
3.6.1.2.1 Periplasmatische Aufreinigung
3.6.2 Expression über das pQE-32-Vektorsystem
3.6.2.1 Überprüfung der Expression in pQE-
3.6.2.2 Proteinaufreinigung aus dem pQE-32-Expressionssystems
3.6.2.2.1 Aufreinigung der Bakterienkultur
3.6.2.2.2 His-Tag-Proteinaufreinigung über Affinitätschromatografie

4. Diskussion
4.1 Expressionssystem E.coli BL21 (DE3)
4.2 Expressionsvektoren
4.2.1 Expression über das pQE32-Vektorsystem
4.2.2 Expression über das pET22b-Vektorsystem
4.3 Ausblick zum Maus Odorant-Bindeprotein 2b

5. Zusammenfassung

6. Summary

7. Abkürzungsverzeichnis
7.1 Allgemeine Abkürzungen
7.2 Abkürzungen der Aminosäuren

8. Literaturverzeichnis

9. Danksagung

1. EINLEITUNG

Das olfaktorische System der Säugetiere ist in der Lage, eine riesige Zahl von Duftstoffen in geringsten Konzentrationen zu detektieren und diese auch voneinander zu unterscheiden (Beets, 1970; Polak, 1973; Kirner et al., 2003). Diese enorme Kapazität wird von einer sehr großen Zahl an verschiedenen Odorantrezeptoren (OR) in den Sinneszellen des olfaktorischen Epithels (OE) geleistet. Die OR gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und stellen in manchen Spezies mit mehr als 1000 Subtypen die größte Genfamilie dar (Zhang und Firestein, 2002).

Bei Vertebraten, die an Land leben, müssen die flüchtigen Duftstoffe dabei aus der Luft die hydrophile Barriere des Mucus passieren, um an die olfaktorischen Sinneszellen (OSZ) mit den Rezeptoren zu gelangen. Dabei binden sogenannte Odorant-Bindeproteine (OBPs) die vorwiegend hydrophoben, organischen Moleküle und transferieren sie zu ihren Rezeptoren (Bignetti et al., 1985; Pevsner and Snyder, 1990; Pelosi, 1994, 1996). OBPs sind kleine (etwa 20 kDa), wasserlösliche Proteine, die in hohen Konzentrationen vom olfaktorischen Epithel in den nasalen Mucus sekretiert werden (Pelosi, 1994); Sie gehören zu den Lipocalinen, welche sich durch eine acht-strängige β-Fassstruktur, die C-terminal von einer α-Helix flankiert wird, auszeichnen (Pelosi, 1994; Flower et al., 1993, 1996; Tegoni et al., 2000). Dabei bildet das β-Fass die zentrale, hydrophobe Bindungstasche. Die Proteinoberfläche ist meist hydrophil (Flower, 1996; Bianchet et al., 1996; Tegoni et al., 1996; Spinelli et al., 1998).

Für die Bindung tausender unterschiedlicher Duftstoffmoleküle stehen interessan- terweise nur sehr wenige verschiedene Odorant-Bindeproteine zur Verfügung. Bei der Maus existieren beispielsweise nur 4 Subtypen; dies impliziert, dass jedes Bindeprotein eine Vielzahl unterschiedlicher Komponenten binden müsste. Das Prinzip, nach dem die Duftmoleküle mit den unterschiedlichen Bindeproteinen interagieren, ist noch nicht vollständig aufgeklärt.

Inzwischen wurden verschiedene OBP-Subtypen aus mehreren Spezies (Rind, Schwein, Kaninchen, Maus, Ratte sowie Elefant und Mensch) daraufhin untersucht (Pevsner et al., 1985, 1990; Dal Monte et al., 1991; Pes et al., 1992; Pes and Pelosi, 1995; Briand et al., 2000, 2002; Lazar et al., 2002). Dabei wurde die Wechselwirkung zwischen Liganden und OBPs entweder durch Modellierung und Simulationen mit Computerprogrammen oder durch die Verfügbarkeit eines reinen OBPs für direkte Bindungsstudien analysiert.

In der vorliegenden Arbeit wurde das OBP2b-Bindeprotein der Maus bearbeitet. Für dieses existiert ein orthologes OBP bei der Ratte; Vergleiche speziell solcher Proteine könnten dazu beitragen, das Prinzip der Wechselwirkungen von OBPs mit Liganden einem Verständnis näher zu bringen. Dazu sollte in der vorliegenden Studie das mOBP2b in zwei verschiedenen Varianten heterolog in E.coli exprimiert und produziert werden.

2. MATERIAL UNDMETHODEN

2.1 Materialien

2.1.1 Versuchstier(Mus musculus familiaris domesticus)

Die eingesetzte Versuchsmaus (♂ 7 Monate) für die cDNA-Synthese entstammt der Mauslinie WGA-7,2 aus institutseigener Zucht. Sie wurde unter einem 12 h - Licht-Dunkel-Rhythmus gehalten und ad libitum mit Wasser und Futter versorgt.

2.1.2 Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3 Chemikalien

2.1.3.1 Allgemeine Substanzen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3.3 Klonierungsvektoren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3.4 Oligonukleotide

Für die Amplifikation von DNA mit der PCR-Technik (Polymerase Chain Reaction) und für die Sequenzierung von Plasmidinsertionen wurden Oligonukleotidprimer verwendet, die von der Firma biomers.net synthetisiert wurden. In der folgenden Tabelle sind die verwendeten Primer aufgeführt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3.5 DNA und RNA modifizierende Enzyme

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.4 Bakterienstämme

Für die Transformation rekombinanter Plasmide wurden E.coli-Bakterien vom Stamm XL1-blue und BL21 (DE3) verwendet. Letzterer wurde zur Proteinproduktion verwendet.

2.2 Methoden

2.2.1 RT- PCR-Analysen

2.2.1.1 Gewebepräparation zur RNA-Isolierung

Das Tier wurde durch cervikale Dislokation getötet und anschließend dekapitiert. Im Anschluss wurde der nasale Raum mit dem olfaktorischen Epithel herausgetrennt.

2.2.1.2 RNA-Isolation mit NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel)

Um cDNA für die RT-PCR-Analysen zu generieren, wurde zuerst RNA aus den zu untersuchenden Geweben isoliert. Damit die Zellen lysiert werden, wurden das Gewebe in 350 µl RA1-Puffer (NucleoSpin® RNA II-Kit), der mit 3,5 µl β- Mercaptoethanol versetzt wurde, mit einer Schere zerkleinert. Das Lysat wurde durch Vortexen homogenisiert und komplett auf eine im Kit enthaltene Säule überführt und in einem Sammeltube eine Minute bei 11 000 g zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 350 µl Ethanol (70%) vermischt und 2 x 5 Sekunden gevortext, auf eine weitere im Kit enthaltene Säule geladen und 30 Sekunden bei 11 000 g zentrifugiert. Die Säule, an die nun die im Gewebe enthaltene RNA gebunden hat, wurde in ein neues Sammeltube überführt und 350 µl MD-Puffer (membrane desalting buffer; NucleoSpin® RNA II-Kit) hinzugegeben und erneut 1 Minute bei 11 000 g zentrifugiert, um die Filtermembran zu entsalzen. Dies diente zur höheren Effektivität des nun folgenden rDNase-Verdaus. Hierfür wurde eine Reaktionsmischung bestehend aus 10 µl rDNase und 90 µl Reaktionspuffer aus dem Kit auf die Säule geladen und 15 Minuten lang inkubiert, um noch vorhandene DNA-Fragmente aus der Säule zu entfernen. Zur Inaktivierung der rDNase folgten verschiedene Waschschritte. 200 µl RA2-Puffer wurden auf die Säule gegeben und 30 Sekunden bei 11 000 g zentrifugiert. Anschließend wurden 600 µl RA3-Puffer (NucleoSpin® RNA KitII) auf die Säule gegeben. Nach erneuter 30 sekündiger Zentrifugation bei 11 000 g wurde die Säule in ein neues Sammeltube überführt und 250 µl RA3-Puffer hinzugefügt. Im Anschluss folgte eine Trockenzentrifugation, d.h. 2 Minuten bei 11 000 g. Um die gewaschene, gebundene RNA aus der Säule zu eluieren, wurde die Säule in ein neues 1,5 ml – Reaktiongefäß überführt, und 40 µl RNase freies Wasser (LiChrosolv®) darauf pipettiert. Nach einminütiger Zentrifugation bei 11 000 g konnte die isolierte RNA, die nun im Eluat enthalten ist, direkt weiterverwendet oder bei -70°C eingefroren werden.

2.2.1.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)

Der Ansatz, der in cDNA umgeschrieben werden sollte, enthielt ein Volumen von 11 µl, das aus LiChrosolv® und dem entsprechenden RNA-Eluat bestand. Dieser wurde mit je 1 µl Desoxynucleotid Mix (10 mM) und 1 µl eines Oligo-(dT)-Primers (0,5 µg/µl) versetzt. Es folgten eine fünfminütige Inkubation bei 65°C und eine weitere fünfminütige Inkubation auf Eis. Danach wurden die Ansätze mit 4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl DTT (Dithiothreitol, 0,1 M), 1 µl RNAse OUTTM Ribonuclease Inhibitor (40 u/µl) und 1 µl Superscript® III Reverse Transkriptase (200 u/µl) versehen. Zur Vollendung der cDNA-Synthese wurden alle Ansätze zunächst für eine Stunde bei 50°C und anschließend für 15 Minuten bei 70°C inkubiert. Die generierte cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

2.2.1.4 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der

„Polymerase Chain Reaction” (PCR)

Für die Amplifikation der mOBP2 DNA mit Hilfe der PCR-Technik wurden Oligonukleotid-Primer mit speziellen Eigenschaften verwendet. Das Primerpaar ist so entwickelt worden, dass diese über die Enden der mOBP2b Gensequenz herausragen, d.h. dass jedes Amplifikat der PCR final die Gensequenz des Maus Odorant-Bindeproteins 2b enthält, die zum 3’ und zum 5’ Ende hin um einige Basenpaare verlängert ist. Diese Überhänge enthalten Schnittstellen für Restriktionsenzyme. Die für die Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente durchgeführten PCR- Reaktionen erfolgten in einem Volumen von 50 µl, welches sich wie folgt zusammensetzte: 0,3 µl je spezifischem Primer, 0,3 µl dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP); 0,5 µl High Fidelity Polymerase; 5 µl 10x Reaktionspuffer für High Fidelity Polymerase; 1 µl cDNA und 42,6 µl Bidest. Die Ansätze wurden nach Zugabe der Polymerase bis zum Start (hot start) der PCR auf Eis gekühlt. Die Amplifikation erfolgte in einem Peltier Thermo Cycler PTC-200 der Firma MJ Research. Das verwendete Temperaturprofil ist im Folgenden aufgeführt.

Temperaturprofil Programm common*A:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese

Um die mittels RT-PCR amplifizierten DNA-Fragmente sichtbar zu machen und analysieren zu können, mussten diese elektrophoretisch aufgetrennt werden. Hierfür wurde der RT-PCR-Ansatz mit Ethidiumbromid versetzt und auf ein Agarosegel aufgetragen. Einzelne Ethidiumbromid-Moleküle konnten so zwischen die Basen der DNA interkalieren und so deren Anregungsspektrum verändern. Bei einer Belichtung des Agarosegels mit ultraviolettem Licht wurde die Fluoreszenz der Chemikalie erhöht, sodass DNA-Fragmente im Gel heller erschienen als Stellen, die keine Nukleinsäuren gebunden hatten. Die Lichtintensität war hierbei proportional zur DNA-Menge im Gel.

2.2.1.5.1 Gießen des Agarosegels

Zur Herstellung eines Agarosegels wurden 0,25 g Agarose (1%iges Gel) abgewogen und mit 25 ml 1x TAE-Puffer (90 mM Tris-HCl; pH 7,4, 2 mM EDTA, 90 mM Essigsäure) mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) versetzt. Durch Erhitzen in der Mikrowelle wurde die Agarose verflüssigt und anschließend zur Aushärtung in eine Gelform gegossen.

2.2.1.5.2 Vorbereitung der RT-PCR-Proben

Die Ansätze wurden jeweils 1:6 mit 6xDNA-Probenpuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 30% Glycerol) versetzt.

2.2.1.5.3 Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente

Nach Abkühlen und Aushärten des Agarosegels, wurde dieses in die Gelelektrophorese- Apparatur gegeben und mit 1x TAE-Puffer überschichtet. Anschließend wurden die Geltaschen mit den mit Probenpuffer versetzten RT-PCR-Proben beladen. Um die Größe der vorhandenen DNA-Fragmente zu bestimmen, wurde ein molekularer Größenstandard in eine weitere Geltasche pipettiert. Für kürzere Fragmente wurde ein 100bp-Molekulargewichtsstandard, für längere Fragmente ein 1kb-Molekular-gewichtsstandard eingesetzt. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 150 Volt von ungefähr 12 bis 15 Minuten.

2.2.1.5.4 Sichtbarmachen und Ausschneiden der DNA-Banden

Nach der Gelelektrophorese konnten die DNA-Fragmente, die nun ihrer Größe nach aufgetrennt waren, mit Hilfe einer UV-Lichtquelle als Banden im Gel sichtbar gemacht werden. Um die amplifizierten DNA-Fragmente aus dem Gel aufzureinigen, wurden die Banden mit Hilfe eines Skalpells unter einer UV-Lampe ausgeschnitten.

2.2.2 Klonierung amplifizierter DNA-Fragmente

2.2.2.1 Aufreinigung der DNA aus dem Agarose-Gel

Für die Aufreinigung der DNA aus dem Agarosegel wurde das „Gel Extraktions Kit“ von PEQLAB Biotechnologie GmbH verwendet. Hierfür wurden die unter UV Licht ausgeschnittenen Banden des Gels mit dem gleichen Volumen an Binding Buffer versetzt und ca. sieben Minuten bei 55°C inkubiert, um die Agarose zum Schmelzen zu bringen. Alle zwei bis drei Minuten wurden die Ansätze geschüttelt oder gevortext bis die Agarose komplett gelöst wurde. Anschließend wurden die Ansätze auf eine Säule gegeben, die eine Silikamembran enthielt, an der DNA bindet. Danach wurden die Proben bei 10.000 g eine Minute lang zentrifugiert. Die Ansätze wurden zwei bis drei Mal mit Waschpuffer gewaschen, wobei jeweils 600 μl CG Wash Buffer (komplementiert mit EtOH) auf die Säule gegeben wurde und diese eine Minute bei 10.000 g zentrifugiert wurde. Nach diesem Waschschritt wurde die Säule 1 Minute und 30 Sekunden lang trocken zentrifugiert. Final wurde die DNA mit Hilfe von 30 μl Bidest und einer Zentrifugation von einer Minute bei 5.000 g aus der Säule gelöst.

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