Optimización de técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ no radiactiva para la detección y colocalización del péptido neurotensina y su receptor en adenohipófisis de rata

INDICE

1. INTRODUCCIÓN

2.JUSTIFICACIÓN y OBJETIVOS

3. METODOLOGÍA
3.1. Inmunolocalización de células NT-ir, células FSH-ir y células TSH-ir en secciones de tejido.
3.1.1. Protocolo para la detección inmunoquímica de células NT-ir.
3.1.2 Protocolo de elución-retratamiento para la detección inmunoquímica de células FSH-ir/TSH-ir.
3.1.3. Protocolo de doble marcaje para la detección inmunoquímica simultánea de células NT-ir y FSH-ir.
3.1.4. Protocolo de doble marcaje para la detección inmunoquímica simultánea de células NTR-ir y FSH-ir.
3.1.5. Controles de especificidad de la reacción inmunohistoquímica.
3.1.6. Disoluciones para inmunohistoquímica.

4. Detección del mARN específico del gen de la neurotensina/neuromedina N en adenohipófisis de rata mediante hibridación in situ no radiactiva.
4.1. Protocolo para el marcaje de la sonda con Dig 11-dUTP.
4.2. Procesado de las secciones para hibridación in situ.
4.3. Controles de especificidad de la reacción de hibridación in situ
4.4. Disoluciones para hibridación in situ no radiactiva

5. RESULTADOS
5.1. Detección de células NT-ir en la adenohipófisis de rata durante el desarrollo posnatal.
5.2. Detección de células NT-ir en la adenohipófisis de rata adulta.
5.3. Detección de células NTR-ir en la adenohipófisis de rata adulta.
5.4. Detección del mARN del gen de la neurotensina/neuromedina N en la adenohipófisis de rata adulta.

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES

8. BIBLIOGRAFÍA

1.- INTRODUCCIÓN

La inmunohistoquímica es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante utilizando para ello anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). La técnica, por la gran especificidad y alta afinidad que tiene los anticuerpos para reconocer moléculas y unirse a ellas, permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido. La inmensa mayoría de técnicas inmunohistoquímicas pueden aplicarse a tejido fijado e incluido en parafina o a criosecciones con buenos resultados, siempre que la fijación tisular, su procesado e inclusión se realicen se realicen de forma adecuada, ya que la utilización de métodos y reactivos inapropiados, puede producir pérdida total o parcial antigenicidad que limitarán e impedirán la obtención de resultados fiables. Igualmente, para el procesado de secciones de tejido con técnicas de hibridación in situ, para la detección de moléculas específicas de ácido ribonucleico mensajero (mARN) mediante el uso de sondas, son aplicables los mismos fundamentos además del empleo de reactivos y material estéril, dada la labilidad de las moléculas de ácido ribonucleico (ARN).

El trabajo desarrollado en esta memoria experimental ha consistido en la puesta a punto y optimización de una serie de técnicas inmunohistoquímicas para la detección de un único antígeno, para la colocalización de dos antígenos en un mismo tipo celular y para la detección simultánea de dos antígenos mediante doble marcaje inmunoquímico. En concreto los antígenos a detectar han sido el péptido neurotensina (NT) y su receptor (NTR), así como diferentes hormonas en la adenohipófisis de rata. Por otra parte, se ha desarrollado y puesto a punto la técnica de hibridación in situ no radiactiva para la detección de secuencias específicas de mARN correspondientes al gen de la neurotensina/neuromedina N en adenohipófisis de rata. La línea de investigación en la que se encuadra la presente memoria de máster y que desarrolla el grupo de la Dra. Aixa Rodríguez Bello, lleva por título, “péptidos y regulación neuroendocrina en mamíferos”.

Está línea de investigación se centra en el estudio de la regulación de determinados aspectos de la función neuroendocrina, en relación con la reproducción en mamíferos, utilizando como modelo experimental la rata sprague-dawley®. Como bien es sabido, los lóbulos tuberal, anterior e intermedio de la hipófisis constituyen la adenohipófisis y son tres órganos endocrinos bien definidos anatómicamente que al menos, en algunas especies, contienen 14 o más sustancias activas (1,3,4,8-11). Las seis hormonas producidas en la hipófisis anterior son la hormona estimulante del tiroides (TSH, tirotropina); la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la hormona luteinizante (LH); la hormona folículo estimulante (FSH); la prolactina (PRL) y la hormona del crecimiento (STH o GH) (2). La ACTH, la PRL y la GH, químicamente son polipéptidos o proteínas, mientras que la TSH, la FSH y la LH químicamente son glucoproteínas. La ACTH, TSH, FSH y LH son hormonas tróficas es decir hormonas cuya función principal es estimular la secreción de otras glándulas endocrinas situadas a nivel periférico, y en el caso de la hormona de crecimiento, actuar entre otras localizaciones a nivel hepático estimulando la producción de somatomedinas que actuarán a su vez produciendo diferentes respuestas en dianas periféricas (2). Además, el lóbulo anterior de la hipófisis produce y secreta una hormona, la β-Lipotropina (2,3). Este polipéptido lineal de 91 aminoácidos y cuyo papel funcional se desconoce por el momento contiene las secuencias de aminoácidos correspondientes a otros péptidos activos como son las endorfinas y las encefalinas, las cuales se unen a los receptores de opiáceos modulando diferentes funciones en el organismo (2,3). Por otro lado, los lóbulos anterior e intermedio contienen otros derivados de la molécula de pro-opiomelanocortina (POMC) hormonalmente activos (2,3). Las hormonas producidas a nivel hipotalámico y secretadas a nivel del lóbulo posterior de la hipófisis, la neurohipófisis, en los mamíferos son la oxitocina y la vasopresina, ambas de naturaleza peptídica (2). Además de las hormonas tróficas sintetizadas por el lóbulo anterior de la hipófisis, hace algunos años se observó que las células endocrinas de ésta región de la hipófisis sintetizan y liberan una serie de péptidos, conocidos genéricamente como péptidos reguladores o péptidos moduladores, algunos de los cuales se asilaron inicialmente a partir del tracto digestivo, mientras que otros fueron originalmente descritos en el sistema nervioso central como es el caso de la NT, aislada inicialmente de hipotálamo bovino (5-7).

Estos péptidos son sintetizados por las células adenohipofisarias y en la mayoría de los casos estudiados se almacenan en vesículas secretoras conjuntamente con la hormona específica sintetizada por ese tipo celular (1), es decir que ambas sustancias se colocalizan en el mismo gránulo secretor y presumiblemente se liberan de manera conjunta. Entre los péptidos que expresan las células del lóbulo anterior de la hipófisis se encuentran la galanina (Gal), el neuropéptido Y (NPY), la neurotensina (NT), a-Neoendorfina (a-Neo) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) entre otros (1,3,4,8-11). Concretamente la línea de investigación en la que se encuadra este trabajo, se centra en el estudio del papel de uno de estos péptidos, la neurotensina (NT) como regulador de la función gonadal en la rata. Estudios previos han puesto de manifiesto que la NT, al igual que otros péptidos, es sintetizada en las células de la hipófisis anterior, se ha demostrado además que el péptido, una vez sintetizado, es almacenado y presumiblemente coliberado con la correspondiente hormona, en concreto se ha visto que la NT es sintetizada en el caso de la rata, únicamente en dos tipos celulares de la hipófisis anterior, las células tireotropas productoras de TSH y las células gonadotropas productoras de FSH y LH (1). Se ha comprobado, además, la existencia de dimorfismo sexual en el animal adulto, y que, en ratas hembra adultas, la expresión de NT presenta un patrón de expresión característico que se repite a lo largo del ciclo estral y que implica la expresión transitoria del péptido en los dos tipos celulares descritos (datos no publicados, 12). Además, se ha observado que la NT aparece tempranamente durante el desarrollo posnatal en ambos sexos con un patrón de expresión similar y diferente al observado en los animales adultos.

En la hembra adulta, la NT presenta un patrón de expresión cíclico bien definido que varía a lo largo de su ciclo sexual, mientras que el macho adulto presenta un patrón de expresión característico y estable, que no varía, y diferente al de la hembra (datos no publicados). Además, se ha visto que la expresión de NT varía sustancialmente tanto en las hembras como en los machos cuando se someten a castración (1). Si bien se observa que la expresión de NT tiende a recuperarse con el tiempo, nunca llega a presentar el patrón inicial observado antes de la castración. Sin embargo, en animales castrados sometidos a un tratamiento hormonal de reemplazo, se produce una recuperación del patrón de expresión, siendo muy similar al observado antes de la castración (1). Esta recuperación de la expresión de NT con el tratamiento hormonal de reemplazo, se observa de forma clara en los machos adultos sin embargo, en las hembras el resultado no es tan concluyente. Todos estos datos, junto con otros datos experimentales en los que se han determinado los niveles de esteroides gonadales a lo largo del desarrollo posnatal en machos y hembras permiten establecer la existencia de una relación entre la NT producida en la adenohipófisis y los esteroides gonadales. Se piensa, y en ésta línea se está trabajando actualmente, en el posible papel de la NT como modulador de la función gonadal que podría actuar conjuntamente con las gonadotrofinas hipofisarias, FSH y LH, y que también podría actuar como modulador paracrino, es decir localmente sobre las propias células adenohipofisarias. Por ahora la presencia de NT en las células tireotropas continúa siendo objeto de controversia y su posible función no está clara de momento. Por un lado, podría existir una relación entre ambos ejes hipofisarios, el eje gonadal y el eje tiroideo, como parecen sugerir los datos experimentales y, por otro lado, la NT podría estar modulando de manera independiente la función de la glándula tiroides.

2.-JUSTIFICACIÓN y OBJETIVOS

Teniendo en cuenta la importancia de las técnicas de detección inmunoquímica y de hibridación in situ en los estudios de expresión génica, en esta memoria experimental nos planteamos los siguientes objetivos:

1. Utilizar diferentes modalidades de marcaje inmunohistoquímico, marcaje simple, doble marcaje secuencial y combinado, así como diferentes métodos de revelado, con el fin de optimizar los protocolos experimentales y mejorar las técnicas de detección de NT, NTR y hormonas en la adenohipófisis de rata.
2. Desarrollar y poner a punto la técnica de hibridación in situ no radiactiva para la detección del mARN del gen de la neurotensina/neuromedina N en la adenohipófisis de rata.

3.- METODOLOGÍA

Las técnicas optimizadas y desarrolladas en ésta memoria experimental han sido técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ no radiactiva. Las técnicas se han utilizado para poner de manifiesto la expresión del péptido NT en la adenohipófisis de rata. Los experimentos se han llevado a cabo a lo largo del desarrollo posnatal, en determinados momentos fisiológicos de la vida adulta de la rata hembra (ciclo estral) y bajo determinadas condiciones experimentales (castración y suplementación con hormonas exógenas). La mayor parte de los experimentos han sido desarrollados aplicando técnicas inmunohistoquímicas, se han realizado diferentes variantes de la técnica con diversos objetivos, y en una última serie de experimentos se ha desarrollado y puesto a punto la técnica de hibridación in situ no radiactiva para la detección del mARN específico del gen de la neurotensina/neuromedina N con el fin de continuar los estudios sobre el papel regulador de la NT en la adenohipófisis y en la función reproductora de la rata.

Las técnicas inmunohistoquímicas desarrolladas y optimizadas se detallan a continuación:

1.- Inmunolocalización de células NT-inmunoreactivas (ir), células FSH-ir y células TSH-ir en secciones individuales de tejido.
2.- Inmunocolocalización de NT con FSH y con TSH en la misma sección de tejido, en reacciones diferentes y secuenciales.
3.- Doble marcaje inmunohistoquímico para la detección conjunta de células NT-ir y células FSH -ir en una reacción simultánea y/o dos reacciones secuenciales parcialmente solapadas.
4.- Doble marcaje inmunohistoquímico para la colocalización el receptor de neurotensina, células NTR-ir, con las distintas hormonas adenohipofisarias.

4.- Detección del mARN específico del gen de la neurotensina/neuromedina N en adenohipófisis de rata mediante hibridación in situ no radiactiva.

Los animales utilizados en los experimentos de inmunohistoquímica fueron ratas macho y hembra de la cepa sprague-dawley® en diferentes estadios del desarrollo posnatal, ratas hembra adultas en cada una de las fases del ciclo estral, ratas hembra adultas castradas y tratadas con 17β-estradiol y progesterona y ratas macho adultas castradas y tratadas con testosterona.

Los animales se mantuvieron en el animalario bajo condiciones controladas de humedad y temperatura y con un ciclo de luz-oscuridad de doce horas además de alimento y agua ad libitum. Los animales sometidos a manipulación experimental fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de ketolar® y sometidos a castración (ovariectomía bilateral en las hembras y orquidectomía bilateral en los machos). A continuación, y transcurrido un periodo variable entre 2 y 4 semanas los animales sometidos a castración fueron tratados algunos, con hormona exógena, mientras que otros fueron tratados con vehículo. En concreto, las hembras fueron tratadas mediante inyección subcutánea de, 17β-estradiol y progesterona, por un lado, y suero fisiológico por otro. A los machos les fue implantada subcutáneamente una cápsula de silastic® conteniendo testosterona, por un lado, y suero fisiológico por otro. Los animales sometidos a estas manipulaciones experimentales fueron posteriormente sacrificados a distintos tiempos con objeto de ver tanto los tanto los efectos de la castración como el efecto de la suplementación con esteroides gonadales sobre la expresión de NT en la adenohipófisis. Para el sacrificio, los animales fueron anestesiados con éter dietílico mediante inhalación y fijados mediante perfusión intracardiaca con una disolución fijadora de paraformaldehido al 4% y ácido pícrico al 0.2% en PBS 0.1 M. tras la fijación, se extrajo la hipófisis y se sometió a postfijación durante 3 horas en la misma disolución fijadora. Tras la fijación, las piezas se incubaron en una disolución de sacarosa al 20% p/v en tampón Coons durante 24 horas para crioprotección del tejido, previamente al proceso de inclusión por congelación. Tras la incubación en sacarosa, las piezas fueron incluidas o encastradas en Tisutex® (medio de inclusión para congelación de especímenes) y congeladas a -80ºC hasta el momento de realizar las criosecciones. Las secciones se realizaron en criostato (Reichert Jung 2800N frigocut, New York, USA). Se realizaron secciones de 10 micras que se recogieron sobre portobjetos gelatinados (portaobjetos previamente tratados con una disolución de gelatina y alumbre de cromo para lograr la adhesión firme de las secciones y evitar su pérdida durante el procesamiento); las secciones se almacenaron a -80ºC hasta el momento de ser procesadas.

Todos los antisueros específicos utilizados en este estudio (AS anti-NT, AS anti-NTR, AS anti-FSH y AS anti-TSH) fueron cedido por el Profesor Gerard Tramu (Laboratoire de Neurocytochimie Fonctionnelle, URA CNRS 339, Talance, France).

3.1.- Inmunolocalización de células NT-ir, células FSH-ir y células TSH-ir en secciones de tejido.

3.1.1.-Protocolo para la detección inmunoquímica de células NT-ir.

La composición de los tampones, se indica al final de ésta sección una vez descritos los diferentes protocolos experimentales.

Las secciones han de sacarse una hora antes del congelador de -80ºC y dejarlas secar completamente al aire, pues se corre el riesgo si no es así de que se despeguen en alguno de los pasos de la reacción. Una vez bien secas, las secciones se procesan de acuerdo con el siguiente protocolo experimental:

- Se someten a dos lavados consecutivos de 10’ en tampón Coons para hidratarlas.

- Se incuban durante 30' con una disolución de caseína o leche desnatada al 0.5% p/v preparada en tampón Coons. El objetivo de este paso es el bloqueo de los lugares de unión inespecíficos a los que puede unirse el anticuerpo con el fin de evitar o minimizar ruido de fondo.

- A continuación se lavan exhaustivamente durante 30' en tampón Coons, con dos cambios de 15’.

- A continuación se equilibran con una disolución del detergente aniónico Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons con objeto de permeabilizar las membranas celulares y permitir una correcta difusión del anticuerpo a través del tejido.

- A continuación se incuban las secciones durante toda la noche (o/n) con el anticuerpo específico (antisuero anti-NT) a dilución 1/200 en la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons.

- Tras la retirada del anticuerpo específico, se lavan las secciones exhaustivamente durante 1 hora con tres cambios de 20’ para eliminar el exceso de anticuerpo que no se ha unido.

- A continuación se equilibran las secciones nuevamente con la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons.

- A continuación se incuban las secciones con el anticuerpo 2º (Fragmento F(ab')2 obtenido en cabra, anti-IgG de conejo conjugado a HRP (Peroxidasa de Rábano picante), BIOSYS, Paris, France) a dilución 1/100 en la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons durante 1 hora.

- A continuación se realizan tres lavados consecutivos de 10’ en tampón Coons para eliminar el exceso de anticuerpo 2º que no se ha unido.

- A continuación se equilibran los cortes durante 15' con tampón Tris-HCl pH=7,6, tampón en el que se llevará a cabo el proceso de revelado de la reacción inmunohistoquímica.

- A continuación, y una vez finalizadas las incubaciones con los diferentes anticuerpos, se procede al revelado de la reacción inmunoquímica, con el fin de visualizar los lugares en los que se ha unido el anticuerpo y por tanto donde se localiza el antígeno que queremos detectar. El revelado de la reacción se realiza en este caso utilizando como revelador o sustrato cromogénico 4-Cl,1-Naftol 0,4 mg/mL (Sigma, UK) y H2O2 al 0,2% v/v en tampón Tris-HCl pH=7,6. Esta disolución reveladora se prepara en el momento de usarla y en oscuridad. El revelado se realiza igualmente en oscuridad, y la aparición de la señal se sigue bajo el microscopio.

- Una vez se obtiene la señal, el revelado se detiene introduciendo las secciones nuevamente en tampón Tris-HCl pH=7,6 donde se lavan exhaustivamente 15’.

- A continuación, se lavan durante 15’ más con agua destilada para eliminar restos de revelador que hayan podido quedar sobre el tejido.

- Una vez lavadas, las secciones se montan con glicerol tamponado (glicerol-tampón Coons en proporción 3:1), se deja escurrir el exceso de medio de montaje y ya están listas para su observación al microscopio óptico e interpretación.

Las secciones con ésta reacción se mantienen a 4ºC y en oscuridad para preservar la reacción el mayor tiempo posible, pues esta pierde intensidad con el tiempo. Como aclaración, mencionar que el precipitado de color azul-violáceo que genera este sustrato cromogénico (4-C1,1-Naftol) es insoluble en agua, pero es soluble en disolventes orgánicos tales como etanol, xileno, acetona, tolueno, etc. por ello las secciones se montan con un medio acuoso y no se deshidratan como ocurre también con otro de los reveladores que hemos utilizado. Además, el uso de este tipo de revelador, se debe a que una vez observadas las secciones con esta reacción y realizadas las fotografías oportunas, se procede a la eliminación de la misma y al re-procesado de las secciones para una segunda reacción inmunoquímica con la intención de poner de manifiesto el fenotipo hormonal de las células que expresan NT y comprobar tras el análisis de éstas con que hormona u hormonas coexiste o se colocaliza el péptido.

3.1.2 Protocolo de elución-retratamiento para la detección inmunoquímica de células FSH-ir/TSH-ir.

En primer lugar, se procede realizar la elución, es decir, la eliminación de la primera reacción inmunohistoquímica; para ello las secciones se introducen en tampón Coons hasta que el cubre se despegue por sí solo. A continuación, las secciones se someten a una secuencia de tres disoluciones según el siguiente protocolo:

- Se introducen las secciones en acetona durante unos segundos agitando los portaobjetos suavemente. En este paso se elimina por completo el precipitado de color generado durante el revelado de la primera reacción inmunoquímica.

- A continuación, se lavan las secciones en agua destilada

- Seguidamente se someten las secciones a una disolución de ácido sulfúrico (H2SO4) y permanganato potásico (KMnO4) al 1% v/v durante 1’ sin dejar de agitar los portaobjetos. En este paso se elimina el doble anticuerpo de la primera reacción inmunoquímica.

- A continuación, se lavan las secciones en agua destilada.

- Finalmente las secciones se tratan con una disolución de metabisulfito potásico (K2O5S2) al 0,5% v/v durante unos segundos agitando los portaobjetos, con el fin de eliminar los restos de KMnO4 que han podido colorear las secciones.

- A continuación, se lavan las secciones en agua destilada.

Una vez concluido este tratamiento las secciones están listas para ser procesadas para la 2ª reacción de detección inmunohistoquímica. El protocolo experimental seguido para ésta segunda reacción es básicamente el mismo descrito anteriormente parar la 1ª reacción con la única salvedad de que no es necesario el paso de saturación de los lugares de unión inespecíficos pues ya ha sido realizado en la 1ª reacción y lógicamente en este caso queremos detectar otras moléculas, con lo cual hemos de utilizar los anticuerpos específicos apropiados, y además hemos de revelar la reacción haciendo uso de otro sustrato cromogénico diferente y con otras características. A continuación, se describe el protocolo de forma abreviada, haciendo hincapié en los aspectos diferentes del protocolo anterior.

- Las secciones se someten a dos lavados consecutivos de 10'con tampón Coons.

- Se equilibran las secciones durante 15' con la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons.

- Incubación de las secciones con el anticuerpo específico (antisuero anti-FSH o anti-TSH) en disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons durante toda la noche (o/n). Las diluciones utilizadas de los antisueros fueron las siguientes:

Antisuero anti-FSH (1/1000). Antisuero anti-TSH (1/800).

- Tras la retirada del anticuerpo específico, se lavan las secciones exhaustivamente durante 1 hora con tres cambios de 20’ para eliminar el exceso de anticuerpo que no se ha unido.

- A continuación se equilibran las secciones nuevamente con la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons.

- A continuación se incuban las secciones con el anticuerpo 2º (Fragmento F(ab')2 obtenido en cabra, anti-IgG de conejo conjugado a HRP (Peroxidasa de Rábano picante), BIOSYS, Paris, France) a dilución 1/100 en la disolución de Tritón X-100 al 0,2% v/v en tampón Coons durante 1 hora.

- A continuación se realizan tres lavados consecutivos de 10’ en tampón Coons para eliminar el exceso de anticuerpo 2º que no se ha unido.

- A continuación se equilibran los cortes durante 15' con tampón Tris-HCl pH=7,6, tampón en el que se llevará a cabo el proceso de revelado de la reacción inmunohistoquímica.

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