Der Mechanismus der Dimerisierung und nukleären Translokation der extrazellulär regulierten Kinasen im Zusammenhang mit Zellproliferation

INHALT:

1 Abstract

2 Zusammenfassung

3 Einführung
3.1 Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade in der Krebsentstehung und -therapie Fragestellung

4 Material und Methoden
4.1 Verbrauchsmaterialien
4.2 Zellen und Zellkultur
4.3 Western Blot
4.4 [[3]H]-Thymidin-Inkorporations-Assay
4.5 Caspase-Aktivitätsmessung
4.6 Statistik

5 Ergebnisse
5.1 Das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid kann die Proliferation der Colon-Karzinomzellen inhibieren
5.2 Das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid beeinflusst die Aktivität von ERK1/2 nicht
5.3 Vorversuche zeigen, dass das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid die anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 in Colo320 nicht beeinflusst

6 Diskussion

7 Referenzen
7.1 Literaturverzeichnis
7.2 Abbildungsverzeichnis

8 Anhang
A. Puffer und Lösungen
B. Abkürzungen.

9 Danksagung

1 ABSTRACT

The Raf-MEK1/2-ERK1/2-cascade is an important signaling pathway for the regulation of cell proliferation, hypertrophy and apoptosis. Proliferation and hypertrophy are triggered by activated, dimeric ERK1/2, nuclear translocation of the dimer and phosphorylation of nuclear target proteins by ERK1/2, whereas the anti-apoptotic effects are mainly provoked by monomeric ERK1/2 in the cytoplasm. Kinase activity requires dual phosphorylation of the ERK1/2 TEY amino acid motif. Lorenz et al. (2009a+b) discovered an autophosphorylation site on threonine 188 of ERK2 which is induced by dimerization, subsequent binding of Gβγ-subunits of G proteins and is an important trigger for nuclear translocation of ERK1/2. They were also able to show that interference with this autophosphorylation site inhibits cardiac hypertrophy in mice. Ruppert et al. (2013) evaluated that this interference only prevents pathological cardiac hypertrophy, while physiological hypertrophy of the heart and anti-apoptotic effects mediated by cytosolic ERK1/2 were not impaired.

The experiments described here show that the strategy of targeting ERK1/2 dimerization is also applicable to inhibit proliferation of human colon adenocarcinoma cells. Cells were transduced with an adenovirus carrying a plasmid with the gene of a peptide, called myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷, which could be shown to bind to ERK2 and to prevent its dimerization. Proliferation of these cells was significantly lower than in lacZ transduced control cells. Levels of proliferation were determined using a tritium-thymidine incorporation assay.

Via Western Blot analysis it was determined that transduction with peptide or control virus did not significantly affect phosphorylation and activation of ERK1/2 on TEY-motif by MEK1/2 compared to untransduced cells. PD98059 was used as a positive control to inhibit ERK1/2 phosphorylation by repression of the MEK1/2 activity. The outcome of this assay confirms that the myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -peptide does not inhibit cytosolic kinase activity of ERK1/2.

In a preliminary experiment apoptosis levels of virus transduced cells were determined using a luminescence based caspase detection assay. The selective MEK inhibitor PD98059 was used as a positive control to induce apoptosis in the examined cells. The result suggests that the cytosolic ERK1/2 effect of anti-apoptosis was not impaired by the myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -peptide. This conclusion must be verified in further studies.

Taken together the findings suggest that interference with the Raf-MEK1/2-ERK1/2-cascade on the level of MAP-kinases ERK1/2 and its dimerization process could be a potential therapeutic target not only in pathological cardiac hypertrophy but also in ERK1/2-related cancers.

2 ZUSAMMENFASSUNG

Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade ist ein wichtiger Signaltransduktionsweg für die Regulation von Zellproliferation, Hypertrophie und Apoptose. Proliferation und Hypertrophie werden durch aktiviertes, dimeres ERK1/2, dessen Translokation in den Zellkern und Phosphorylierung von nukleären Zielproteinen vermittelt, wohingegen anti-apoptotische Effekte durch monomeres ERK1/2 im Zytoplasma ausgelöst werden. Für die Kinaseaktivität ist eine zweifache Phosphorylierung des TEY-Aminosäuremotivs von ERK1/2 durch MEK1/2 vonnöten. Lorenz et al. (2009a+b) entdeckten eine Autophosphorylierung am Aminosäurerest Threonin 188 von ERK1/2, die durch Dimerisierung und anschließende Bindung der βγ-Untereinheiten von G-Proteinen ausgelöst wird und für die nukleäre Translokation des Dimers wichtig ist. Sie konnten außerdem zeigen, dass Interferenz mit dieser Autophosphorylierungsstelle die Hypertrophie von Mäuseherzen unterbinden kann. Ruppert et al. (2013) fanden heraus, dass diese Interferenz nur die pathologische Herzhypertrophie verhindert, während die physiologische Hypertrophie des Herzens sowie die anti-apoptotischen Effekte von monomerem, zytosolischem ERK1/2 dabei nicht beeinträchtigt wurden.

Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dass die Strategie, die Dimerisierung von ERK1/2 zu unterbinden, ebenso in der Proliferationshemmung von humanen Colon-Adenokarzinomzellen Anwendung finden kann. Die Zellen wurden mit einem Adenovirus transduziert, das ein Plasmid enthält, auf dem das Gen für ein Peptid liegt, welches an ERK1/2 binden kann. Die Proliferation dieser Zellen war signifikant geringer als die von lacZ-transduzierten Kontrollzellen. Die Proliferationsrate der Zellen wurde mit einem Tritium-Thymidin-Inkorporations-Assay bestimmt.

Mithilfe von Western Blot Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Transduktion mit Peptidoder Kontrollvirus die Phosphorylierung und Aktivierung von ERK1/2 durch MEK1/2 am TEY-Motiv, verglichen mit untransduzierten Zellen, nicht signifikant beeinflusst. Die Substanz PD98059 wurde als Positivkontrolle verwendet, um die ERK1/2-Phosphorylierung durch MEK-Inhibition zu verhindern. Die Ergebnisse dieses Versuchs bestätigen, dass das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid die zytosolische Kinaseaktivität von ERK1/2 nicht hemmt.

In einem präliminären Experiment wurde die Apoptoserate der Virus-transduzierten Zellen bestimmt. Dafür wurde ein lumineszenz-basierter Caspase-Nachweis-Assay durchgeführt. Der selektive MEK- Inhibitor PD98059 wurde als Positivkontrolle zur Apoptoseinduktion in den untersuchten Zellen verwendet. Das Ergebnis lässt vermuten, dass der zytosolische ERK1/2-Effekt der Anti-Apoptose nicht durch das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid beeinträchtigt wird. Diese Folgerung muss jedoch durch weitere Versuche bestätigt werden.

Die Resultate lassen darauf schließen, dass die Interferenz mit der Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade auf der Ebene der Dimerisierung der MAP-Kinasen ERK1/2 einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, und dies nicht nur in der Behandlung der pathologischen Herzhypertrophie, sondern auch in ERK1/2-bedingten Krebsarten.

3 EINFÜHRUNG

3.1 DIE RAF-MEK1/2-ERK1/2-KASKADE

Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade ist eine von mehreren ähnlich ablaufenden MAPK-(Mitogen-aktivierten Proteinkinase)- Kaskaden (YOON AND SEGER, 2006). Sie dient der Signalweiterleitung von Wachstumsfaktoren oder Hormonen von zellmembranständigen Rezeptoren zu den jeweiligen Effektorproteinen. Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade vermittelt auf diese Weise zelluläre Vorgänge wie beispielsweise Proliferation, Hypertrophie, Differenzierung, Überleben oder Apoptose (ZEHORAI et al., 2010).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Allgemeine Signalkaskade des dreistufigen MAPK-Pathways (links) und spezifische Elemente des Raf-MEK1/2-ERK1/2-Signalwegs (rechts) (COBB AND GOLDSMITH, 2000)

In dieser Arbeit soll im Besonderen der Mechanismus der Dimerisierung und nukleären Translokation der extrazellulär regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) im Zusammenhang mit Zellproliferation genauer betrachtet und experimentell manipuliert werden. Bereits bekannt ist, dass sich ERK1/2 in ruhenden Zellen vor allem im Zytoplasma befindet (MURPHY AND BLENIS, 2006). Dort liegt es gebunden an zytoplasmatische Ankerproteine, wie zum Beispiel an die Mitogen-aktivierten Proteinkinasekinasen 1 und 2 (MEK1/2) (FUKUDA et al., 1997)

oder an Scaffold-Proteine wie Sef1, Metalloprotease 1 (MP1) und Tubulin vor (TANOUE et al., 2000). MEK1/2 sind Proteinkinasen mit dualer Spezifität, die ERK1/2 an den Aminosäureresten Threonin (Thr) und Tyrosin (Tyr) (Reste 183 und 185 bei ERK2 von Mäusen) im TEY-Motiv in der Aktivierungsschleife phosphorylieren und dadurch aktivieren können

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade vermittelt Proliferation. Ein

(SEGER AND KREBS, 1995). Daraufhin vollzieht ERK1/2 eine starke Konformationsänderung und löst sich von seinen Ankerproteinen (WOLF et al., Agonist (z. B. Wachstumsfaktor) aktiviert den Gq-Protein-gekoppelten Rezeptor. Dadurch wird die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade aktiviert und ERK1/2 durch MEK1/2 am TEY-Motiv zweifach phosphoryliert. Das so aktivierte

ERK1/2 dimerisiert. Eine Gβγ-Untereinheit bindet an das Dimer. Daraufhin autophosphoryliert ERK1/2 an Thr188 und transloziert in den Zellkern. Dort werden Zielproteine phosphoryliert, die für Zellproliferation verantwortlich sind (Modifiziert nach: LORENZ et al., 2009b) 2001). Durch anschließende Dimerisierung von ERK1/2 und Bindung der von Gq abdissoziierten βγ- Untereinheiten sowie Autophosphorylierung von ERK2 an Thr188 (LORENZ et al., 2009a) translozieren etwa 60-70% der ERK-Moleküle in den Nukleus (CHEN et al., 1992). Die phosphorylierte Aktivierungsschleife von ERK1/2 kann an Importin7 (Imp7) binden, welches dann ERK1/2 durch die Nukleoporine (NUPs) in den Zellkern eskortiert (ZEHORAI et al., 2010). ERK1/2 kann neben dem aktiven Transport als Dimer durch Imp7 auch noch passiv als Monomer in den Kern gelangen. Die passive Diffusion ist jedoch bedeutend langsamer als der aktive Transport. (ADACHI et al., 1999).

Die Phosphorylierung und darauffolgende Konformationsänderung von ERK2 führen dazu, dass die drei Leucinreste Leu333, Leu336 und Leu344 näher an die Oberfläche des Moleküls gelangen. Der Histidinrest His176 wird dadurch stabilisiert. Zwischen dem Glutamatrest Glu343 des einen ERK2-Moleküls und His176 eines ERK2- Dimerisierungspartners bilden sich Ionenbindungen aus. Zwischen den Aminosäureresten, die diese beiden Ionenbindungen bilden, liegen 10 weitere Aminosäuren, die eine Dimerisierungsschnittstelle formen und durch hydrophobe Wechselwirkungen miteinander interagieren. So entsteht ein hydrophober Zipper (COBB AND GOLDSMITH, 2000).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Schematische Darstellung der ERK2-Dimerisierungsschnittstelle: In Gelb die Aminosäurereste, die die Schnittstelle formen, mit Sternen markierte Reste stammen vom Dimerisierungspartner, zwei Ionenbindungen zwischen H176 und E343 finden sich an beiden Enden eines hydrophoben Zippers (WILSBACHER et al., 2006)

Bei Stimulation durch Wachstumsfaktoren kann ERK2 auf diese Weise Dimere bilden und in den Nukleus translozieren. Das führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von ERK1/2-Zielproteinen im Kern wie dem Transkriptionsfaktor E twenty-six-like 1 (Elk-1). Dieser löst die Transkription von Genen aus, die den Übergang des Zellzyklus von der G0/G1-Phase in die S-Phase induzieren. Über diesen Mechanismus beeinflusst ERK1/2 die Proliferation von Zellen (TORII et al., 2006).

DIE RAF-MEK1/2-ERK1/2-KASKADE IN DER KREBSENTSTEHUNG UND -THERAPIE

Kommt es bei der Raf-MEK1/2-ERK1/2-Signalkaskade zu aktivierenden Mutationen, können maligne Entartungen und Krebs entstehen. In 20-30% aller humanen Krebserkrankungen liegt eine aktivierende Punktmutation des rat sarcoma-Proteins (Ras) vor. Am häufigsten ist dabei der Subtyp K-Ras betroffen (TORII et al., 2006). Bei K-Ras handelt es sich um ein kleines G-Protein, das Wachstumsfaktorrezeptoren wie dem EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor) nachgeschaltet ist und an der Kanzerogenese von 36% der Colorectalkarzinome beteiligt ist (ANDREYEV et al., 1998). K-Ras-Mutationen können zur Aktivierung des MAPK-Signalwegs führen und dadurch Zellproliferation auslösen. Colorectalkarzinome mit dieser Mutation können deshalb nicht effektiv mit dem anti-EGFR chimären monoklonalen Antikörper Cetuximab behandelt werden, da dessen Wirkort in der MAPK-Kaskade oberhalb von K-Ras liegt (LIEVRE et al., 2006). Wegen der großen Häufigkeit von Ras-Mutationen in menschlichen Tumoren galt Ras lange Zeit als vielversprechender Ansatzpunkt für Therapeutika. Doch trotz vieler intensiver Versuche ist es bis heute nicht gelungen einen funktionierenden Ras-Inhibitor auf den Markt zu bringen (SEBOLT-LEOPOLD, 2008).

Auch B-Raf-(rapidly accelerated fibrosarcoma)-Mutationen können den Signalweg aktivieren und kommen in circa 7% der humanen Krebserkrankungen, besonders in Melanomen, vor. Eine besonders häufig auftretende aktivierende Mutation ist dabei der Austausch von Valin gegen Glutamat an Position 600 (V600E) (TORII et al., 2006). Der B-Raf-Inhibitor PLX4032 (Vemurafenib) kann selektiv die Proliferation von malignen Melanomzellen, die diese Mutation tragen, inhibieren und in diesen Zellen Apoptose auslösen (LEE et al., 2010). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass B-Raf-Mutanten stark von der MEK-Aktivität abhängen, da sie besonders sensitiv auf MEK-Inhibitoren reagieren. Bei V600E-B-Raf- Mutanten kommt es bei Inhibition von MEK zu reduzierter Cyclin-D-Expression und Retinoblastomprotein-(Rb)-Hypophosphorylierung, was Zellzyklusarrest in der G1-Phase zur Folge hat (SOLIT et al., 2006). Ein MEK-Inhibitor, der bereits klinische Anwendung bei Melanomen mit V600E- oder V600K-Mutationen (Substitution von Valin 600 durch Lysin) findet, ist zum Beispiel Trametinib (FLAHERTY et al., 2012). Allerdings wurde beobachtet, dass gegen diesen Inhibitor, wie auch gegen Vemurafenib, nach einigen Monaten der Therapie Resistenzen entstehen (SOLIT AND ROSEN, 2011).

Zur Inhibierung von MEK1/2 in vitro wurde in den hier beschriebenen Versuchen der synthetische MEK-Inhibitor PD98059 [2-(2‘-Amino-3‘-methylphenyl)-Oxanaphthalen-4-on] von Calbiochem verwendet. Dieser hemmt selektiv MEK1 und 2 und verhindert so die Aktivierung und Phosphorylierung von ERK1/2 und die darauffolgende Phosphorylierung von ERK1/2-Zielproteinen. Auf diese Weise kann das Wachstum von Zellen in Kultur inhibiert werden. Der Effekt von PD98059 auf die Zellen ist reversibel. Wenn der Wirkstoff aus dem Zellkulturmedium entfernt wird, wird der wachstumshemmende Effekt auf die Zellen rasch aufgehoben (DUDLEY et al., 1995). Außerdem konnte bereits gezeigt werden, dass PD98059 unter anderem in Kardiomyozyten von neugeborenen Ratten Abbildung 4: Strukturformel des MEK-Inhibitors Apoptose auslöst (RUPPERT et al., 2013).

FRAGESTELLUNG

Wegen der Resistenzentwicklung gegen B-Rafund MEK-Inhibitoren, vor allem in Melanompatienten (SOLIT AND ROSEN, 2011), verlagerte sich das Interesse in der aktuellen Forschung zunehmend auf die MAP-Kinasen ERK1/2. Es konnte bereits gezeigt werden, dass Interferenz mit der Thr188-Phosphorylierung von ERK1/2 durch Hemmung der Dimerisierung von ERK1/2 selektiv eine pathologische Hypertrophie des Herzens in Mäusen inhibiert, während die anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 in diesem Gewebe erhalten bleiben (RUPPERT et al., 2013). Der Mechanismus der Dimerisierungshemmung soll in den hier beschriebenen Versuchen nun auf Krebszellen aus humanen Colon-Adenokarzinomen übertragen werden. Ziel der Versuche ist es nachzuweisen, ob eine Inhibition der ERK1/2- Dimerisierung das entartete Wachstum der Krebszellen selektiv hemmen kann. Dazu wurde ein in der AG Lorenz bereits vorhandenes Adenovirus verwendet, das die Colon-Karzinomzellen mit einem Plasmid transduziert, auf dem das Gen für ein kurzes Peptid liegt. Dieses Peptid besteht aus der C-terminalen Sequenz des ERK2-Gens, die die Aminosäuren des hydrophoben Zippers enthält, und einem N-terminalen myc-tag (myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ ). Das myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptid verhindert die Dimerisierung ERK1/2 und die Expression von proliferations-assoziierten ERK1/2-Zielgenen. Vermutlich ist dies dadurch möglich, dass es an die ERK-ERK-Interaktionsstelle bindet und so die Dimerisierung und Translokation in den Nukleus verhindert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Aminosäuresequenz des myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptids: Bestehend aus N-terminalem myc-tag und C-terminalem ERK2-Dimerisierungs-Interface Die Dimerisierung von ERK könnte neue Strategien zur Behandlung von proliferationsabhängigen Krankheiten wie Krebs offen legen. In dieser Arbeit werden drei verschiedene humane Colon-Adenokarzinom-Zelllinien untersucht, die entweder aktivierende Mutationen in K-Ras oder B-Raf tragen oder K-Raswt sind. Durch Transduktion mit dem myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptidvirus soll die Dimerisierung und nukleäre Translokation von ERK1/2 und damit die Proliferation der Krebszellen gehemmt werden, ohne dass dabei die ERK1/2-Aktivität unterbunden wird. Zur Messung der Proliferationshemmung diente der Tritium-Thymidin-Inkorporations-Assay. Zur Überprüfung der Kinaseaktivität von ERK1/2 nach Behandlung der Zellen mit dem myc-ERK2³⁰⁹ -³⁵⁷ -Peptidvirus oder mit dem MEK-Inhibitor PD98059 werden Western-Blot-Versuche durchgeführt. Um die Apoptoserate der transduzierten Zellen zu bestimmen, wurde die Caspase-Aktivität mit einem lumineszenz-basierten Assay gemessen. Letzterer Versuch konnte aus Zeitgründen nur einmal durchgeführt werden, weswegen die Ergebnisse vorläufig sind.

4 MATERIAL UND METHODEN

4.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN

Nitril-Handschuhe (Medline), Parafilm (Bemis), Pipettenspitzen (Gilson), safe-lock Reaktionsgefäße 1.5ml/2ml (eppendorf), Reaktionsgefäße 1.5ml (Roth), Zellkulturschalen (Sarstedt), Multiwellschalen (Sarstedt), Einmal-Pasteurpipetten Kunststoff (Hartenstein).

4.2 ZELLEN UND ZELLKULTUR

Die Versuche wurden an drei verschiedenen Colon-Adenokarzinom-Zelllinien durchgeführt: Colo 320, LS174T und HT29. Bei LS174T handelt es sich um eine K-Ras+-Mutante. HT29 sind B-Raf+ und Colo320 exprimieren wildtypisches K-Ras. Alle Zelllinien wurden auf 15cm-Kulturschalen (Sarstedt) bei 37°C und 5% CO2 gehalten. Colo320 und LS174T in RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) + 0,001% Penicillin Streptomycin (10000 Units/ml Penicillin, 10000µg/ml Streptomycin, Gibco Life Technologies) + 0,001% L-Glutamin (200mM, PAN Biotech) + 10% fetales bovines Serum (FBS, Biochrom AG), HT29 in McCoy’s 5A (Gibco Life Technologies) + 0,001% Penicillin Streptomycin (10 000 Units/ml Penicillin, 10000µg/ml Streptomycin, Gibco Life Technologies) + 0,001% L-Glutamin (200mM, PAN Biotech) + 10% FBS (Biochrom AG). Die Zellen wurden zweimal in der Woche passagiert und circa 1:6 aufgeteilt. LS174T und HT29 wurden dafür einmal mit DPBS (Dulbecco’s Phophate-Buffered Saline - Calciumund Magnesiumfrei - Gibco Life Technologies) gewaschen und dann mit Trypsin/EDTA (PAN Biotech) abgelöst und in frischem Medium aufgenommen. Colo320 konnten durch Aufund Abpipettieren in Suspension genommen werden. Für die Aussaat der Zellen wurde dann die Zellzahl pro Milliliter in der Zellsuspension bestimmt. Dafür wurde eine Neubauer-Zählkammer verwendet. Durch Verdünnung mit Zellkulturmedium konnte die Zellzahl dann auf den gewünschten Wert eingestellt werden.

POLY-D-LYSIN

Bevor die Zellen in 12- und 24-well-Platten (Sarstedt) ausgesät werden konnten, wurden die Platten mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet. Dieses sorgt dafür, dass die Zellen stärker adhärieren können, indem es auf dem well-Boden eine kationische Oberfläche schafft, an die die anionische Zelloberfläche fest binden kann. Durch die starke Anheftung können die Zellen bequem und einfach experimentell manipuliert werden, ohne dass sie sich dabei wieder ablösen. Da natürlicherweise nur Poly-L-Lysin vorkommt, kann PDL enzymatisch auch nicht abgebaut werden (MAZIA et al., 1975).

Das Poly-D-Lysin der Firma Sigma wurde 1:150 in DPBS verdünnt. Dann wurde der Boden eines jeden wells mit dieser PDL-Lösung bedeckt. Da die Lösung lichtempfindlich ist, blieb die Beleuchtung der Sterilbank dabei ausgeschaltet.

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