Isolierung von Alpha-Lactalbumin. Ein Versuchsprotokoll

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Methoden & Beobachtungen

3 Ergebnisse & Diskussion

4 Literaturverzeichnis

1 Einleitung

Kuhmilch enthält die drei Hauptklassen der Milchproteine: Caseine (ca. 2,8 %), α-Lactalbumine (ca. 0,45 %) und β-Lactoglobuline (ca. 0,15 %). Im Versuch soll α-Lactalbumine durch Trennverfahren isoliert werden. Dazu er- folgten eine Abtrennung durch Hitzedenaturierung bei 40 °C, eine Ammoniumsulfatfällung und eine Gelchromatographie. α-Lactalbumine enthält in einer Sequenz 123 Aminosäuren und besitzt eine Größe von 15,5 kDa.

2 Methoden & Beobachtungen

Die ersten zwei Methoden des Trennverfahrens sind die Hitzedenaturie- rung bei 40 °C und die Salzfällung (Ammoniumsulfatpräzipitation), welche miteinander experimentell verbunden sind. Entrahmte Milch wird dazu erhitzt, sobald eine Temperatur von ca. 20 °C erreicht wird, werden 21,5 g wasserfrei- es Ammoniumsulfat in langsamen Schritten zur Lösung hinzugegeben. Die Lösung wird bis auf 40 °C erhitzt. Bei diesem Vorgang wird ständig gerührt, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösung nicht schäumt, da die Proteine durch das Schäumen mit der Luft in Kontakt kommen und dadurch zerstört werden können, da Proteine sehr leicht anfällig sind. Nach der Zugabe wird weitere 15 Minuten gerührt und anschließend abfiltriert. Der Niederschlag ist zu entsorgen, das Filtrat wird für das nächste Trennungsverfahren genutzt.

In der tatsächlichen Durchführung wurden alle Vorschriften eingehal- ten. Durch die sorgfältige Beachtung der Anweisung, konnte ein Schäumen verhindert werden. Nach dem Filtrieren wurde der nächste Versuchsschritt ein- geleitet.

Das Filtrat wird im nächsten Trennungsverfahren, der Säurefällung, unter Rühren auf einen pH-Wert von 3.0 (±0.1) mit 1 N HCl eingestellt. Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand verworfen.

In der tatsächlichen Durchführung wurde die Glaselektrode zunächst mit destilliertem Wasser, einer Pufferlösung pH 4 und einer Pufferlösung pH 7 kalibriert. Mit der Glaselektrode wurde der pH-Wert der Lösung ständig kon- trolliert, da bei der Säurefällung ein präzises Arbeiten notwendig ist. Tropfen- weise wurden insgesamt 4800 μl 1 N HCl hinzugegeben bis ein pH-Wert von 3,07 eingestellt wurde. Es wurden 50 ml der Suspension in einen Falcon Behälter überführt und bei 8500 rpm 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert.

Der Rückstand wird mit der Pufferlösung (50 ml 1 MTRIS-HCl pH 7,3 + 1 ml 1 M CaCl3 in 1 L H2O) resuspendiert.

Dazu wurden in der tatsächlichen Durchführung 1000 μl der Pufferlösung in den Falcon Behälter gegeben und herauf- und runter pipettiert. Zur besseren Resuspendierung wurden 100 μl 1 N NaOH dazu gegeben.

Die nächste Methode der Trennverfahren ist die Gelchromatographie (Sephadex G50). In diesem Trennverfahren gilt das Charakteristikum der Grö- ße. Zur Markierung der unterschiedlichen Proteine wird ein Marker (Farbstoff) verwendet. Bei diesem handelt es sich um einer Kombination aus den Farbstof- fen Bluedextran mit einer Größe von ca. 100 kDa und Bromophenolblau mit einer Größe von ca. 0,5 kDa. 100 μl dieser Kombination werden zu 1000 μl der Proteinlösung gegeben und vermischt. Die Gelchromatographie wird durchge- führt, wobei darauf zu achten ist, dass die Säule nicht austrocknet, so dass beim Eluieren immer für ausreichend Pufferlösung zu sorgen ist.

In der tatsächlichen Durchführung wurden zunächst 1500 μl der Prote- inlösung zentrifugiert, damit die Säule nicht durch Verunreinigungen verstopf- te. Anschließend wurden 1000 μl der zenrifugierten Lösung mit 100 μl des Markers durch herauf- und runter pipettieren vermischt. Die gefärbte Pufferlö- sung wurde auf die Säule gegeben und mit der Pufferlösung eluiert. Dabei ist aufgefallen, dass sich die Farbstoffe getrennt haben. Bei der Gelchromatogra- phie ist die Größe der durchlaufenden Stoffe das entscheidende Charakteristi- kum, große Moleküle durchlaufen die Säule schneller, da sie nicht, wie die kleinen Moleküle die Poren passieren müssen. Durch die Auftrennung konnte exakt gesehen werden, wann die Fraktionen aufgefangen werden mussten. Bluedextran ist mit ca. 100 kDa am größten und passierte die Säule als erstes (hellblau), anschließend wurden die Fraktionen von α-Lactalbumine mit einer Größe von 15,5 kDa aufgefangen, zum Schluss durchlief Bromophenolblau mit ca. 0,5 kDa die Säule. Dies ist auch der Grund dafür, warum die beiden Farb- stoffe genutzt wurden. Die Fraktionen wurden zu 5 ml in Falcon Behältern aufgefangen. Aus diesen 15 Fraktionen wurden je 1000 μl in Küvetten für die Photometrie überführt. Eine Küvette wurde mit 1000 μl Pufferlösung als Leerwert für die Photometrie befüllt.

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Bild 1: Gelchromatographie. Markeraufteilung ist klar zu erkennen.

Unter der Photometrie versteht man die Messung von Lichtintensität (bzw. Lichtabsorption). Die Photometrie kann zur quantitativen chemischen Analyse eingesetzt werden. Proteine lassen sich spektrophotometrisch nach- weisen, da die aromatischen Aminosäure-Reste eine ππ* Absorption bei 280 nm zeigen (die Peptidbindung zeigt eine Absorption bei 250 nm). Wenn ange- nommen werden kann, dass das Lambert-Beersch Gesetz gilt, kann die Kon- zentration der Probe anhand der Extinktion ermittelt werden (vgl. Voet/Voet S. 110). Die Methode der photometrischen Bestimmung beruht auf der Extiktion der Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan bei 280 nm (vgl. Diss. Berlin).

3 Ergebnisse & Diskussion

Zur Ergebnisssicherung ist die Auswertung der Photometrie relevant. Wie anzunehmen war, steigen die Extinktionen (und somit die Konzentration bei Beachtung des Lambert Beer´schen Gesetzes) zunächst, bis sie zu ihrem Maximum gelangen und fallen anschließend. Das liegt daran, dass die Fraktio- nen aus dem mittleren Bereich die höchste Proteinkonzentration aufweisen.

Tabelle 1: Datenermittlung vom 12.05.2016

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Wie zu erkennen ist steigen die Werte zunächst tendentiell (einige Unregelmäßigkeiten werden im Folgenden diskutiert), bis sie einen Maximalwert von 0,895 bei der 4. Fraktion erreicht haben und dann wieder fallen. Die graphische Auswertung verstärkt die zuvor getätigten Aussagen:

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Es wurden keine so hohen Extinktionen und somit Konzentration er- reicht, da es sein kann, dass Proteine bei der Versuchsdurchführung zerstört wurden, da sie sehr empfindlich sind. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die Protein-Konzentration, aufgrund der vielen Aufreinigungsschritte, stark abgesunken ist.

Allgemein kann bemerkt werden, dass es mittlerweile durchaus bessere Methoden gibt. Analytisch effektiver ist zum Beispiel die Kolorimetrie im Vergleich zur Photometrie. Bei der Photometrie kommt es oft zu Verunreinigungen, wodurch die Konzentration nur schwer messbar ist. Weiterhin ist es möglich eine zweite Messung der Extinktion im Bereich von 260 nm vorzunehmen, um die Werte zu korrigieren, zu dieser Erkenntnis sind Warburg und Christian gekommen (vgl. Matthies).

4 Literaturverzeichnis

Matthies, Inge Elisabeth: Isolierung und physiologische sowie biochemische Charakterisierung eines Zearalenon-abbauenden Enzyms aus Mykoparasiten Gliocladium roseum. Dissertation, Hohenheim 2003. Zitiert als Matthies.

Praktikumsskript zum Versuch F-02, Isolierung von α-Lactalbumine , Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Biochemie II des Ruhr-Universität Bochum.

Voet, Donald/ Voet, Judith G./ Pratt, Charlotte W.: Lehrbuch der Biochemie, Weinheim 2010. Zitiert als Voet/Voet.

Vollhardt, K. Peter C./ Schore, Neil E.: Organische Chemie, Weinheim 2005.