Cytogenetik. Praktikum zu den unterschiedlichen Möglichkeiten der Lichtmikroskopie

Inhaltsverzeichnis

Einleitung

Protokoll 1: Mikroskopie

Protokoll 2: Identifizierung des Geschlechtschromatins

Protokoll 3: Blutkulturansatz

Protokoll 4: Zwiebelchromosomenpräparation

Protokoll 5: Präparation von Mitose-Chromosomen aus Neuroblasten

Protokoll 6: Polytänchromosomen

Protokoll 7: Hodenpräparation von Drosophila hydei

Protokoll 8: Artemia und Moospolster

Literaturliste

Einleitung

Die Cytogenetik hat die Erfassung von Vererbungsabläufen auf der Ebene der Zelle zur Aufgabe. Sie stellt eine direkte Berührung von Genetik und Cytologie dar.

Die Schwerpunkte liegen in der Erforschung von Struktur, Funktion, Plastizität und Evolution des Erbgutes und den molekular-cytogenetischen und epigenetischen Grundlagen der Vererbung. Essentielle Regionen von Chromosomen (Centromer, Telomer, Nukleolusorganisatoren, Eu- und Heterochromatinbereiche) werden molekular und cytogenetisch charakterisiert.

Das Praktikum soll einen Einblick in die lichtmikroskopischen Strukturen des Zellkerns verschaffen. Es werden von einer Reihe von Objekten mikroskopische Präparate hergestellt und untersucht. Verschiedene Präparations-, Färbe- und Mikroskopiertechniken werden dabei angewandt. Schwerpunkte sind der Gestaltwandel des Zellkerns während der Meiose, Chromosomenstruktur und Morphologie, Riesenchromosomen und Spermatogenese von Drosophila, und Geschlechtschromosomen. Das Praktikum will den Teilnehmern auch die Fertigkeit zur selbständigen Herstellung einfacher mikroskopischer Präparate von Zellen und Chromosomen vermitteln. Die Zeichnung der zytologischen Objekte soll helfen, die Beobachtung zu schärfen.

Protokoll 1: Mikroskopie

Theoretische Einführung:

geometrische Optik

Wer an einem Gegenstand feine Einzelheiten sehen will, muss bekanntlich nahe an ihn herangehen. Eng nebeneinander liegende Details sind eben nur aus der Nähe voneinander zu unterscheiden, während sie aus größerer Entfernung scheinbar miteinander verschmelzen und einheitliche Flächen bilden. Wenn der Gegenstand zu nahe vor dem Auge liegt, kann er wegen der begrenzten Akkomodationsfähigkeit nicht mehr scharf abgebildet werden. Deshalb muss eine Mindestentfernung zwischen Gegenstand und Auge eingehalten werden. Das beste Auflösungsvermögen erzielt man, wenn Objekte durchschnittlich bis auf 25 cm an das Auge herangebracht werden und 0,15 – 0,3 mm auseinander liegen. Die Vergrößerung des Sehwinkels führt zu einer besseren Auflösung. Hilfsmittel zu dessen Vergrößerung sind Sammellinsen. Sie sammeln Lichtstrahlen, die parallel zur optischen Achse einfallen in einem Brennpunkt (Abb.1). Lichtstrahlen (verlaufen in der Luft), die beim Eindringen in ein anderes Medium ihre Verlaufrichtung ändern heißen gebrochen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.1: Sammellinse (http://www.mikroskopie.de/kurse/strahlen.htm )

Diese Lichtbrechung kann mit der Formel: n = sin α/ sin α´ berechnet werden. Das Ausmaß von n hängt von der Art des Stoffes ab, in dem das Licht aus der Luft übertritt und wird von der Lichtfarbe beeinflusst. Chromatische Aberrationen sind Abbildungsfehler (Fehler wie Unschärfen, Farbsäume und geometrische Verzerrungen) von Objektiven, bsw. bei Mikroskopen. Die Lichtfarben bündeln sich nicht im Brennpunkt eines Objektivs. Die chromatische Abberation wirkt sich katastrophal auf die Bildschärfe und den Kontrast aus, denn die verschiedenfarbigen Lichtstrahlen besitzen unterschiedliche Brennpunkte. Blaue Strahlen werden stärker gebrochen als Rote (Dispersion). Eine Korrektur kann durch so genannte Achromaten erfolgen.

Wirkt eine Sammellinse als Lupe, soll sie immer so benutzt werden, dass das Bild nicht in konventioneller Sehweite, sondern im Unendlichen entsteht. Dazu muss der Gegenstand in die vordere Brennebene der Linse gebracht werden.

Das Bild wird vergrößert und seitenrichtig dargestellt.

Es lässt sich aber nicht auf einer Projektionswand auffangen sondern erscheint virtuell.

Um nun die Vergrößerung einer Lupe zahlenmäßig auszudrücken, sind gewisse Normbedingungen international festgelegt worden. Die Sehweite ohne Lupe ist mit 250 mm normiert, weil sie etwa der Leseentfernung entspricht und weil der normalsichtige Mensch durchschnittlich bis zu 45 Jahren noch bis zu dieser Sehweite ohne Lesebrille akkomodieren kann. Als Lupenvergrößerung ergibt sich ein Sehwinkelverhältnis "mit Lupe" zu "ohne Lupe", das gleich dem Verhältnis von 250 mm zur Brennweite der Lupe ist: V = 250/ f.

Das Mikroskop

Das Mikroskop ist ein System aus einem Projektionsapparat (Sammellinse) und einer Lupe. Sein Auflösungsvermögen wird durch die Wellenlänge des benutzten Lichtes und die numerische Apertur des Objektivs bestimmt. Die numerische Apertur ist das Produkt aus dem Brechungsindex (für Luft n = 1) des Mediums zwischen Objekt und Objektiv und dem Sinus des halben Öffnungswinkels des Objektivs (Winkel zwischen optischer Achse des Gerätes und dem äußersten Lichtstrahl).

nach E. Abbe:

A = n x sin α

Sie wird allen Objektiven aufgraviert. Die höchste numerische Apertur mit Trockenobjektiven beträgt 0,95.

Die Frontlinsen der Immersionsobjektive und die Präparatoberfläche werden mit einem Medium verbunden, das einen höheren Brechungsindex hat als Luft (Ölimmersion). Zum Beispiel Immersionsöl mit einem Brechungsindex von n = 1,515 oder Anisol mit n = 1,5168. Dadurch gelangen auch stärker geneigte Lichtstrahlen noch in das Objektiv (Abb.2). Die numerische Apertur sowie das Auflösungsvermögen des Objektivs nehmen zu.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.2: Der Einfluss der Immersion auf das Auflösungsvermögen (http://hoersaal.physik.uni-halle.de/Optik_Dias.html )

Je kürzer die Wellenlänge des benutzten Lichtes und je höher die numerische Apertur, umso größer ist das Auflösungsvermögen. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops beträgt ca.0,15 μm, das eines Elektronenmikroskops sogar 0,15 nm.

Der Kondensor ist ein Linsensystem mit einer integrierten Irisblende, der Aperturblende. Der Kondensor befindet sich unterhalb des Objekttisches. Er dient der optimalen Aufbereitung des von der Glühlampe erzeugten Lichts. Bei Labor- und Forschungsmikroskopen wird der Kondensor in einem höhenverstellbaren und zentrierbaren Kondensorträger befestigt. Ein Schließen der Aperturblende bewirkt eine Abnahme der Bildhelligkeit und der Auflösung sowie eine Zunahme des Kontrastes. Die Aperturblende wird folglich benutzt um einen möglichst günstigen Kompromiss zwischen der Auflösung und dem Kontrast im mikroskopischen Bild einzustellen.

Im Stativfuß befindet sich bei allen leistungsfähigeren Mikroskopen eine weitere Irisblende, die Leuchtfeldblende. Die Leuchtfeldblende lässt sich in ihrem Durchmesser exakt an die Größe des Gesichtsfeldes anpassen. Folglich bewirkt ein Schließen dieser Blende keine Abnahme der Bildhelligkeit, sondern eine Reduzierung des ausgeleuchteten Bereichs im mikroskopischen Endbild. Durch die Leuchtfeldblende lassen sich somit folgende Einstellungen vornehmen: Im Präparat kann gerade der beobachtete Ausschnitt beleuchtet werden. Dadurch wird das Präparat außerhalb des beobachteten Bereichs vor der starken Beleuchtungsstrahlung geschützt. Die Entstehung von kontrastminderndem Falschlicht wird reduziert.

Das Objektiv sorgt für die erste Vergrößerungsstufe, in der ein vergrößertes, seitenverkehrtes, reelles Zwischenbild entsteht. Dieses wird mit dem Okular (welches die Lupe darstellt) nochmals vergrößert und führt nun zu einem virtuellen Endbild.

Die Maßstabszahl des Objektivs gibt an, wie stark die Vergrößerung im Zwischenbild ausfällt (z.B. 40). Das Zwischenbild wird dann durch das Okular nachvergrößert (z.B. 10). Für die Gesamtvergrößerung ergibt sich nach folgender Formel:

VM = VOb x VOk

VM = 40 x 10 = 400

Wellenoptik

Licht besitzt den Charakter von Wellenzügen. Die Helligkeit des Lichts wird dabei durch die Amplitude der Welle bestimmt. Betrachtet man einen Punkt auf einer Lichtwelle, so befindet sich dieser auf einer bestimmten Phase des Wellenzuges. Wellenbewegung wird beim Aufeinandertreffen zweier Wellenberge am Treffpunkt maximal verstärkt und beim Zusammenkommen eines Wellentals mit einem Wellenberg scheinbar gelöscht. Bei Wellenbewegungen tritt unter bestimmten Voraussetzungen Beugung auf.

Eine Wellenfront trifft auf einen schmalen Spalt (Objekt) und wird gebeugt. Aus dem Spalt tritt eine Kugelwelle aus, welche aus untereinander parallelen Strahlen besteht. Diese nehmen einen bestimmten Winkel (β) zum direkten Mikroskopierlicht ein. Nach dem Huygensschen Prinzip ist jeder Punkt einer bestehenden Wellenfront Ausgangspunkt einer neuen kugelförmigen Elementarwelle, die die gleiche Ausbreitungsgeschwindigkeit und Frequenz wie die ursprüngliche Welle hat. Treten diese Strahlen in ein Mikroskopobjektiv ein, so werden sie in der Brennebene vereinigt und es kommt zur Interferenz zwischen den Wellenzügen. Da die Strahlen alle phasengleich sind, kommt es zu einem Maximum 0.Ordnung (max. Verstärkung, max. Helligkeit). Lichtwellen die bei einer Phasendifferenz von einer halben Wellenlänge interferieren löschen sich gegenseitig aus. Im Bereich der Objektivbrennebene entsteht ein Minimum (Dunkelheit). Wenn der Winkel β weiter zunimmt, so nimmt auch der Gangunterschied zwischen den Strahlen zu. Durch Interferenz entsteht bei einer Phasendifferenz von 1,5 Wellenlängen ein weiteres, aber weniger helles Maximum (Nebenmaximum). Durch die Verteilung von hellen und dunklen Zonen in der Brennebene des Objektivs entsteht eine Beugungsfigur. Sie ist für jedes Präparat charakteristisch und wird nach der Theorie der sekundären Abbildung von Ernst Abbe als primäres Zwischenbild bezeichnet.

Die schiefe Beleuchtung ist ebenfalls eine interessante Beleuchtungsart die die Objektstrukturen und Feinheiten auf einfache Weise darstellen kann, da sie schief, also von der Seite erfolgt. Dadurch wird der Kontrast erhöht und die Objekte erscheinen plastisch.

Das Auflösungsvermögen der Mikroskopobjektive wird durch die Objektivapertur, die Kondensorapertur und die Wellenlänge des Mikroskopierlichts beeinflusst.

Die Grenze der Auflösung ist dann erreicht, wenn die Strukturen so nahe beieinander liegen, dass der Winkel den die Nebenmaxima mit dem Hauptmaximum bilden (β) praktisch ebenso groß wie der halbe Öffnungswinkel des Objektivs wird.

Beugungswinkel = Gegenkathete/Hypothenuse

sin α = λ/ d

Dunkelfeldmikroskopie

Beim Dunkelfeldmikroskop gelangt kein direktes Mikroskopierlicht in das Objektiv. Das Präparat wird hierzu nicht mit einem Kegel, sondern nur mit einem Kegelmantel beleuchtet. Dieser Kegelmantel wird durch einen speziellen Kondensor (Dunkelfeldkondensor) erzeugt. Befindet sich kein Präparat im Strahlengang, so bleibt im Dunkelfeld das Gesichtsfeld beim Blick in das Okular völlig dunkel. Wird dagegen ein Präparat in den Strahlengang gebracht, so kommt es zu einer teilweisen "Ablenkung" des Mikroskopierlichts an den Präparatstrukturen durch Lichtbrechung, Reflexion und insbesondere durch Beugung. Dieses abgelenkte Licht gelangt nun teilweise in das Objektiv und erzeugt im Mikroskop ein sichtbares Bild.

Die mikroskopischen Objekte werden hell leuchtend auf einem dunklen Hintergrund dargestellt. Dabei leuchten besonders die Ränder (Konturen) auf.

Das Innere der Untersuchungsobjekte bleibt jedoch ebenfalls meist dunkel (= negativer Kontrast).

Phasenkontrast

Dieses Verfahren eignet sich für sehr dünne, farblose Objekte. Sie ändern nicht die Amplitude des Lichtes, sondern die Phasen der Lichtwellen. Zur Realisierung sind spezielle Objektive und ein spezieller Kondensor nötig. Der Kondensor hat zentrierbare Ringblenden, die einen hohlen Lichtkegel erzeugen, der das Objekt beleuchtet. In der hinteren Brennebene der Objektive sind dünne Metallringe aufgedampft, die mit den Ringblenden zusammenpassen müssen. Der Metallring absorbiert einen gewissen Lichtteil und den Rest um eine ¼ Wellenlänge verzögert. Den Metallring muss das vom Objekt ungebeugte Licht passieren, während das gebeugte Licht neben dem Phasenring durch die hintere Brennebene tritt. Der gebeugte Lichtanteil interferiert nun in der Zwischenbildebene mit dem um ¼ λ verzögerten Lichtanteil. Dadurch tritt Verstärkung und Auslöschung ein und die Phasenunterschiede werden in Helligkeitsunterschiede umgewandelt.

Fluoreszenz

Licht wird von der Lichtquelle in Form kleiner Portionen ausgesandt. Wenn der Stoff die eingestrahlten Lichtquanten absorbiert, geht deren Energie auf ihn über. Diese Energie bewirkt, dass bestimmte Elektronen in den Atomen des fluoreszierenden Stoffes auf ein höheres Energieniveau angehoben werden. Nach einer kurzen Verweildauer fallen sie wieder auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück und setzen dabei die von den Lichtquanten stammende Energie in Form von Lichtstrahlung frei. Das vom fluoreszierenden Stoff ausgesandte Fluoreszenzlicht weist eine längere Wellenlänge auf, als das zur Bestrahlung verwendete Licht.

Primärfluoreszenz: z.B. fluoresziert Chlorophyll bei Anregung mit kurzwelligem Licht intensiv rot.

Sekundärfluoreszenz: nicht selbst fluoreszierende Objekte werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (Fluorochromierung), z.B. mit Acridinorange.

Eichung eines Messokulars

Die exakte mikroskopische Längenmessung erfolgt durch spezielle Messokulare. Das Messokular enthält eine Skala, auf der 1cm in 100 Teile geteilt ist. Wie groß der Abstand zwischen 2 Teilstrichen im Präparat ist (Mikrometerwert) hängt vom Abbildungsmaßstab der Objektive ab. Als Objektmikrometer dient ein Objektträger mit einer Skala (1mm in 100 Teile geteilt) die mit einem Deckglas bedeckt ist. Der Abstand zwischen 2 Teilstrichen beträgt 10 μm.

Häufigste Mikroskopierfehler

- verschmutzte Linsen
- falsche Ausleuchtung
- Kondensorstellung
- Lampenzentrierung
- Aperturblendengröße
- Revolver nicht am Anschlag
- Objektiv nicht eingeschraubt
- Nichtbeachtung von Bajonettrasten
- Immersionsobjektive ohne Medium
- Kondensorfrontlinse nicht in Stellung
- Optikkombination falsch
- Technische Präparatefehler
- Luftblasen
- Deckglasdicke
- Schmutz

Köhlern des Mikroskops

Ein Mikroskop wird geköhlert, um ein Präparat gleichmäßig, hell und nur in der benötigten Fläche auszuleuchten, damit es nicht unnötig starker Belichtung ausgesetzt wird. Außerdem sollen beim Köhlern störende Lichtreflexe weitestgehend beseitigt werden (Abb.3).

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Abb.3: Köhlersche Beleuchtung und Phasenblende justieren (http://www.mikroskopie.de)

Ziel des Versuches:

Richtiger Umgang, sowie Einstellung des Mikroskops und Beobachtung anhand von Fischmitosen.

Durchführung:

Köhlern des Mikroskops

1. Kondensor durch den Kondensortrieb in eine Position direkt unter dem Objekttisch bringen - Beleuchtung einschalten und das mit dem Deckglas nach oben aufgelegte Präparat mit Objektiv 10 oder 16 scharf stellen.
2. Leuchtfeldblende im Stativfuß ganz schließen - beim Blick in das Mikroskop erscheint ein unscharfes Bild der Blende. Wenn das mikroskopische Bild völlig dunkel wird, so befindet sich das Bild der Leuchtfeldblende außerhalb des Gesichtsfeldes und muss durch die seitlich am Kondensor vorhandenen Zentrierschrauben in die Mitte des Sehfeldes gebracht werden.
3. Kondensor so lange in der Höhe verstellen, bis die Ränder der Leuchtfeldblende (des Lichtflecks) scharf abgebildet werden. Bei manchen Mikroskopen besteht die Gefahr, dass man den Kondensor zu weit anhebt und es zu einer Kollision mit dem Objektträger kommt. Hier ist also etwas Vorsicht geboten.
4. Mit den Zentrierschrauben des Kondensorträgers das Bild der Leuchtfeldblende ggf. nochmals in die Mitte des Gesichtsfeldes bringen.
5. Leuchtfeldblende so weit öffnen, bis sie gerade aus dem Gesichtfeld verschwindet - wenn notwendig mit den Zentrierschrauben des Kondensorträgers leicht nachzentrieren.
6. Mit der Aperturblende des Kondensors (Kondensorblende) den optimalen Kompromiss aus Kontrast und Auflösung für das mikroskopische Bild einstellen. Die Aperturblende soweit schließen, dass beim Herausnehmen des Okulars aus dem Tubus die hintere Linse des Objektivs zu 2/3 bis 3/4 ausgeleuchtet ist.

Phasenpräparat

Wird das Phasenkontrast-Mikroskop erstmals benutzt, so müssen als nächstes unbedingt die Phasenringblenden des Kondensors justiert werden.

7. Das Okular aus dem Okularstutzen entfernen.
8. Das Hilfsmikroskop in den Okularstutzen schieben.
9. Mit dem Hilfsmikroskop die hintere Brennebene des Objektivs fokussieren (es müssen dann sowohl das helle Bild der Phasenringblende als auch der dunkle Phasenring des Objektivs scharf erkennbar sein).
10. Mit den Zentrierschrauben des Kondensors das Bild der Phasenringblende (hell) und den Phasenring des Objektivs (dunkel) zur Deckung bringen (Zentrierschrauben des Kondensors nicht mit der Zentriervorrichtung des Kondensorträgers verwechseln!).
11. Das Bild der hellen Phasenringblende muss komplett vom Phasenring überdeckt werden. Danach wird das Hilfsmikroskop wieder gegen das Okular ausgetauscht.

Ergebnisse:

Nach dem exakten Köhlern des Mikroskops konnte man die einzelnen Stadien der Fischmitosen gut erkennen und zeichnen. Diese sind auf den Zeichnungen der Anhänge 1-3 zu sehen.

Ziel des Versuches:

Eichen des Mikroskops und des Binokulars für Längenmessungen. Messung eines Epithelzellkerns.

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