Das resistenzbrechende Antibiotikum Teixobactin. Synthese eines Arginin-Derivates

Inhalt

I. Einleitung
1. Antibiotika
2. Teixobactin

II. Allgemeiner Teil
1. Arg-Teixobactin
2. Festphasensynthese

III. Zielsetzung

IV. Retrosynthese

V. Ergebnisse und Diskussion
1. Synthese des Cyclotetradepsipeptids 17
2. Synthese des Heptapeptids 18
3. Synthese des Arginin-Derivats 10

VI. Zusammenfassung und Ausblick

VII. Experimenteller Teil

VIII. Literaturverzeichnis

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. Jürgen Scherkenbeck für die interessante Themenstellung und die Aufnahme in die Arbeitsgruppe. Sowie Herrn Dr. Markus Roggel, der sich schnell bereiterklärte, als Zweitprüfer für diese Arbeit zu fungieren.

Ich bedanke mich bei meinen Laborkollegen: J. Müller, G. Kotipali, A. Lehnard, M. Kibungu und M. Lübke für die angenehme Aufnahme in die Arbeitsgruppe und für die vielen anregenden Gespräche, sowie die damit verbundenen Hilfestellungen. Besonders danke ich J. und G., die meine Arbeit betreut und sich immer Zeit für meine Fragen genommen haben. Desweiteren danke ich F. Körber für die Milch.

Für die Aufnahme der Spektren und die Durchführung der Analysen danke ich zudem Herrn A. Siebert, Frau I. Polanz und Frau S. Bettinger, die sich immer bemüht haben zu helfen und die ein oder andere Ausnahme gemacht haben.

Ich danke meiner Familie und meinen Freunden, die immer für mich da waren, besonders Regina, die mich auf jede denkbare Weise unterstützt hat.

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

I. Einleitung

1. Antibiotika

Als Antibiotikum werden allgemein Stoffe bezeichnet, die in der Lage sind, bereits in geringen Konzentrationen Bakterien und andere Mikroorganismen abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen^[1].

Als erstes Antibiotikum der Geschichte gilt das 1910 von Paul Ehrlich entdeckte Arsphenamin 1, das erstmalig eine medikamentöse Behandlung der Syphilis ermöglichte, wenn auch mit starken Nebenwirkungen^[2]. Innerhalb der folgenden Jahre bis ca. 1950 wurden diverse weitere Antibiotika wie z.B. Penicillin 2, Streptomycin 3 und Tetracyclin 4 entdeckt, die teilweise noch bis heute eingesetzt werden^[3]. Besonders die Entdeckung des Penicillins stellt eine der größten Errungenschaften des 20. Jahrhunderts dar, da es als einfach zu verabreichendes Breitbandantibiotikum die Medizin seiner Zeit revolutionierte^[4].

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Abbildung 1: 1 Arsphenamin, 2 Penicillin, 3 Streptomycin, 4 Tetracyclin

Durch die Entdeckung dieser Stoffe wurden bakterielle Infektionskrankheiten effektiv behandelbar, was sich sehr positiv auf die durchschnittliche Lebenserwartung der Menschen und die Kindersterblichkeitsraten auswirkte. So ist die durchschnittliche Lebenserwartung in Deutschland von 40 Jahren im Jahr 1900, auf 80 Jahre im Jahr 2014gestiegen^[5]. Dies ist vor allem dem Einsatz von Antibiotika sowie einer Erhöhung der hygienischen Sorgfalt und des Lebensstandards zuzurechnen. Die größte Steigung hat die in Abb. 2 dargestellte Kurve zwischen 1900 und 1930. Zur selben Zeit wurden die ersten Antibiotika entdeckt und etabliert.

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Abbildung 2: Lebenserwartung in Deutschland nach Geburtsjahr^[5]

Spätere Generationen von Antibiotika leiten sich weitestgehend von Naturstoffen ab, die als Leitstrukturen für ihre Entwicklung dienten^[6]. Derivate der Leitstrukturen können halbsynthetisch aus den Naturstoffen oder vollsynthetisch gewonnen werden. Seit den 70er Jahren wurden jedoch kaum neue Leitstrukturen entdeckt, während Infektionen durch antibiotikaresistente Bakterien, wie z.B. MRSA, zu einem zunehmenden Problem der modernen Medizin werden^[7]. Die Abkürzung MRSA steht für Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus, wird aber auch für multiresistente Stämme verwendet. Eine Infektion mit S. aureus führt üblicherweise nicht direkt zu Symptomen, erst wenn das Immunsystem des Wirts geschwächt ist, kommt es zu Entzündungen im ganzen Körper. Vorwiegend werden Haut und Muskeln angegriffen. ^[8]

Bakterien werden als resistent gegen ein spezifisches Antibiotikum bezeichnet, wenn das Antibiotikum die Fähigkeit, diese Bakterien abzutöten oder deren Wachstum zu hemmen, verloren hat^[9]. Problematisch daran ist, dass es bis auf Antibiotika kaum Behandlungsmöglichkeiten für bakterielle Infektionen gibt. Somit können selbst gewöhnliche Infektionen wie Lungenentzündungen mitunter tödlich verlaufen.

Infektionen durch antibiotikaresistente Keime sind besonders in Krankenhäusern ein häufiges Problem. Die Zahl der Infektionen durch antibiotikaresistente Erreger in Deutschland im Jahr 2013 wird auf ca. 29.000 geschätzt, was ca. 6 % aller nosokomialen Infektionen entspricht. Nosokomial bedeutet, dass die Infektion in zeitlicher Nähe zu einem Krankenhausaufenthalt steht. Diese 6% sind allerdings für 2/3 der ca. 37.000 jährlichen Todesfälle in Europa, die durch nosokomiale Infektionen verursacht werden, verantwortlich. Der Anteil der Patienten, die sich während eines Krankenhausaufenthaltes mit einer Infektion anstecken, ist mit ca. 3.5 % innerhalb der letzten Jahrzehnte unverändert geblieben. Der Anteil der Infektionen, die durch antibiotikaresistente Erreger verursacht werden und somit die Zahl der Todesfälle, ist jedoch drastisch gestiegen.^[10]

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Abbildung 3: Anteil multiresistenter Stämme an untersuchten Kulturen von S. aureus ^[11]

Infektionen durch multiresistente Erreger sind besonders schwer zu behandeln, da viele Patienten schneller sterben, als ein noch wirksames Antibiotikum gefunden werden kann.

Antibiotika-Resistenzen entwickeln sich in Bakterien deutlich schneller, als neue Antibiotika entdeckt und zur Marktreife weiterentwickelt werden können. Deswegen ist das internationale wissenschaftliche Interesse an antibiotischen Leitstrukturen mit neuen Wirkungsmechanismen sehr groß.

2. Teixobactin

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Abbildung 4: Teixobactin 5

Das Antibiotikum Teixobactin wurde 2015 von Ling et al. entdeckt, es weist eine starke antibiotische Wirkung gegen grampositive Bakterien auf^[12].

Im Gegensatz zu grampositiven Bakterien verfügen gramnegative Bakterien über eine zusätzliche äußere Zellmembran, die verhindert, dass Teixobactin seinen Wirkungsort erreicht. Somit ist die Wirkung von Teixobactin auf grampositive Bakterien beschränkt.

Teixobactin wurde aus dem bodenlebenden Proteobakterium Eleftheria terrae isoliert, das nur mithilfe der neu entwickelten iChip-Technologie kultiviert werden konnte^[12]. Mit dem, von NovoBiotic Pharmaceuticals entwickelten, iChip-Verfahren können ungefähr 50 % aller wildlebenden Bakterien kultiviert werden. Da bisher nur ca. 1 % aller Bakterien unter Laborbedingungen gezüchtet werden konnten, stellt dies eine Revolution der Mikrobiologie dar. Das Verfahren basiert darauf, ein Agar basiertes Nährmedium über eine semipermeable Kunststoffmembran mit dem natürlichen Lebensraum der Bakterien in Kontakt zu bringen, um eine vollständige Versorgung mit benötigten Nährstoffen zu gewährleisten^[12].

Als Peptidantibiotikum besteht Teixobactin aus vier D-Aminosäuren und sieben L-Aminosäuren, einschließlich der unnatürlichen Aminosäure Enduracididin. Es handelt sich außerdem um ein Depsipeptid, da es außer Peptidbindungen auch eine Esterbindung enthält. Verwandte Antibiotika sind z.B. Mannopeptimycin 6 und Lysobactin 7 mit denen es sich seine macrozyklische Struktur und die Guanidino-Gruppe teilt^[13]. Im Mannopeptimycin kommt ein Derivat des Enduracididin, das -hydroxy-Enduracididin, sogar zweimal vor. Lysobactin ist ebenfalls ein Depsipeptid.

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Abbildung 5: Mannopeptimycin 6 und Lysobactin 7

Wie bei Mannopeptimycin wird vermutet, dass Teixobactin in die Zellwand-Synthese grampositiver Bakterien eingreift, indem es Lipid II hemmt. Dieses wird zur Bildung von Peptidoglycan benötigt. Peptidoglycan fungiert als Gerüst für die Zellwand-Biosynthese. Wird seine Produktion gehemmt, kommt es zu Löchern in der Zellwand des Bakteriums. Durch diese kann ungehindert Wasser einströmen, bis die Zelle durch ihren hohen osmotischen Druck platzt. Zudem inhibiert Teixobactin Lipid III, das heißt, dass es an mehreren Stellen in die Zellwand-Biosynthese eingreift. Dies erschwert die Resistenzbildung, da ein Stamm mehrere Mutationen aufweisen und dennoch lebensfähig sein muss, um eine Resistenz zu entwickeln.

Ling et al. testeten diese Vermutung, indem sie Kulturen von S. aureus 27 Tage lang mit geringen Dosen von Teixobactin behandelten, jedoch konnten keine Anzeichen einer Resistenzbildung beobachtet werden^[12].

Getestet wurde außerdem die biologische Aktivität von Teixobactin gegen mehrere Stämme von Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis und weitere grampositive, sowie gramnegative Bakterien. Bei grampositiven Bakterien zeigte Teixobactin vergleichbare MHK-Werte wie Daptomycin und schien nicht von Resistenzen gegen bekannte Antibiotika beeinflusst zu werden^[12]. Damit stellt Teixobactin eines der wenigen, neu entdeckten Antibiotika mit multiresistenzbrechenden Eigenschaften dar. MHK steht für minimale Hemm-Konzentration und gibt die geringste Konzentration eines Antibiotikums an, bei dem das Wachstum von Bakterien noch messbar gehemmt wird.

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Abbildung 6: Lipid II 8 und Lipid III 9 ^[14]

II. Allgemeiner Teil

1. Arg-Teixobactin

Bis auf L- allo -Enduracididin sind alle Aminosäuren, aus denen Teixobactin aufgebaut ist, kommerziell erhältlich. Da Enduracididin nicht gekauft werden kann, muss es selbst hergestellt werden, wie z.B. nach Peoples et al.^[15], über eine 5-stufige Synthese mit 34 % Ausbeute. Demnach ist Enduracididin der zeit- und kostspieligste Baustein in der Synthese von Teixobactin.

Aus oben genannten Gründen ist das Interesse an L- allo -Enduracididin-freien Derivaten, die ihre biologische Aktivität behalten, groß. Die strukturell ähnlichste Aminosäure, durch die Enduracididin ersetzt werden kann, ist L-Arginin.

Anfang 2016 wurden mehrere Synthesen von Teixobactin, sowie seines Arginin-Derivates veröffentlicht. Erwähnenswert sind unter anderem die Synthesen von Jad et al.^[16] und Parmar et al.^[17]. Darauf aufbauend wurden weitere Derivate von Yang et al.^[18] synthetisiert und auf ihre biologische Aktivität untersucht.

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Abbildung 7: Synthese des Arginin-Derivats 10 nach Jad et al.^[16] (6 % Ausbeute)

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Abbildung 8: Synthese des Arginin-Derivats 10 nach Parmar et al.^[17] (22 % Ausbeute)

Die Syntheserouten unterscheiden sich nur durch die Reihenfolge in der die Aminosäuren gekuppelt werden, sowie ihre Schutzgruppenstrategien. Beide Arbeitsgruppen bauten zuerst das lineare Undecapeptid mit seiner Depsipeptid-Verzweigung auf einem Chlorotritylchlorid-Harz auf, gefolgt von einer Macrolactamisierung zwischen Alanin und Arginin in flüssiger Phase.

Im Hinblick auf eine analoge Synthese von Teixobactin sind die Routen allerdings nicht sehr effizient. Enduracididin würde in beiden Synthesen sehr früh über eine Festphasensynthese in das Molekül eingeführt. Dies führt zum einen zu einem erhöhten Verbrauch an Enduracididin, durch Einsatz von Überschüssen und zum anderen zu den typischen Ausbeuteverlusten einer mehrstufigen, linearen Synthese. Da Enduracididin nicht kommerziell erhältlich ist und über eine mehrstufige Synthese hergestellt werden muss, sollte der Verbrauch dieser Aminosäure weitestgehend minimiert werden.

In der Arbeitsgruppe von Prof. Scherkenbeck wurde deswegen eine Synthese des Arginin-Derivates 10 entwickelt, die bei Austausch des Arginin durch Enduracididin auch zur effizienten Synthese von Teixobactin genutzt werden kann. Der Schlüsselschritt der konvergenten, in der Arbeitsgruppe entwickelten Synthese ist die Verknüpfung der Heptapeptid-Seitenkette 11 und des Cyclotetradepsipeptids 12 in flüssiger Phase. Arginin wird dabei als letzte Aminosäure in das Tetradepsipeptid eingefügt, gefolgt von einer Macrolactamisierung zwischen Alanin und Arginin.

2. Festphasensynthese

Die Festphasensynthese, auch Merrifield-Synthese genannt, wurde 1963 vom amerikanischen Chemiker Robert Bruce Merrifield entwickelt^[19]. Für seine Arbeiten wurde ihm 1984 der Nobelpreis für Chemie verliehen.

Ziel einer Festphasensynthese ist der stufenweise Aufbau eines Peptids, also einer Kette von Aminosäuren. Dazu wird eine Aminosäure auf einer Trägerphase, einem polymeren Harz, kovalent verankert und nacheinander mit den gewünschten Aminosäuren gekuppelt, wodurch die Kette Glied für Glied wächst.

Die meisten Harze bestehen aus Polystyrol und 1-2% Divinylbenzol und werden nach der Polymerisation mit sogenannten Linkern versehen. Der Linker ist das Bindeglied zwischen dem Polymer und der ersten Aminosäure. Der Aufbau des Linkers bestimmt auch die Bedingungen unter denen das Peptid vom Harz abgespalten werden kann. Polystyrol kann, wie z.B. beim Merrifield-Harz, durch eine Blanc-Reaktion funktionalisiert werden, die Chlormethylgruppe erlaubt das Anbringen von Aminosäuren.

[...]

^[1] Gesundheitsberichterstattung des Bundes, 2016 www.gbe-bund.de/gbe10/abrechnung.prc_abr_test_logon?p_uid=gast&p_aid=0&p_knoten=FID &p_sprache=D&p_suchstring=8598 (15.10.2016)

^[2] Steven J, Projan, Sanchez, Sergio, Demain, Arnold L; Antibiotics Conference 2015, General Review, 109-112

^[3] BTK, Bundestierärztekammer, Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln, Auflage 2015

^[4] Fleming, A., Br. J. Exp. Pathol. 1921, 10, 226-236.

^[5] DESTATIS, Statistisches Bundesamt Deutschland, 2016 www.destatis.de/DE/ZahlenFakten/GesellschaftStaat/Bevoelkerung/Sterbefaelle/Sterbefaelle.html (23.09.2016)

^[6] von Nussbaum, F.; Brands, M.; Hinzen, B.; Weigand, S.; Häbich, D.; Angew. Chem. 2006, 118, 31, 5194-5254

^[7] Kurosu, M.; Siricilla, S.; Mitachi, K.; Expert Opin. Drug Discov. 2013, 8, 9, 1095-1116

^[8] MRSA-net, Informationsportal zu MRSA, 2016 www.mrsa-net.nl/de/oeffentlichkeit/mrsa-allgemein (15.10.2016)

^[9] BMG, Bundesministerium für Gesundheit, 2016 www.bmg.bund.de/themen/praevention/krankenhausinfektionen/die-wichtigsten-begriffe.html (15.10.2016)

^[10] Robert Koch Institut, 2016 www.rki.de/DE/Content/Infekt/Antibiotikaresistenz/Antibiotikaresistenz_node.html (15.10.2016)

^[11] Paul-Ehrlich-Institut via Statista, 2016 https://de.statista.com/statistik/daten/studie/241361/umfrage/praevalenz-von-mrsa/ (15.10.2016)

^[12] Ling, L. L.; Schneider, T.; Peoples, A. J.; Spoering, A. L.; Engels, I.; Conlon, B. P.; Mueller, A.; Schaberle, T. F.; Hughes, D. E.; Epstein, S.; Jones, M.; Lazarides, L.; Steadman, V. A.; Cohen, D. R.; Felix, C. R.; Fetterman, K. A.; Millett, W. P.; Nitti, A. G.; Zullo, A. M.; Chen, C.; Lewis, K.; Nature 2015, 517, 455−459.

^[13] Wang, Bo; Liu, Yunpeng; Jiao, Rui; Feng, Yiqing; Li, Qiong; Chen, Chen; Liu, Long; He, Gang; Chen, Gong; J. Am. Chem. Soc 2016, 138, 11, 3926-3932

^[14] von Nussbaum, F.; Süssmuth R. D.; Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 6684-6686.

^[15] Peoples, A. J.; Hughes, D.; L. L. Ling, W. Millett, A. Nitti, A. Spoering, V. A. Steadman, J.-Y. C. Chiva, L. Lazarides, M. K. Jones, K. G. Poullence, K. Lewis; 2014 NovoBiotic Pharmaceuticals, LLC, USA, Patent WO 2014089053, US 20140194345,

^[16] Jad, Y. E., Acosta, G. A., Naicker, T., Ramtahal, M., El-Faham, A., Govender, T., Kruger, H. G., de la Torre, B. G., and Albericio, F.; Org. Lett. 2015, 17, 6182−6185.

^[17] Parmar, A., Iyer, A., Vincent, C. S., Van Lysebetten, D., Prior, S. H., Madder, A., Taylor, E. J.; Singh, I.; Chem. Commun. 2016, 52, 6060−6063

^[18] Yang, Hyunjun; Chen, Kevin H.; Nowick, James S; ACS Chem. Biol.; 2016, 11, 7, 1823-1826

^[19] R. B. Merrifield; J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 14, 2149–2154