Der Effekt unterschiedlicher Taurinkonzentrationen auf aktivierte B-Zellen

Taurin – physiologische Eigenschaften

Taurin spielt eine wichtige Rolle als inhibitorischer Neurotransmitter. Es erhöht in Nervenzellen die Permeabilität für Chloridionen und führt dadurch zu einer Hyperpolarisierung der Synapsenmembran. Damit hemmt es die Ausbildung eines Aktionspotenzials und somit die Reizweiterleitung im zentralen Nervensystem. Studien haben allerdings auch die Möglichkeit aufgezeigt, dass Taurin das Serotonin-System aktiviert.¹

Serotonin (5-Hydroxytryptamin) ist ein Gewebshormon aus der Gruppe der biogenen Amine, das als Neurotransmitter im peripheren und Zentralnervensystem vorkommt. Die Wirkung ist vielfältig. Im Allgemeinen erfolgt eine Verengung der Blutgefäße und bei höherer Dosierung eine Erhöhung des Bludrucks. Im Zentralnervensystem besitzt Serotonin eine Neurotransmitterfunktion, die jedoch auf wenige Neurone beschränkt ist, deren Zellkörper im Mittelhirn lokalisiert sind. Diese sind an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus und der Steuerung einer normalen Stimmungslage beteiligt. Zudem zählt Serotonin zu einer Reihe körpereigener Stoffe, die Schmerz erzeugen.²

Für weitere Untersuchungen zur Wirkung von Taurin kann daher ein Serotonin Antagonist zugegeben werden. Ein derartiger Antagonist ist Methylsergidmaleat ([8β(S)]-9,10-Didehydro- N -[1-(hydroxymethyl)propyl]-1,6-dimethylergoline-8-carboxamide maleate) (MMS), das am Sympathicus angreift und ein Mutterkornalkaloid ist. In der Medizin wird es zur Migräneprophylaxe und bei Appetitlosigkeit eingesetzt.³

Die tägliche Aufnahme von Taurin mit der Nahrung liegt Schätzungen zufolge zwischen circa 0 und 400mg.⁴,⁵ Diese starken Schwankungen lassen sich auf die individuellen Ernährungsgewohnheiten der Bevölkerung zurückführen.

Taurin selbst ist ein Abbauprodukt aus den Aminosäuren Cystein und Methionin. Der erwachsene Körper ist in der Lage Taurin selbst herzustellen, so dass er etwa die Menge von 70g bei 70kg Körpergewicht erreicht. Die Serumkonzentration eines gesunden Erwachsenen beträgt dabei ca. 50,78μmol/l (+/- 5,25).⁶ Das entspricht einer Menge von 0,00635mg/ml. In Organen ist der Tauringehalt jedoch erheblich höher und liegt bei 190 bis 1324mg/kg. Die Resorption von Taurin findet über den Dünndarm statt, von dort wird es über das Blutgefäßssystem zu den Organen transportiert. Dort gelangt es wahrscheinlich über ein zelluläres Transportsystem in die Zelle.⁷ Um dem erhöhten Tauringehalt nach dem Genuss von Energy-Drinks im Organsystem gerecht zu werden, werden B-Zellen unterschiedlichen Taurin-Konzentrationen ausgesetzt: 0,004, 0,04, 0,4, 1,5, 4 und 40mg/ml.

B-Lymphocyten und Antikörper

Im Laufe der Evolution haben sich fünf verschiedene Klassen von Antikörpern entwickelt, die sich vor allem durch die konstante Region des Moleküls unterscheiden. Die einzelnen Antikörperklassen sind für die Einleitung unterschiedlicher Abwehrprozesse spezialisiert, wobei dafür noch weitere Subklassen existieren.

Häufigste Antikörperklasse im Blut ist IgG, die als Monomere vorliegen. IgD und IgE liegen ebenfalls als Monomere vor, IgA als Monomer, Dimer oder noch höhere Aggregatszustände und IgM als Pentamer.

Die variablen Abschnitte der Antikörper sind so gestaltet, dass Abschnitte dieser Moleküle zur Oberflächenstruktur der Antigene passen. Diese Molekülbereiche werden als Antigen- Determinanten oder Epitope bezeichnet. Der Antikörper hindert damit den Erreger daran, sich an die Rezeptoren der Wirtszelle zu heften und dieser wird damit für die Phagocytose vorbereitet.⁸

Um thymusabhängige Antikörperreaktionen auslösen zu können, müssen B-Zellen durch T-Helferzellen aktiviert werden. Erkennt eine B-Zelle ein Epitop auf der Virushülle, kann sie das vollständige Viruspartikel aufnehmen, das schließlich abgebaut wird. Wurden T-Helferzellen bei einer Infektion durch Makrophagen durch die gleichen Peptide geprägt, können sie B-Zellen dazu anregen spezifische Antikörper gegen das Hüllprotein zu bilden. Dies erfolgt durch sogenannte bewaffnete T-Effektorzellen, die durch eine spezielle Aktivierung schnell auf spezifische Antigene reagieren können. Diese T-Zellen, die dazu in der Lage sind B-Zellen zu aktivieren werden T-Helferzellen genannt. Bewaffnete T-Helferzellen aktivieren B-Zellen, wenn sie auf deren Oberfläche ein entsprechendes Peptid erkennen (MHC-Klasse-II-Komplex). Diese sorgen wiederum dafür, dass bewaffnete T-Helferzellen Effektormoleküle synthetisieren, die dafür sorgen, dass ruhende B-Zellen in den Zellzyklus eintreten. Ein derartiges Molekül ist der CD40-Ligand, für das die B-Zelle einen entsprechenden Rezeptor trägt. Darüber hinaus ist das Interleukin-4 (IL-4), das als Peptidhormon zu den Botenstoffen des Immunsystems zählt, beteiligt. Es stimuliert aktivierte B-Lymphpcyten und bewirkt zudem einen Immunglobulin-Klassenwechsel. Die Bindung an CD40 führt zusammen mit IL-4 zum Wachstum und Vermehrung der B-Zellen. Daher werden bei der experimentellen Inkubation von B-Zellen diese beiden Faktoren zugegeben.⁸

Eingesetzte Materialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Grundprinzip der magnetischen Zellseparation

Das Verfahren, das in dieser Arbeit zur Anwendung kommt, wurde von der Firma Miltenyi Biotec entwickelt. Dabei werden zwei Reagenzien verwendet. Im ersten Schritt wird die vorliegende Zellsuspension mit sogenannten „MACS MicroBeads“ inkubiert. Dabei handelt es sich um 50nm kleine magnetische Partikel, die an spezifische Antikörper gekoppelt sind. Diese Antikörper wirken gegen Oberflächenstrukturen der zu selektierenden Zellen. Diese Partikel sind so klein, dass sie andere Zellstrukturen nicht beeinflussen.

Im nächsten Schritt kommt eine Trennsäule zum Einsatz, auf die ein starkes Magnetfeld wirkt. Durch dieses Magnetfeld werden die mit den MicroBeads gelabelten Zellen zurückgehalten. Durch den Aufbau der Säule ist sichergestellt, dass alle übrigen Zellen durchfließen können. Wird mit diesen übrigen Zellen weitergearbeitet wird das Verfahren als Negativselektion bezeichnet. Bei einer Positivselektion werden die gelabelten Zellen in der Säule weiterverwendet. Dazu wird die Säule mit einem Lösungsmittel ohne die Verwendung des Magnetfeldes gespült, so dass man diese Zellen erhält.⁹

Die Gewinnung von B-Zellen aus Mäusen

Zum Einsatz kommen B-Zellen von männlichen Mäusen. Alle verwendeten Versuchstiere wurden in der Tierversuchshaltung der Medizinischen Fakultät Regensburg gehalten. Sie besitzen keine genetischen Besonderheiten. Sie werden 9-12 Wochen unter keimfreien Bedingungen aufgezogen.

Die Tötung der Mäuse erfolgt einzeln durch Zugabe von Kohlenstoffdioxid-Gas. CO2 ist ein Gas, das schwerer als Luft ist und sich nach dem Einströmen am Boden des Behälters sammelt. Dazu vergewissert man sich vorher, ob der Behälter zunächst noch frei von CO2 ist und gibt etwas Einstreu dazu. Anschließend setzt man das Tier in diesen Behälter und lässt das Gas einströmen.¹⁰ Nachdem der Raum vollständig mit CO2 gesättigt ist, wartet man etwa eine Zeit von 5 Minuten ab und entnimmt der Maus anschließend die Milz.

Die Milz liegt unterhalb des Zwerchfells im linken Oberbauch. Man legt dazu die Maus auf die rechte Körperseite und schneidet ein Fenster durch das Fell und Haut. Nun ist die Milz (Länge ca. 8mm) als rotbraunes Organ zu sehen. Die Milz wird entnommen, von anhaftendem Gewebe befreit und in 1x PBS-Puffer aufbewahrt.

Die Milz wird durch ein 70μm-Zellsieb durchpassiert und die Zellen in PBS-Puffer suspendiert. Ab diesem Zeitpunkt sollte auf eine sterile Umgebung geachtet werden. Man spült mit PBS-Puffer nach, so dass ein Gesamtvolumen von 40ml erreicht wird.

Diese Suspension wird 10 Minuten bei 4°C und 1600rpm zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und das Pellet in 5ml Erylyse-Puffer aufgenommen. In diesem Zustand wird die Zellsuspension 7 bis 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Erylyse durch Zugabe von 35ml PBS-Puffer gestoppt. Im Anschluss folgt eine weitere Zentrifugation bei 1600rpm, 4°C und 10 Minuten Dauer. Der Überstand wird abgegossen und das Pellet in 10ml „MACS-Puffer“ aufgenommen. Um Zellaggregationen, die sich nicht resuspendieren lassen, abzutrennen wird nochmals ein 70μm-Zellsieb verwendet. Von diesem Filtrat werden 10μl zur Bestimmung der Gesamtzellzahl verwendet. Im vorliegenden Fall erfolgte das durch ein Anfärben der Zellen mit Trypanblau und Bestimmung durch eine Neubauer-Zählkammer.

Die gewonnene Zellzahl hängt vom Alter und Zustand der Mäuse ab und liegt bei ca. 108 Zellen.

Es folgt ein weiteres Zentrifugieren bei 1600rpm.

Man führt die magnetische Zellseperation nach dem Prinzip der Negativselektion durch. Alle Zellen, außer den B-Zellen werden magnetisch gelabelt. Dafür wird ein Cocktail aus biotingebundenen Antikörpern gegen CD43 und CD4 verwendet.

Dann wird das Pellet mit 40μl MACS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert. Anschließend wird die gleiche Menge des Biotin-Antibody-Cocktails zu den Zellen gegeben. Es wird sorgfältig durchmischt und 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Danach werden jeweils 30μl Macs-Puffer und schließlich 20μl der Anti-Biotin-MicroBeads pro 107 Zellen zugegeben, sorgfältig durchmischt und nochmals 15 Minuten bei 4°C inkubiert.

Nach diesem Schritt wird das Gefäß mit 5ml MACS-Puffer versetzt und wieder 10 Minuten bei 1600rpm zentrifugiert. Inzwischen bereitet man die Trennsäule vor, indem der Magnet befestigt wird und die Säule mit 500μl MACS-Puffer benetzt wird. Das Pellet aus dem Zentrifugationsschritt wird in 500μl MACS-Puffer resuspendiert und auf die Säule gegeben. Die Säule wird im Anschluss mit weiteren 500μl MACS-Puffer gewaschen. Die Flüssigkeit und alle Zellen, die die Säule verlassen, werden aufgefangen und können weiterverarbeitet werden. Dazu wird abermals bei 1600rpm zentrifugiert und das Pellet in 5ml „Mausmedium“ resuspendiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt nochmals mit der Neubauer-Zählkammer und sollte etwa 15·106 Zellen ergeben.¹¹,¹²

Vorbereitung der Proben

Die gewonnen Zellen (ca, 15·106) werden bis 8ml mit Mausmedium aufgefüllt. Da bei einem Versuchsansatz jeweils 300μl verwendet werden, liegen damit je Probe ca. 5,6·105 Zellen vor.

Grundsätzlich wird ein Well in einer Mikrotiterplatte folgendermaßen vorbereitet, indem man folgende Lösungen pipettiert:

1. 1000μl der Koffein-/Taurinlösung, damit sich bei einem Gesamtvolumen von 1500μl die gewünschte Gesamtkonzentration ergibt.
2. 300μl der gewonnen B-Zellsuspension.
3. Je nach Versuchansatz 100μl CV-, CGS-, bzw. MMS-Lösung, so dass sich eine Gesamtkonzentration von etwa 10-6mol/l ergibt.
4. 100μl einer CD-40/IL-4-Lösung, so dass die Massenkonzentration der Lösung von CD-40 2,5ng/ml und von IL-4 1ng/ml beträgt.
5. Diese Ansätze werden zuächst 16h bei 37°C inkubiert und anschließend vorsichtig 1300μl des Überstandes abgehoben, damit die Zellen zurückbleiben.
6. Dieser Überstand wird durch die entsprechende Koffein-/Taurinkonzentration, bzw. CV-,CGS oder MMS-Lösung ersetzt und weiter bis zu einer Zeit von 96h inkubiert.
7. Anschließend wird nochmals 1300μl Überstand abgehoben. Die so gewonnen Überstände werden für den ELISA verwendet.

[...]

¹ Bulley S, Liu Y, Ripps H, Shen W: Taurine activates delayed rectifier Kv channels via a metabotropic pathway in retinal neurons; J Physiol. 2013 Jan 1;591(Pt 1):123-32. doi: 10.1113/jphysiol.2012.243147. Epub 2012 Oct 8

² Hariprasath kothandam, Priyadarsini Biradugadda, Brahmini Maganti, Tanikonda Keerthi, Babitha Vegunta, VidyaSagar Kopparapu, Venkatesh Palaniyapan: Taurine, “A Key Amino Acid in the Drug Discovery” - A Review. Asian journal of biomedical and pharmaceutical sciences 2012. Sir C. R. Reddy Colllege of Pharmaceutical Sciences, Eluru-534007, W.G. Dist, A.P.

³ Masalov IS, Tsvetkov EA, Lokshina EI, Veselkin NP: Effect of antagonists of 5-HT receptors on modulation with serotonin of synaptical activity of projectional neurons of dorsolateral nucleus of rat amygdala. Zh Evol Biokhim Fiziol. 2012 Sep-Oct;48(5):455-60

⁴ Pogan, K.: Gewebespezifische Verwertung von Taurinkonjugaten, Köster, Berlin, 1998

⁵ Huxtable, R.: Taurine 2: basic and clinical aspects; Advances in Experimental Medicine and Biology 403; Plenum Press; New York, 1996

⁶ Ibraheem M. A. EL Agouza and Dalia E. EL Nashar: Serum Taurine as a Marker of Endometrial Cancer; The Open Women’s Health Journal, 2011, 5, 1-6

⁷ Jacobsen, J.; Smith, L.; Biochemistry and Physiology of Taurine and Taurine Derviatives; Phys. Rev. 48; 1968

⁸ Charles A. Janeway, Paul Travers, Mark Walport, Mark Shlomchik: Immunbiologie, Spektrum Akademischer Verlag, 5. Auflage, 2002

⁹ M. Zborowski, J.J. Chalmers: Magnetic cell seperation, Elsevier B.V. 2008

¹⁰ Empfehlungen zum Töten von Kleinsäugern zu Futterzwecken: Tierärztliche Vereinigung für Tierschutz e.V. Arbeitskreis 8 (Zoofachhandel und Heimtierhaltung)

¹¹ Herstellerangaben: B Cell Isolation Kit, Order no. 130-090-862, Miltenyi Biotec Inc.

¹² Gerhard Gstraunthaler, Toni Lindl: Zell- und Gewebekultur: Allgemeine Grundlagen und spezielle Anwendungen; Springer Pektrum Verlag 7., überarb. u. erg. Aufl. 2013, XIII