Zusammenfassung von O'Leary und Igdouras “The therapeutic potential of pharmacological chaperones and proteosomal inhibitors, Celastrol and MG132 in the treatment of sialidosis”

Inhalt

1. Einleitung

2. Materialien und Methoden
Zelllinien
Chemikalien und Antikörper
Adenovirus Infektion
Immunlokalisationsstudien
Gangliosid Katabolismus Studien
Proteinanalysen nach Western
Quantifizierung der Western Blot-Analyse

3. Ergebnisse
Auswirkungen der MG132 und/oder Celastrol auf Sialidase-Aktivität in menschlichen Fibroblasten Sialidose
Co-Lokalisation von endogener Sialidase mit LampII nach der Behandlung mit Medikamenten
Wirkung der Behandlung mit MG132 und/oder Celastrol auf Gangliosidebene in geladenen Sialidosis Fibroblasten
Auswirkung der MG132 und Celastrol Behandlungen auf die Sialidase Aktivität
Auswirkung der Behandlung auf die Co-Lokalisation von Sialidase mit Lamp II
Wirkung der Celastrol und MG132 Behandlung auf die Expression mutierter Sialidase

4. Diskussion:

5. Schlussfolgerungen

Literaturliste:

1. Einleitung

Sialidose zählt zu den lysosomalen Speichererkrankungen, die auf einer Fehlfunktion der lysosomalen Sialidase, welche zur Klasse der Hydrolasen zählt, beruht. Jenes Enzym wird durch das NEU1 Gen kodiert und die Krankheit wird autosomal rezessiv vererbt. Die Mutationen im NEU1 Gen führen zu einem Defekt des Enzyms, welches normalerweise Sialinsäure von Oligosaccariden, Glycolipiden und Glycosphingolipiden spaltet.

Sialidose kann in zwei unterschiedliche Klassen von Phänotypen gegliedert werden: Sialidose Typ I und Typ II. Ersterer entspricht einer late oneset Erkrankung, welche im Alter von 8 bis 10 Jahren auftritt und durch einen kirschroten Fleck in der Makula gekennzeichnet ist und von einer Abnahme der Sehschärfe und Höhrverlust begleitet wird. Patienten mit Sialidose Typ I versterben meist im Alter von 20 Jahren und können durch den Anstieg der Sialiloligosaccaridwerte sowie Vakuolen im Blutausstrich diagnostiziert werden. Typ II wird in eine kindliche und eine jugendliche Untergruppe unterteilt. Obwohl Typ II typischerweise einen schwereren Krankheitsverlauf mit sich bringt, gibt es ein großes Variationsspektrum bezüglich des Schweregrads innerhalb der Untergruppen.

Infantile Sialidose ist bereits sehr früh, wenn nicht bereits in der Gebärmutter erkennbar.

Patienten dieser Gruppe versterben üblicherweise bereits vor ihrem fünften Lebensjahr.

Juvenile Sialidose ist durch einen späteren Ausbruch der Krankheit gekennzeichnet. Die Lebenserwartung der Patienten ist länger und die Schwere ihrer Symptome geringer als bei der infantilen Form. Patienten, welche an Typ II Sialidose erkranken weisen üblicherweise folgende klinische Merkmale auf: Hurloid facies (Wasserspeigesicht), Ataxie, Hepatomegalie, Splenomegalie und Myoklonus. Je nach Schweregrad der Krankheit werden jene Symptome von geistiger Retadierung begleitet. Die verheerendste Form der Sialidose entspricht der neonatalen und endet meist mit einem Hydrops fetalis.

Die Diagnose wird anhand des kirschroten Makulaflecks und einen hohen Gehalt an alpha2-6 verknüpften Sialyloligosaccariden im Urin gestellt.

Es existieren vier verschiedene Klassen von Sialidasen: die lysosomale (Neu1), die cytosolische (Neu2), die membrangebundene Gangliosid spezifische (NEU3) und die mitochondriale (NEU4). Jede Sialidase zeichnet sich durch ihre spezifischen Substrate und ihre subzelluläre Lokalisation aus. Die lysosomale Sialidase kann auch zur Plasmamembran ausgerichtet sein und bedingt durch ihre Position an der Zell-Zell Erkennung, Signalweiterleitung oder an Immunreaktionen beteiligt sein. Die funktionelle Vielseitigkeit dieses Enzyms erklärt unter anderem die phänotypische Vielschichtigkeit der Sialidose.

Sialidase ist Teil eines Multienzymkomplexes bestehend aus dem protektiven Protein Cathpepsin A und Beta-Galactosidase. Dieser wird im ER und Golgi gebildet und ist für die Funktionalität der Sialidase erforderlich.

Da die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt sind, besteht ein großes Interesse an der Identifizierung neuer Mechanismen, welche die Enzymaktivität verbessern und dadurch die Anhäufung von Substraten vermindern soll. Chemische Chaperone kommen zum Einsatz, um der Missfaltung von Sialidase Enzymen entgegenzuwirken.

MG132 ist ein reversibler, hochspezifischer, proteosomaler Inhibitor welcher die Chemotrypsin-ähnliche Aktivität des 26S Proteasoms arretiert. Dadurch kann mithilfe von MG132 ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt des Proteinabbaus blockiert werden. Mg132 wird derzeit hinsichtlich seiner potentiellen Behandlung bei Krebspatienten untersucht. Durch Reduzierung der proteosomalen Aktivität können Proteine, auch missgefaltete die normalerweise abgebaut werden würden, im ER verarbeitet und zum Golgi-Apparat und den Lysosomen transportiert werden.

Celastrol wird als entzündungshemmendes Mittel bei rheumatischer Arthritis und Asthma angewandt. Es zählt zu einer Untergruppe der Terpinoide, welche derzeit bezüglich ihrer Wirkung auf das Immunsystem betreffende Signalwege, Angiogenese und Zelltod bei Krebs untersucht werden. Als Chinin Methid Triterpenoid sorgt Celastrol sowohl für eine Zunahme der Chaperone als auch der Maschinerie, welche mit ERAD (ER-assoziierte Proteindegradation) und UPR (Unfolded Protein Response) in Verbindung steht. Dies geht mit einer Abnahme der Aktivität der cytoplasmatische Hit Shock Proteins(Chaperone), unter anderem HSP 70 und HSP 90 einher.

In der nun folgenden Studie wird sowohl die postive Wirkung von Celastrol und MG132 auf mutierte Sialidase Enzyme beschrieben, als auch die beträchtliche Kombinationswirkung beider auf die Enzymaktivität, lysosomales Targeting und die Akkumulation von Substraten in Zellen. Diese Studie deckt das Potential einer neuen therapeutischen Strategie zur Behandlung von Sialidose auf.

2. Materialien und Methoden

Zelllinien

Für die Studie wurden Allel spezifische Mutationen des Enzyms Sialidase an menschlichen Sialidase-Null-Fibroblasten untersucht. Die Sialidase Aktivität der mutierten Fibroblasten der Sialidose Patienten wurde mit jener von gesunden Fibroblasten verglichen.

Chemikalien und Antikörper

MG132 und Celastrol wurden in Ethanol gelöst und bei -20 Celsius gelagert. DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium) wurde als Kultumedium für alle Zellpopulationen benützt und wurde mit 10% FBS, 1% PenStrep und 0,1% Fungizone ergänzt. Die Zellen wurden unter der Verwendung von PBS (Phosphat Buffered Saline) und 0,25% Trypsin-EDTA weitertransportiert. Für die Gangliosid Beladung der Fibroblasten reiften die Zellen in OptiMEM, welches mit Antibiotika und Fungizone ergänzt wurde. Verschiedenste Antikörper, unter anderem monoklonale Maus Antikörper und polyklonale Hasen anti-Human Antikörper wurden für die verschiedenen Untersuchungen, wie beispielsweise der Western Blot Analyse verwendet. Die spezifische Aktivität der Sialidase wurde unter Verwendung des künstlichen Substrats (4-Methylumbelliferyl)-alpha-D-N-Acetylneuraminsäure (MuNANA) und 2- Amino-2-Methyl-1-Propanol (MAP) bestimmt. Zur Charakterisierung des Gangliosid Katabolismus (endogene und allelspezifische Sialidase) wurden Fibroblasten mit einer Rinderhirn Gangliosidmischung inkubiert und bei einer Stammkonzentration aus Ethanol suspendiert.

Adenovirus Infektion

Zur Untersuchung der Sialidase cDNA Expression von spezifischen missense Mutationen wurde eine Adenovirus vermittelte Expression verwendet. Die Zellen wurden mit einem Virus infiziert, welcher die R341G mutierte, die R225P mutierte, oder die Wildtyp Sialidase exprimierte.

Immunlokalisationsstudien

Um die intrazelluläre Lokalisation der Sialidase nach der Behandlung mit MG132, Celastrol oder einer Kombination beider Mittel bestimmen zu können wurden die Zellen auf Rundglasplättchen in einer Platte mi 24 Vertiefungen gezüchtet. Für die Untersuchung von allelspezifischen Mutantenanalysen wurden die Zellen nach 24 Stunden Inkubation mutierten Varianten und der Wildtyp Sialidase behandelt. MG132 und Celastrol wurden sowohl unabhängig als auch miteinander substituiert. Die Zellen wurden aufbereitet und mit fluoreszierenden Antikörpern versehen, um die Position der Sialidase bestimmen zu können.

Für die Immunlokalisationsstudien wurden die Objektträger mithilfe eines LeicaTCS SP5 invertierten konfokalen Mikroskop analysiert. Jedes Feld wurde mit einem Laser aufgenommen. Laser-Intensität und Wellenlänge wurden auf experimenteller Basis geprüft und farbige Überlagerungen generiert.

Gangliosid Katabolismus Studien

Um den Gangliosidabbau in vitro zu charakterisieren wurden die Fibroblasten mit und ohne Gangliosiden eines Rinderhirns inkubiert. Der Behandlung mit Celastrol, beziehungsweise MG132, oder einer Kombination beider folgte die Gangliosid Belastung. Die Zellen wurden mit Lysaten behandelt, mit Puls bestrahlt und in einem Röhrchen mit Chloroform, Methanol und Wasser substituiert. Später durchliefen die Proben eine Reihe von weiteren Behandlungen: Sie wurden öfter zentrifugiert, wobei der Überstand zur weiteren Zentrifugation verwendet wurde bis die Proben fertig aufbereitet und gereinigt waren. Die fertige gereinigte Probe wurde mit Chloroform resubstituiert und in einer Ampulle bei 20 Grad Celsius verschlossen. Die Proben wurden auf eine Siliciagel-Dünnschichtchromatographie- Platte aufgetragen und die Glycoconjugate wurden aufgrund von Ladung und Molekulargewicht getrennt, unter der Verwendung von Aceton gefolgt von einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Kalziumchlorid als mobile Phasen Puffer. Nachdem die Platte getrocknet war wurde eine Mischung aus H2SO4 und Resorcinol benützt um die aufgelösten Ganglioside zu färben. Die gefärbte Platte wurde abgedeckt und erhitzt. Die Bilder wurden mittels UV- Exposition und hellem Licht eingefangen. Die Proben wurden mit dem Proteinspiegel des ursprünglichen Lysats verglichen.

Proteinanalysen nach Western

Zur Bestätigung der Sialidase Proteinstabilität wurden Fibroblasten gezüchtet, welche mit MG132 und Celastrol behandelt wurden. Um die allelspezifischen Proteinlevel untersuchen zu können wurden die Proben vor der Behandlung mit den mutierten Varianten und normaler Sialidase infiziert. Nach der Arzneimittelbehandlung wurden die Zellen in einen Lysepuffer, der einen Protease Inhibitor enthielt, beschallt. Nach weiteren Behandlungen wurden die Proben auf ein Polacrylamid Agarosegel aufgetragen und auf eine Nitrocellulose Membran übertragen. Vor der Zugabe der Antikörper wurden die Proben mit Milch und TBST behandelt. Nach dem erneuten Waschen mit TBST wurden die Membranen in Milch mit sekundären IgG-HRP konjugierten Antikörpern geblotted und später erneut mit TBST gewaschen. Die geblotteten Membranen wurden mit ECL-Chemilumineszenzreagentien inkubiert und mithilfe eines Rodac Röntgenfilms betrachtet. Die rekombinante Sialidase wurde mit einem anti-Polyhistidin-Antikörper und einem Ziege-anti-Maus-IgG-HRP dedektiert. Sialidase wurde unter Verwendung des monoklonalen menschlichen Sialidase –Antikörpers, gefolgt von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP sondiert. Grp78 Antikörper gefolgt von Ziege-Anti-Maus –IgG-HRP wurden gebraucht um Grp78 zu blotten. Die Ladung wurde unter Verwendung von Beta Aktin neutralisiert. Gefolgt von Ziegen-anti-Maus IgG-HRP. Die Proteinspiegel wurden unter Verwendung des Lowry-Assays analysiert. Die Membranen wurden später erneut sondiert.

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