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Quantitative Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays für die hämatopathologische Diagnostik

Bachelorarbeit 2014 57 Seiten

Medizin - Pathologie

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Anwendungen von Sequenzanalysen in der Onkologie
1.2 Pyrosequenzierung als etablierte Methode in der Sequenzanalyse
1.3 Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte genetische Marker
1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit

2 Material
2.1 Verbrauchsmaterialien
2.2 Zelllinien
2.3 Patientenproben
2.4 Primer
2.5 Kitsysteme
2.6 Reagenzien und Lösungen
2.7 Geräte, Software und Datenbanken

3 Methoden
3.1 DNA-Isolierung aus FFPE-Gewebe
3.2 DNA-Konzentrationsbestimmung
3.2.1 NanoDrop 2000 Spectrophotometer
3.2.2 Qubit® 2.0 Fluorimeter
3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.4 Quantitative real-timePCR(qPCR)
3.5 Klonierung mittels TOPO®TA Cloning® - Technologie
3.6 Plasmidisolierung
3.7 Pyrosequenzierung
3.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

4 Ergebnisse
4.1 Verdünnungsanalysen des Gens U2AF1
4.2 Verdünnungsanalysen des Gens MYD88
4.3 Verdünnungsanalysen des Gens Jak2

5 Diskussion
5.1 U2AF1: Analytische Sensitivität von Codon S34 im Vergleich zu Codon Q157
5.2 MYD88: Sensitivität niedriger als bei Codon S34 trotz Auftreten zusätzlicher Peaks
5.3 Jak2: Anwendung einer Zelllinien-Mischungsstudie zur Evaluierung der Sensitivität des Assays
5.4 Ausblick

Danksagung

Literaturverzeichnis

Zusammenfassung

Sequenzanalysen mittels Pyrosequenzierung werden in der molekularen Diagnostikhäufig zur Absicherung von Diagnosestellungen eingesetzt. Auch über den Verlauf einer Erkrankung oder das potentielle Ansprechen einer Therapie kann durch das Vorhandensein einer spezifischen Mutation in vielen Fällen eine Aussage getroffen werden. Daher ist eine angemessene Validierung eines Pyrosequenzierungs-Assays, bei der die Sensitivität und die Spezifität evaluiert werden, in der Routinediagnostik von grundlegender Bedeutung. Zielsetzung dieser Arbeit ist, eine Anleitung zu etablieren, mit der mit wenig Aufwand schnell einsetzbare Positivkontrollen für jeden beliebigen Sequenzbereich erstellt werden können. Diesbezüglich werden sowohl Mischungsstudien mit Zelllinien-DNA durchgeführt als auch – für den Fall, dass keine entsprechende Zelllinie mit der zu analysierenden Mutation verfügbar ist – gut amplifizierbarePlasmide eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Verdünnungsanalysen mit Plasmiden, die ein Fragment des Gens U2AF1 (Codon S34 und Codon Q157) oder des Gens MYD88 (Codon L265) enthalten, durchgeführt, wobei analytische Sensitivitäten von 1,58 % bis 11,2 % erhalten wurden. Des Weiteren wurde eine Zelllinien-Mischungsstudie angewendet, um die Sensitivität des Jak2-V617F-Assays zu evaluieren. Nachdem zunächst die Jak2-Genkopienzahl in der die V617F-Mutation tragenden Zelllinie HEL mittels quantitativer real-time PCR bestimmt wurde, wurde eine Verdünnungsserie mit der Jak2-Wildtyp-Zelllinie HL-60 mittels Pyrosequenzierung analysiert, aus welcher eine Sensitivität von 6,25 % resultierte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Zuge dieser Arbeit eine funktionierende Methode zur Herstellung von Positivkontrollen für Pyrosequenzierungs-Assays für beliebige genetische Marker etabliert wurde.

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Anwendungen von Sequenzanalysen in der Onkologie

Molekularbiologische Techniken, wie die Mutationsanalyse, haben in der Onkologie in den letzten Jahren immer mehran Bedeutung gewonnen. Beispielsweise lassen sich anhand des Vorhandenseins einer charakteristischen Mutation morphologische Diagnosestellungen absichern. So kann die mit den MyeloproliferativenNeoplasien (MPN) assoziierte Jak2-V617F-Mutation in 97 % aller Fälle von Polycythaemia Vera (PV) und in 50 – 60 % von Essentieller Thrombozythämie (ET) und Primärer Myelofibrose (PMF) gefunden werden(Baxter et al. 2005; Milosevic & Kralovics 2013).Des Weiteren können bestimmte Sequenzvariationen als prognostische Marker eingesetzt werden und somit eine Aussage über den vermutlichen Verlauf einer Erkrankung getroffen werden. Ein Beispiel hierfür sind Mutationen in demSplicefaktor-Gen SRSF2, deren Auftreten mit einem kürzeren Überleben von Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS)assoziiert ist(Makishima et al. 2012; Patnaik et al. 2013). Ebenso bedeutend sind Sequenzanalysen für die Behandlung von Krebserkrankungen, da das Vorhandensein bestimmter Mutationen den Therapieerfolg eines Medikamentes beeinflussen kann. So sprechen Patienten mit Lungenkarzinom (NSCLC) mit bestimmtensogenannten aktivierenden EGFR-Mutationen(Exon 18G719X oder Exon 21 L858R)auf eine Therapie mit EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren an(Yun et al. 2007), während hingegen Patienten mit anderen EGFR-Mutationen (z.B. Exon 20 T790M) resistent gegen diese Therapie sind (Yun et al. 2008).Ebenso sprechenan einemKolorektalem Karzinom Erkrankte mitKRAS-Mutation (beispielsweise Codon 12 oder 13) oder BRAF-Mutation (V600E) nicht auf eine Therapie mit monoklonalen EGFR-Antikörpernan (Shaib et al. 2013).

1.2 Pyrosequenzierung als etablierte Methode in der Sequenzanalyse

Das 1996 entwickelte Verfahren der Pyrosequenzierung ist eine „sequence-by-synthesis“-Technik, bei der die DNA-Synthese in Echtzeit detektiert wird(Harrington et al. 2013). Durch den häufigen Einsatz dieser Methode in der klinischen Diagnostik hat die Pyrosequenzierung im letzten Jahrzehnt stetig steigende Bedeutung erlangt. Im Vergleich zur konventionell genutzten Sanger-Sequenzierung, bei der ca. 20 % mutierte Allele als untere Nachweisgrenze gilt, hat die Pyrosequenzierung ein verbessertes limitofdetection(LOD) von ca. 5 % (Tsiatis et al. 2010). Des Weiteren können die Sequenzanalysen durch die Pyrosequenzierung zusätzlich quantifiziert werden, da die Peakhöhe im Pyrogram proportional zur Menge des eingebauten Nukleotidsist. Ein weiterer Vorteil gegenüber der eher komplexeren Sanger-Sequenzierung ist, dass die Pyrosequenzierung schneller durchzuführen ist, da die generierte Biolumineszenz in einem einzigen Schritt in Echtzeit gemessen werden kann, wohingegen die Detektion bei der Sanger-Sequenzierung in einem separaten Schritt erfolgt. Außerdem liegt die Stärke der Pyrosequenzierung in der Analysekürzerer Fragmente von weniger als 100Bp(Harrington et al. 2013), während hingegen mit der Sanger-Methode, bei der auch De-novo-Sequenzierungen möglich sind,Fragmentlängen von 800 Bp sequenziert werden können(Warren et al. 2007).

In der onkologischen Sequenzanalyse stellt Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe (FFPE-Gewebe) ein wichtiges Ausgangsmaterial für die DNA-Isolation dar(Lehmann & Kreipe 2001). Problematisch hierbei ist jedoch, dass während des Fixierungsprozesses die DNA in kürzere, nur einige hundert Basenpaar lange Fragmente degradiert wird und auch Sequenzveränderungen auftreten können(Dietrich et al. 2013). Da jedoch die primäre Anwendung der Pyrosequenzierung die Sequenzierung kurzer DNA-Fragmente ist, kann somit FFPE-Gewebe problemlos als Ausgangsmaterial eingesetzt werden.Außerdem werden in der Sequenzanalyse in der Onkologie meist sogenannte Mutations-Hotspots untersucht, die nur wenige Basenpaare umfassen(Spittle et al. 2007).

Eine große Herausforderung in der klinischen Diagnostik ist die Definition eines angemessenen Grenzwertes für einen Pyrosequenzierungs-Assay, ab dem ein Signal sich hinreichend vom Hintergrundrauschen abhebt und somit als „mutiert“ interpretiert werden kann. Charakteristisch für einen Assay sind dessen Sensitivität, nämlich der Anteil richtig als mutiert deklarierter Fälle, und die Spezifität, nämlich der Anteil richtig als wildtyp deklarierter Fälle(Pewsner et al. 2004). Unter Sensitivität kann in einem anderen Kontext auch die technische Sensitivität oder auch daslimitofdetection(LOD) eines Assays verstanden werden. Das LOD ist der kleinstmögliche Anteil an mutierten Allelen, der noch mit einer gewissen Sicherheit detektiert werden kann(Armbruster et al. 1994). Ein in der Literatur allgemein anerkanntes LOD für die Pyrosequenzierung ist 5 %. Andere Studien ergaben LODs von 3 bzw. 7 % (Packham et al. 2009; Cushman-Vokoun et al. 2013), 5 % (Tsiatis et al. 2010), 6 %(Ibrahem et al. 2010; Jiang et al. 2012), 5 – 10 %(Jelinek et al. 2005; Steensma 2006; Arita et al. 2014) und 15 – 20 % (Spittle et al. 2007). Da in einer Gewebeprobe der Anteil an bösartigen Tumorzellen oftmals gering ist, muss ein Pyrosequenzierungs-Assay ausreichend sensitiv sein und angemessen validiert werden. Wie wichtig die Qualitätskontrolle in der onkologischen Sequenzanalyse ist, haben Dijstraet al.in einer Multicenter-Studie gezeigt, da in dieser Studie sehr viele Sequenzierungs-Assays bei abnehmendem Anteil an mutierten Allelen stark voneinander abweichende Ergebnisse erzielt haben. Eine gute Validierung beinhaltet Positivkontrollen mit bekanntem Anteil an mutierten Allelen, sodass die Reproduzierbarkeit und das LOD eines Pyrosequenzierungs-Assays beurteilt werden können.

1.3 Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte genetische Marker

U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 1 (U2AF1)

U2AF1ist die kleinere Untereinheit des heterodimeren U2 Small Nuclear RNA AuxiliaryFactors, ein Protein, das eine wichtige Rolle beim Aufbau des Spliceosoms spielt. Die Funktion von U2AF1 (35 kDa) ist die Erkennung des AG-Dinukleotids der 3‘-Splicestelle der prä-mRNA und die anschließende Bildung des initialenSplicing-Komplexes (Damm et al. 2012). Somatische Mutationendes Gens für U2AF1 betreffen vorrangig zwei hoch konservierte Aminosäuren, nämlich S34 und Q157, welcheinnerhalb der beiden Zinkfinger-Domänen des Proteins lokalisiert sind. In Codon 34 kann beispielsweise eine Substitution von Serin durch Phenylalanin (S34F) stattfinden und in Codon 157 kann das Glutamin unter anderem zu einem Prolin (Q157P) verändert werden(Yoshida et al. 2011). Der genaue Pathomechanismus dieser Missense-Mutationen ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wird jedoch vermutet, dass Mutationen in den Splicefaktor-Genen zu abnormalem Splicing oder verändertem alternativen Splicingvon Genen führen könnten, die an funktionell wichtigen Stoffwechselwegen beteiligt sind. So werden beispielsweise Gene aus Stoffwechselwegen, wie dem Zellzyklus oder der RNA-Prozessierung, abnormal gesplict, was dann die Leukämogenese fördern kann(Przychodzen et al. 2013). U2AF1-Mutationen findet man häufig bei Patienten mit den Erkrankungen Myelodysplastisches Syndrom (MDS) und sekundäreAkute Myeloische Leukämie (sAML) (Qian et al. 2012).

Januskinase 2 (Jak2)

Die Januskinase 2 ist eine cytoplasmatischeTyrosinkinase und besteht aus vier funktionalen Domänen, zu denen u. a. die JH1- und die JH2-Domäne gehören.Die JH1-Domäne stellt die katalytisch aktive Tyrosinkinase-Domäne dar, wohingegen die JH2-Domäne eine katalytisch inaktive Pseudokinase-Domäne mit negativer Regulatorfunktion der Kinasefunktion ist (Saharinen& Silvennoinen 2002). Jak-Proteine spielen eine wichtige Rolle in Zytokinrezeptor-vermittelten Signalwegen. Beispiele hierfür sind der Erythropoetin-oder auch der Thrombopoetin-Rezeptor, die beide selbst keine direkteKinaseaktivität besitzen, sondern das extrazelluläre Signal intrazellulär über Januskinasen weiterleiten und so z. B. die Zellproliferation anregen (Baker et al. 2007). Die am häufigsten auftretende Mutation im Jak2-Gen ist die Jak2-V617F-Mutation, welche die JH2-Domäne betrifft.Diese sog. gain-of-functionMutation hat eine konstitutive Aktivierung der Kinase und somit unkontrollierte Proliferation zur Folge. Bei Patienten mit MyeloproliferativerNeoplasie (MPN)ist diese Mutation die bedeutendste genetische Anomalie. Unter den BCR-ABL1-negativen MPNs wurde die Jak2-V617F-Mutation in 97 % aller Fälle von Polycythaemia Vera (PV) und in 50 – 60 % von Essentieller Thrombozythämie (ET) und Primärer Myelofibrose (PMF) identifiziert (Baxter et al. 2005; Milosevic & Kralovics 2013).

Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88 (MYD88)

MYD88 ist ein Adaptermolekül sowohl im Toll-like-Rezeptor- als auch im Interleukin-1-Rezeptor-Signalweg.Die Stimulation dieser Signalwegehat eine Aktivierung des NF-κB-Signalwegs zur Folge,wodurch das Überleben der betroffenen Zelle gefördert wird, indem proliferationsfördernde Gene, die z.B. für Apoptoseinhibitoren kodieren, exprimiert werden(Watters et al. 2007). Die häufigste Mutation im Gen MYD88 ist eine Punktmutation der Aminosäure 265 in bösartigen B-Zellen, bei der ein Leucin durch ein Prolin substituiert wird. MYD88 L265P hat ein konstitutiv aktives Protein zur Folge, dessen Überexpression der betroffenen B-Zelle einen selektiven Überlebensvorteil gewährt und somit einen pro-survival-Effekt auf diese Zelle hat (Ngo et al. 2011). Die MYD88-L265P-Mutation tritt am häufigsten in Non-Hodgkin-Lymphomen auf, zu welchen u. a. das seltene Lymphoplasmozytische Lymphom, WaldenströmsMakroglobulinämie (WM), gehört. In einer Studie von Ansellet al. wurde die MYD88-L265P-Mutation in 97 % aller WM-Patienten identifiziert (Ansell et al. 2013).

1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, Pyrosequenzierungs-Assays quantitativ zu validieren, indem Positivkontrollen angefertigt und anschließend mittels Pyrosequenzierung analysiert werden. Diese Qualitätskontrolle beinhaltet Verdünnungsserien mit unterschiedlichen Anteilen an mutierten Allelen, die von mehreren verschiedenen Mutations-Hotspots in den Genen U2AF1, Jak2 und MYD88erstellt werden, sodass schließlich eine Aussage zum spezifischen LOD des jeweiligen Assays getroffen werden kann. Hierbei werden sowohl durch Klonierung erhaltene Plasmide als auch aus FFPE-Gewebe isolierte DNA sowie Zelllinien-DNA verwendet. Außerdem wird angestrebt, Bedingungen zu simulieren, die mit einer realen Patientenprobe vergleichbar sind, sodass die erzielten Ergebnisse auch im Hinblick auf die Routinediagnostik aussagekräftig sind.

2 Material

2.1 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 1: Verwendete Materialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Zelllinien

Tabelle 2: Verwendete Zelllinien (Quelle: American Type Culture Collection (ATCC))

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3 Patientenproben

Die für den FFPE-DNA-Hintergrund verwendete DNA stammt von einer Lymphknotengewebeprobe der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH).

Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte MYD88-Fragment wurde durch Amplifikation der DNA eines Patienten mit MYD88-L265P-Mutation, der an einem Non-Hodgkin-Lymphom der B-Zell-Reihe (speziell ein Immunozytom) erkrankt ist, erhalten.

Die verwendete S34F-mutierte FFPE-DNA stammt von einem Patienten mit Primärer Myelofibrose (PMF), wohingegen die Q157P-mutierte FFPE-DNA einem Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS)entstammt.

Alle Patientenproben sind anonymisiert und stammen retrospektiv aus dem Archiv.

[...]

Details

Seiten
57
Jahr
2014
ISBN (eBook)
9783656963974
ISBN (Buch)
9783656963981
Dateigröße
3.3 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v299936
Institution / Hochschule
Medizinische Hochschule Hannover – Zentrum Pathologie, Forensik und Genetik
Note
1,3
Schlagworte
Pyrosequenzierung Jak2 U2AF1 MyD88 Hämatologie Krebs Genetische Marker Diagnostik Myelom Leukämie

Autor

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Titel: Quantitative Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays für die hämatopathologische Diagnostik