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Evaluación de la resistencia y susceptibilidad de accesiones élite de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana L.) al hongo "Fusarium oxysporum" Schltdl.

Tesis 2010 173 Páginas

Agronomía

Extracto

CONTENIDO

INTRODUCCION

1. PROBLEMA DE INVESTIGACION
1.1 Descripcion del problema
1.2 Planteamiento del problema
1.3 Pregunta de investigacion
1.4 Hipotesis

2. JUSTIFICACION

3. OBJETIVOS
3.1 General
3.2 Especificos

4. MARCO TEORICO
4.1 EL HOSPEDERO: LA UCHUVA (Physalis peruviana L).
4.1.1 Familia Solanaceae Juss (Linnaeus, c., 1753).
4.1.2 Genero Physalis
4.1.2.1 Relacion del genero Physalis con otros generos
4.1.3 Physalis peruviana L.
4.1.3.1 Taxonomia
4.1.3.2 Nombres
4.1.3.3 Descripcion botanica
4.1.3.4 Origen
4.1.3.5 Distribution y ecologia
4.1.3.6 Requerimientos Ecofisiologicos De La Planta
4.1.3.6.1 Altitud
4.1.3.6.2 Temperatura
4.1.3.6.3 Agua y humedad
4.1.3.6.4 Luz
4.1.3.6.5 Viento
4.1.3.7 Generalidades del cultivo
4.1.3.8 Importancia economica
4.1.3.8.1 Exportaciones
4.1.3.8.2 Centros de produccion
4.1.3.8.2.1 Productores
4.1.3.8.2.2 Area sembrada
4.1.3.8.2.3 Produccion
4.1.3.8.2.4 Rendimiento
4.1.3.8.3 Destino de la fruta
4.1.3.8.4 Consumo interno
4.1.3.8.5 Precios
4.1.3.9 Normatividad
4.1.3.10 Usos
4.1.4 Taxas relacionados con la uchuva usados en este estudio
4.1.4.1 Physalis philadelphica L.
4.1.4.2 Physalis floridana Rydb
4.1.4.3 Physalis pubescens L.
4.1.4.4 Physalis viscosa L.
4.1.4.5 Physalis pruinosa L.
4.1.4.6 Physalis angulata L.
4.1.4.7 Genero Nicandra Adans
4.1.4.7.1 Nicandra physalodes (L.) Gaertner
4.1.4.8 Genero Solanum
4.1.4.8.1 Solanum auriculatum
4.2 EL PATOGENO: Fusarium oxysporum Schltdl
4.2.1 Taxonomia
4.2.2 Caracteristicas morfologicas claves en medio PDA.
4.2.3 Caracteristicas de Fusarium oxysporum en medio CLA
4.2.4 Formas especiales y razas
4.2.5 Distribution
4.2.6 Sintomas de la enfermedad
4.2.6.1 Externos
4.2.6.2 Internos
4.3 PATOSISTEMA Fusarium-UCHUVA
4.4 MEDICION DE LA ENFERMEDAD: USO DE UNA ESCALA DE SEVERIDAD.
4.4.1 Principio de estimation de los danos
4.4.2 Diagramas de escalas de severidad
4.4.3 Uso de escala de severidad

5. METODOLOGlA
5.1 Lugar de ejecucion
5.2 Materiales
5.2.1 Uchuva
5.2.2 Fusarium oxysporum
5.3 Metodos
5.3.1 ESCALA DE SEVERIDAD
5.3.2 CALIBRACION DEL INOCULO
5.3.3 CEPA MAS PATOGENICA de F. oxysporum
5.3.4 EVALUCION DE LAS ACCESIONES
5.3.4.1 Esterilizacion de las entradas
5.3.4.2 Germinacion
5.3.4.3 Trasplante
5.3.4.4 Inoculacion
5.3.4.4.1 Production de inoculo
5.3.4.4.2 Inoculation de plantas de uchuva
5.3.4.5 Evaluacion
5.3.4.5.1 Analisis estadistico

6. RESULTADOS
6.1 ESCALA DE SEVERIDAD
6.2 CALIBRACION DEL INOCULO
6.2.1 Analisis grafico
6.2.2 Analisis de regresion logistica
6.2.3 Comprobacion de los postulado de Koch
6.3 EVALUACION DE LAS ACCESIONES
6.3.1 Analisis de severidad
6.3.2 Analisis de conglomerados
6.3.3 Regresion logistica

7. DISCUSION
7.1 Escala de severidad
7.2 Calibracion del inoculo
7.3 Evaluacion de las accesiones

8. CONCLUSIONES

9. RECOMENDACIONES

10. PERSPECTIVAS

BIBLIOGRAFIA

ANEXOS

LISTA DE TABLAS

Tabla I.Fincas productoras en las cuales se realizo la colecta del patogeno

Tabla 2.Clasificacion jerarquica de la uchuva

Tabla 3.Exportaciones de frutas

Tabla 4.Porcentaje de contribucion de la uchuva en el valor total de las exportaciones de frutas

Tabla 5.Consumo de la uchuva desde 1995 hasta el 2000

Tabla 6.Origen de la coleccion de trabajo. Fuente: Barrero, 2009

Tabla 7.Escala utilizada en el proyecto para determinar el grado de severidad de la enfermedad y de resistencia varietal

Tabla 8.Transformacion a escala binaria de la escala de severidad

Tabla 9.Analisis de medias de los 45 dias de evaluacion de las concentraciones

Tabla 10.Estadisticos del modelo DDO y concentraciones

Tabla 11.Regresion logistica del modelo DDO y concentraciones

Tabla 12.Probabilidades en relation al dia de observation (DDO) y a la concentration de inoculation

Tabla 13.Probabilidad del sintoma en las concentraciones segun

Tabla 14.Resultado de evaluacion de las accesiones utilizadas durante este estudio

Tabla 15.Resumen de la evaluacion de las accesiones

Tabla 16.Individuos sobrevivientes

Tabla 17.Incidencia segun el procedimiento Primcomp de SAS 9.1.3

Tabla 18.Estadisticos de conformation de los clusteres a partir de los datos de incidencia y severidad

Tabla 19.Estimados estadisticos de la regresion logistica de las accesiones

Tabla 20.Grupos de acuerdo a los datos de conformacion y su equivalencia con la escala de severidad

Tabla 21.Comparacion entre los dos analisis: Severidad por promedio y Conglomerados por escala binaria de los caracteres incidencia (%) y severidad (moda)

Tabla 22.Grupos de acuerdo a los datos de conformacion y su equivalencia con la escala de severidad con la introduction del termino tolerante

Tabla 23.Comparacion de los resultados de las metodologias empleadas para evaluar la resistencia/susceptibilidad de las accesiones elite de germoplasma de uchuva

Tabla 24.Materiales para la preparation del inoculo en laboratorio

Tabla 25.Materiales para la inoculation en invernadero

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.Habito herbaceo de la uchuva y su crecimiento rustico

Figura 2.Raiz de uchuva

Figura 3.Tallo de uchuva

Figura 4.Hojas acorazonadas de uchuva

Figura 5.Flores de uchuva

Figura 6.Caliz gamosepalo de uchuva

Figura 7.Fruto de uchuva

Figura 8.Volumen exportado (Toneladas) de Uchuvas

Figura 9.Principales empresas exportadoras de Uchuvas

Figura 10.Area de Uchuva por departamentos de 2000-2005

Figura 11.Produccion (toneladas) promedio en algunos municipios de Cundinamarca y Boyaca

Figura 12.Tendencia de exportaciones al mundo de la Uchuva en los ultimos 10 anos

Figura 13.Pa^ses importadores de Uchuvas colombianas (Toneladas) en el 2008

Figura 14.. Flores de P. Philadelphia

Figura 15.Flores y fruto de P. floridana=P. pubescens

Figura 16.Physalis angulata

Figura 17.Nicandra physalodes

Figura 18.Solanum mauritianum

Figura 19.Microconidias de F. oxysporum e hifas del micelio del hongo en medio CPD

Figura 20.Macroconidias creciendo en medio CLA

Figura 21.Clamidosporas de F. oxysporum em CPD

Figura 22.Smtomas de la marchitez vascular en uchuva causada por F. oxysporum en invernadero

Figura 23.Smtomas de la marchitez vascular en uchuva causada por F. oxysporum en campo

Figura 24.Dos cepas de Fusarium oxysporum caracterizadas en el proyecto y utilizadas para calibracion del inoculo

Figura 25.Esquematizacion del proceso metodologico

Figura 26.Genotipo susceptible de uchuva usado en la calibracion del inoculo

Figura 27.Medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (CPD)

Figura 28.Diagrama de flujo en el proceso de esterilizacion de semillas

Figura 29.Germinacion de las semillas

Figura 30.. Estado ideal para trasplante

Figura 31.Comparacion de los pasos basicos de las dos metodologias ensayadas para, inicialmente, definir la forma de obtener el inoculo en masa

Figura 32.Proceso de inoculacion

Figura 33.Plantulas con el sistema radicular sumergido en el inoculo

Figura 34.Distribucion en hileras de las accesiones

Figura 35.Plantula en el estado ideal para su evaluacion

Figura 36.Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva resistente

Figura 37.Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva poco susceptible

Figura 38.Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva moderadamente susceptible

Figura 39.Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva susceptible

Figura 40.Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva altamente susceptible

Figura 41.Escala diagramatica en hojas de las plantulas de uchuva

Figura 42.Plantula en grado 8

Figura 43.Escala diagramatica de las plantulas de uchuva: 0 a 3

Figura 44.Escala diagramatica de las plantulas de uchuva: 4 a 7

Figura 45.Escala diagramatica de las plantulas de uchuva: 8 y 9

Figura 46.Aparente plantula muerta que retono al cabo de una semana y media

Figura 47.Plantula que retono al cabo de una semana de haber sido dada por muerta

Figura 48.Plantula de 3 meses de edad con el tallo necrosado en la parte central

Figura 49.Planta sobreviviente en la que se encontro la raiz principal obstruida y obliterada

Figura 50.Planta sobreviviente en la que se encontro una aguda disminucion de las raices laterales

Figura 51.Planta sobreviviente en la que se observo fuertes raices secundarias a cambio de la inexistente raiz pivotante

Figura 52.Grafico de cajas (boxplot) de las concentraciones

Figura 53.Graficos de severidad de 1.000 ufc/mL

Figura 54.Graficos de severidad de 10.000 ufc/mL

Figura 55.Graficos de severidad de 100.000 ufc/mL

Figura 56.Comparacion grafica de las concentraciones con base en la severidad

Figura 57.Comparacion grafica de las concentraciones con base en la incidencia

Figura 58.Incidencia de la enfermedad en 1.000 ufc/mL

Figura 59.Incidencia de la enfermedad en 10.000 ufc/mL

Figura 60.Incidencia de la enfermedad en 100.000 ufc/mL

Figura 61.Ejemplo de re aislamiento del patogeno

Figura 62.Accesion 09u047

Figura 63.Accesiones resistentes al cabo de mas de 45 dias de evaluacion

Figura 64.Ejemplo de algunas accesiones susceptibles

Figura 65.Plantas sobrevivientes y resistentes en bolsas de 5 kg de capacidad

Figura 66.Ejemplo de plantas resistentes y sobrevivientes

Figura 67.Esquejes de individuos sobrevivientes y resistentes

Figura 68.Dendograma de las accesiones

Figura 69. Identification de los clusteres dentro del Dendograma

Figura 70.Contraste entre la etiologia reportada por Jones (1997) y la encontrada en el estudio

Figura 71.Sintomas de estres hidrico

Figura 72.Planta sobreviviente luego de ser extraidos los esquejes

Figura 73.Algunas plantas de la accesion 09u279

Figura 74.09u047-2 y 09u047-12, ejemplo del estado general de la

accesion 09u047

Figura 75.Divergencia entre resistentes y susceptibles

Figura 76.Dendograma donde los clusteres son identificados de acuerdo a la escala de severidad con la adicion del termino tolerancia

LISTA DE ANEXOS

Anexo I.Coleccion base de uchuva y taxas relacionados

Anexo 2.Preparation de los medios de cultivo Agar papa Dextrosa (PDA) y Agar Hoja de Clavel (CLA)

Anexo 3.Protocolo para obtener un cultivo Monosporico

Anexo 4.Protocolo para la preparation del inoculo en el laboratorio

Anexo 5.Datos de calibration del inoculo

Anexo 6.Protocolo para la inoculation en invernadero

Anexo 7.Datos de las accesiones

Dedicatoria:

Dedico esta como muchas otras obras a mis padres, no por el hecho de la concepcion de mi ser, sino por su denodado esfuerzo en pro de mi bienestar, unico acicate de su accionar. Por ello ofrendo el ferreo esfuerzo que en esta obra tuve lugar de dar, en nombre del amor de mi madre y de la preocupacion de mi padre.

A ustedes una vez mas...

A ml, por no desfallecer ante adversas circunstancias y comentarios, por eludir la vida acomodaticia y el peligro de la sobrestimacion, por recordar el fin de todo, enunciado por

Aristoteles hace mas de 2310 anos : la felicidad.

Y a todos aquellos que con su oprobiosa incredulidad alientan mi arrojo.

AGRADECIMENTOS

£ autw aguadece a:

Dios, por todo cuanto sucede en mivida, por todo cuanto da sucedidoypor todo cuanto sucedera. Seque edcamino esta attanadoy todo serafruto de mis accionesy de tu 6ondad.

La VniversidadPedagogica y decnodopica de Codom6ia, porformarme en edpregrado, pordarme da oportunidadde estudiary de superarme y por ser da u. que mas cree en sus estudiantes.

Corpoica, en nom6re de mi directora Carodina (Jonzadez ddmario, por su orientation cientifica, tecnicay trato personad. Su dignidadcomo cientifica, suformacion como investigadoray su responsa6ididadcomo directora sodo son. superadas porsu donora.6ididadcomo persona.

Jorge drgueddez, porsu ayuda en da o6tencion e interpreta.cion de dos datos estadisticos.

Ldwin (Rodriguez, porsu orienta,ci6n en las tecnicas de cudtivo dedpa-togenoy porsu contribution adcampo de dafitopa.todogia, 6ase de este estudio.

“Fernando (Rodriguez, porserun nuevo arquetipo de estudioy de a.ca.demia..

d mis companeros, a dos otrora conocidosy a.dora 6eddos recuerdos; a dos contemporaneos concodegas universitarios y dos motivantesjovenes de da corpomcion. (Jmciasporsu ejempdo. d mispadres, porsu a-Snega-cwn. Seque nunca dos de defrauda.doy a.dora no sera cuando.

d mi novia, porsu tremendapaciencia en estos cuatro anos de eyistencia comopareja. Se que no soy facidde ddevar.

d Janddi, por su compania y por adegrar mi vida. da todos aqueddos que con. su dedica-cwny ayuda. dicieron posi6de la consecution de este trabajo.

GLOSARIO

Accesion: Agro. Accesion discreta o de frutos. Calidad o derecho por el cual el dueno del suelo pasa a ser dueno de aquello que brota del mismo en forma natural, o como consecuencia del cultivo del mismo.

Acrescente: Bot. Dicese del organo o de cualquier parte del vegetal que continua creciendo despues de formado; por lo tanto, que tiene crecimiento adicional, como los calices de la tomatera y del alquequenje.

Adpreso: Bot. Situado en forma plana o casi plana y paralela a la superficie, pero no unida a ella

Apiculado: Bot. Terminado en una punta corta

Clado: Clad. Grupo emparentado o con sinapomorfias que lo delimitan.

Coleccion: Conjunto ordenado de cosas, por lo comun de una misma clase y reunidas por su especial interes o valor

Constricto: cenido a la margen de un objeto. Estrechado. Que disminuye su ancho o su altura

Craso: Bot. Se aplica a la planta propia de regiones deserticas o tropicales, de hojas carnosas y tallos gruesos que son capaces de almacenar agua para poder sobrevivir largo tiempo sin que llueva, como el aloe y el cactus

Dendograma: representation grafica que mejor ayuda a interpretar el resultado de un analisis cluster.

Entrada: Caudal que entra en una caja o en poder de alguien. En este estudio se usa como sinonimo de accesion.

Epinastia: Bot. Curvatura hacia abajo de las hojas

Epipetalos: Bot. Por encima de la margen de nacimiento de los petalos. En estambres: cuando estan unidos a la corola.

Imbricado: Bot. Termino referido a las hojas o bracteas que se superponen en parte como las tejas de un tejado

Incidencia: Fito. Numero de plantas enfermas sobre el numero total de plantas de un cultivo, por 100.

Infundibuliforme: Bot. En forma de embudo

Inoculo: Fito. Patogeno, o parte de el, que llega al hospedante y es capaz de causar enfermedad.

Plicado: Bot. Doblado

Propagulo: Fito. Unidad del inoculo. Puede ser una espora, una celula bacteriana, un huevo de nematodo, un trozo de micelio, etcetera.

Regresion Logistica: Mat. Modelo de regresion que permite estudiar si una variable binomial depende, o no, de otra u otras variables (no necesariamente binomiales): Si una variable binomial de parametro p es independiente de otra variable X, se cumple p=p|X, por consiguiente, un modelo de regresion es una funcion de p en X que a traves del coeficiente de X permite investigar la relacion anterior. La esencia del modelo de regresion logistica es suponer que la funcion de p(X) es una combinacion lineal de las variables explicativas, las cuales pueden ser cualitativas o cuantitativas, dumys o no, pero siempre dicotomicas. Es ampliamente usado en epidemiologia por su poder de relacionar una causa a una variable dependiente, en una relacion causa efecto de probabilidad acumulada.

Resistencia: Fito. Capacidad de las plantas para impedir, inhibir o soportar patologias.

Severidad: Fito. Area o volumen de tejido enfermo. Se mide en terminos de proportion de tejido enfermo sobre tejido sano

Subulado: Estrechado hacia el apice y acabado en punta fina

Tolerancia: Fito. Capacidad de las plantas para producir una buena cosecha aun cuando sean infectadas por un patogeno.

Truncado: Rematado en un plano transversal

RESUMEN

En el presente trabajo se estudio la resistencia y/o susceptibilidad de 70 accesiones elite de Physalis peruviana y taxas afines (P. philadelphica, P. ixocarpa, P. floridana, P. pubescens, P. angulatas, P. pruinosa, P. viscosa, P. mexicana, Nicandra physalodes y Solanum auriculatum) al hongo Fusarium oxysporum en invernadero, con el objeto de encontrar resistencia varietal al patogeno. Las accesiones fueron tomadas de la coleccion de Corpoica Tibaitata, provenientes de los principales centros productores de Colombia y el mundo; y estando representada por materiales silvestres, por cultivares comerciales de amplia area sembrada, por malezas autoctonas y extranjeras y por los ecotipos comerciales procedentes de los primeros productores: Colombia, Sudafrica, Kenia y Peru, en su orden. La evaluacion se efectuo usando la cepa del patogeno mas agresiva aislada previamente de campos del sector productivo infectados, a la concentration optima hallada en este estudio: 10.000 ufc/mL. Los sintomas fueron monitoreados por medio de una escala diagramatica de severidad de 10 grados y 5 categorias, durante 45 dias. Se evaluo tanto la severidad de la enfermedad como la incidencia. Se hicieron analisis graficos, regresion logistica y conglomerados. Se encontraron 3 accesiones resistentes (09u139: Physalis floridana, 09u178: Solanum auriculatum y 09u279: Physalis peruviana) y 67 susceptibles (6 de ellas poco susceptibles: la 09u047 (Physalis peruviana), 09u173 (Physalis angulata), 09u071 (Physalis philadelphica), 09u063 (Physalis philadelphica), 09u176 (Physalis ixocarpa) y 09u216 (Physalis peruviana, clon Ecotipo Colombia)), asi como 63 individuos sobrevivientes, 40 de ellos resistentes. La accesion 09u047 fue tomada como resistente con base a su gran vigor y muy poca susceptibilidad, aunado al criterio del evaluador. Los individuos y las accesiones resistentes y poco susceptibles encontrados en este estudio son el insumo de programas de mejoramiento genetico vegetal.

Palabras Clave: Uchuva, Fusarium oxysporum, evaluacion, incidencia, severidad, resistencia.

INTRODUCCION

La uchuva (Physalis peruviana L- SOLANACEAE) es actualmente la especie mas prometedora de la flora hortofruticola de los Andes, caracterizandose por un vertiginoso exito alcanzado en muy pocos anos, cuando apenas era conocida por los pobladores locales, ha ser la segunda fruta mas exportada en la decada (tras el banano) en Colombia (Bonilla et al., 2009). La uchuva para el 2009 fue el frutal que mas contribuyo en el total de las exportaciones colombianas de frutas (Bonilla et al., 2009).

Entre los paises andinos Colombia resalta como el de mayor proyeccion en la produccion de la uchuva, ocupando actualmente el primer lugar en la produccion mundial de esta, seguido de paises como Zimbabue, Malasia, China, Kenia y Sudafrica (Bonilla et al., 2009). La baya colombiana es apetecida en el mercado internacional por su calidad, representada en un sabor mas dulce, buena coloracion, mayor contenido de azucares y acido ascorbico (Almanza y Fischer, 1993; Florez, et al., 2000); y por un propicio suministro en los mercados internacionales dimanado de las excelentes condiciones climaticas que ofrece el pais para cultivar a escala la especie. Estas caracteristicas le han otorgado representatividad en los mercados extranjeros, redundando en buenas divisas para el pais.

En el mercado nacional la tendencia del consumo en fresco indica un fortalecimiento de la demanda, todo ello apoyado en programas que incentivan el consumo nacional del producto (Bonilla et al., 2009). Durante el lustro la uchuva ha tenido un crecimiento significativo del area sembrada, como consecuencia del apremio en las exportaciones y el aumento en el consumo interno.

No obstante, y a pesar de su riqueza y gran potencial en el mercado nacional e internacional, la uchuva no ha adquirido el grado de importancia esperado, lo cual puede atribuirse a una falta de sustento tecnologico adecuado aunado con problemas fitosanitarios agudizados por la falta de buenas practicas agricolas y la presencia concomitante de enfermedades de origen biotico, entre las que destacan las fungosas (Tamayo, 2006). Esto trae como consecuencia el incumplimiento de las demandas de los productores y consumidores por productos limpios, inocuos y de buena calidad.

Dentro de estos importantes problemas fitosanitarios por enfermedades fungosas que menoscaban la productividad de la uchuva se destaca como uno de los mas relevantes el marchitamiento causado por el hongo Fusarium oxysporum. Este problema esta afectando seriamente la sostenibilidad economica y ambiental del cultivo, debido a la magnitud de las perdidas que reporta el sector productivo y al abuso de fungicidas de sintesis quimica que se emplean para su control.

Fusarium oxysporum produce marchitamiento vascular con perdidas de hasta el 100% de los cultivos de uchuva, y su presencia se ha constatado en los principales centros productores del pais: Cundinamarca y Boyaca (Rodriguez, 2010), asi como en los centros emergentes de produccion, tales como Antioquia, Huila, Tolima y Narino (Tamayo, 2006; Sandoval, 2010).

Existen dificultades para su control, relacionadas con la resistencia que este hongo ha desarrollado a muchos de los fungicidas comunmente utilizados, su persistencia en los suelos debida a la capacidad de producir estructuras de resistencia (clamidosporas) y su versatilidad fisiologica que lo hacen un microorganismo cosmopolita (Gordon y Martyn, 1997, Beckman, 1987).

Como metodos de control se han utilizado la rotacion de cultivos, la cual no es completamente efectiva porque las clamidosporas sobreviven mucho tiempo en el suelo y en residuos vegetales, pudiendo sobrevivir por un periodo de aproximadamente 20 anos, inhabilitando el terreno para nuevas cosechas (Stakman y Harrar, 1957; Oyervides, 1999; Rodriguez, 2010); la fumigacion del suelo, la cual suministra un buen control inicial, pero la recolonizacion del suelo ocurre muy rapidamente; el uso de compost o compost enriquecido con microorganismos seleccionados, que tambien ha sido utilizado como control, pero infortunadamente en muchos casos sin resultados satisfactorios (Pera y Calvet 1989, Garibaldi 1988, Szczech et al. 1993); y el uso de variedades resistentes, el cual parece ser el metodo mas efectivo y deseable de control de la enfermedad dado su veracidad practica cimentada en experiencias exitosas como las reportadas en tomate y en palmeras (v.g.: Cultivar Walter en tomate (Stall y Walter, 1965)). Al respecto se han demostrado con exito experiencias de resistencia varietal para el control de F. oxysporum en diversas especies incluyendo la lechuga (Garibaldi et al., 2004), el pepino (Huang et al., 2007), y el tomate (Sheu y Wang, 2006) entre otros.

Asi, en la actualidad, el uso de cultivares resistentes representa la unica medida eficaz y economicamente rentable para el control de la fusariosis vascular en el campo (Di Pietro, 2004; Agrios, 2008).

Actualmente en uchuva no se conocen variedades reportadas como resistentes a F. oxysporum; es mas, solamente se conocen "ecotipos". En Colombia se cultivan tres ecotipos originarios del pais, de los cuales dos han sido reintroducidos de Kenia y Sudafrica (Villamizar et al., 1993).

Dada la magnitud del problema y con el animo de controlar la enfermedad este trabajo se propuso evaluar la resistencia, tolerancia y/o susceptibilidad de diferentes accesiones de uchuva a partir de una coleccion de aislamientos de Fusarium oxysporum previamente colectados en campo y caracterizados en laboratorio por metodologias clasicas microbiologicas y taxonomicas (crecimiento y observation de estructuras en medios de cultivo especificos), y por tecnicas moleculares (amplification de regiones intergenicas ribosomales y conservadas del genoma de Fusarium) que permitieron su identification hasta nivel de especie (Rodriguez, 2010) y de accesiones de uchuva provenientes de los bancos de germoplasma mas completos del pais (Corpoica, 2010; UN, 2007 citado por Bonilla et al., 2009), con el proposito de encontrar variedades resistentes al patogeno en mention que puedan ser usadas por gentes del sector productivo y que minimicen la incidencia nociva de la enfermedad.

1. PROBLEMA DE INVESTIGACION

1.1 Descripcion Del Problema

En el 2008 productores de uchuva del departamento de Cundinamarca reportaron la ocurrencia en sus cultivos de una enfermedad caracterizada por una muerte clorotica ascendente que terminaba “secando” los cultivares. Dicha enfermedad habia afectado seriamente la produccion y sostenibilidad no solo de los cultivos administrados, para ese entonces, por mano de obra campesina con un grado intermedio de tecnificacion, sino incluso los cultivos con mayor tecnificacion (Carolina Gonzalez, Comunicacion personal, 2009).

Fue entonces cuando en el proyecto financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) 2008: Evaluacion de resistencia o tolerancia de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana) a Fusarium oxysporum como contribution al control integrado de la enfermedad; ejecutado por los grupos del Laboratorio de Microbiologia Molecular y del Laboratorio de Genetica Molecular Vegetal del centro de Biotecnologia y Bioindustria de Corpoica, se emprendio la busqueda del agente causal de la epifitia, atribuida tentativamente a F. oxysporum, con base en la etiologia reportada en campo y en aquella identificada para la fusariosis.

Para ello los grupos de investigation del proyecto durante el 2008 recorrieron fincas ubicadas en los principales sectores productivos de los departamentos de Cundinamarca y Boyaca a saber: dos fincas en el municipio de Granada, una en Silvania y dos en Pasca, Cundinamarca y una en el municipio de Combita y dos en Arcabuco en el departamento de Boyaca (Tabla 1). En cada una de las fincas se seleccionaron cinco plantas aleatoriamente. Las plantas presentaban los sintomas externos caracteristicos de la enfermedad. El numero de plantas colectadas vario segun el tamano de cada uno de los predios, el grado de incidencia de la enfermedad, la severidad de los sintomas y la presencia de cultivos asociados al cultivo de uchuva. Muestras de plantas sin algun sintoma aparente de la enfermedad tambien fueron colectadas para ser utilizadas como control. La recoleccion de

muestras para el aislamiento del patogeno se realizo a partir de muestras de raiz, tallo y corona (Rodriguez, 2010).

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Fuente: Rodriguez, E., Alirio. - Aislamiento y caracterizacion de cepas de Fusarium oxysporum en uchuva (Physalis peruviana) y evaluacion de la patogenicidad en invernadero. - Universidad de Cundinamarca. - Facultad de Ciencias Agropecuarias, Programa de Ingenieria Agronomica, Fusagasuga, 2010. Reproducido con permiso del autor.

Tras un ano y medio de realizar la caracterizacion morfologica, taxonomica y molecular de los aislamientos, y a su vez de establecer una coleccion completamente caracterizada a partir de cultivos monosporicos, se concluyo la identidad del patogeno a nivel de especie como Fusarium oxysporum Schltdl. (Rodriguez, 2010). Para ello se utilizaron el manual de laboratorio de Fusarium (Leslie and Summerel, 2006), la clave reportada por Nelson et al., (1983) y los analisis de secuencia de las regiones no codificantes IGS (Inter Genic Spacer) o regiones espaciadoras intergenicas del ADNr y una region del gen CO1 (Citocromo oxidasa 1), utilizadas en estudios previos de caracterizacion del genero Fusarium y de otros microorganismos (Rodriguez, 2010). Como complemento a dicha caracterizacion, el patogeno causal de la enfermedad fue corroborado por postulados de Koch.

A partir de estos estudios se hizo patente la necesidad de encontrar una solucion a la marchitez vascular producida por F. oxysporum que minimizara el dano de la enfermedad, que estuviera en armonia con la tecnologias ambientales, que fuera efectiva en la practica, con soporte y evidencia cientifica y que estuviera acorde con las normativas internacionales de inocuidad y buenas practicas agricolas. La opcion que respondia a todas estas exigencias fue la busqueda de variedades resistentes y /o tolerantes a partir de materiales inexplorados presentes en nuestro pais y provenientes de distintas partes del mundo. En tal sentido se decidio usar las accesiones de los bancos de germoplasma de uchuva mas completos del pais: Universidad Nacional, Universidad de Narino y Corpoica sede La Selva. Estos materiales o accesiones cuentan con una base de datos con excelentes datos de pasaporte.

1.2 Planteamiento Del Problema

La uchuva es la especie fruticola con mayor proyeccion internacional, especialmente en el mercado europeo (Bonilla et al., 2009). En el 2005 se exporto uchuva por valor de US 23,8 millones FOB y 6.422 t de fruta fresca, con incrementos del 70% con respecto a las exportaciones del 2004 (MADR- CCI, 2006). En el 2006, la uchuva participo con el 59% del valor de exportaciones de frutas fresca, alcanzando US 16,6 millones (MADR, 2006). La uchuva fue el producto mas exportado por Colombia al mundo en 2007, al concentrar el 75,2% del mercado (Legiscomex, 2008) y repitiendo en 2009 (Bonilla et al., 2009), con una tendencia a tener mayor representatividad en el mercado exportador nacional. No obstante, aunque el volumen de exportaciones entre el 2005 y el 2007 se mantuvo en un promedio de 6.305 t (FOB de 24,2 millones de dolares), en el 2008 tuvo una reduccion a 5.750 toneladas, posiblemente como resultado del bajo precio del dolar y la reduccion en area sembrada. (PROEXPORT BACEX, 2008).

Esta reduccion del area sembrada se explica por los importantes problemas fitosanitarios del cultivo. En Cundinamarca, entre el ano 2004 y el ano 2005 se informa de una caida cercana a las 100 hectareas, atribuida por los productores de la zona de Granada, a que se usa material de propagation infectado, el cual ha provocado la diseminacion del Fusarium spp, hongo que produce una de las enfermedades de mayor impacto economico y productivo en la production de uchuva (Bonilla et al., 2009). Esto se debe en gran medida a que las empresas plantuladoras, utilizan unicamente el material de la zona para propagacion, que usualmente no pasan por un proceso previo de certification. Ello ha conllevado el uso excesivo de agro insumos, que ha aumentado los costos de produccion, por cuanto el cultivo ha sido manejado de forma similar a los cultivos tradicionales en la zona, como la papa y la arveja (CCI, 2009).

Dicho inconveniente viene generando alta desmotivacion entre los productores, quienes optan, en algunos casos, por erradicar el cultivo con machete, pues no les sale rentable la cosecha, con precios que oscilan entre $200 y $400 /kg. (Bonilla et al., 2009).

Todo lo anterior ha generado el desplazamiento del cultivo hacia Boyaca, sin las respectivas prevenciones y manejo fitosanitario, en donde se observa incremento en los cultivos de uchuva. En Antioquia, de acuerdo con las encuestas realizadas a los agricultores por Corpoica, Centro Experimental la Selva en el ano 2004, el problema se repite, exacerbando la complicacion a una epifitia de orden nacional.

Por ende la fusariosis, identificada ya para F. oxysporum, ha ocasionado perdidas tangibles en el cultivo de la uchuva, y ha ocasionado un altisimo riesgo de la perdida del estatus de Colombia como pais exportador por excelencia y suministro de la fruta. De acuerdo con la information de la CCI (2005 y 2006), a pesar del balance productivo y comercial positivo de la canasta de frutas promisorias exportables y el auge que tienen los productos exoticos colombianos por productos novedosos, convenientes, inocuos y con altas calidades nutricionales, el desempeno de los frutales promisorios ha sido lento, dificil y muy fluctuante, con bajos volumenes y poca continuidad; insuficiente para posicionar el pais y lograr el desarrollo de una verdadera diversification exportadora del sector fruticola. La alta dispersion de la production exportable, revela la falta de nucleos productivos regionales que permitan el desarrollo de economias de escala y el aprovechamiento de externalidades (Bonilla et al., 2009). Los inconvenientes que exacerban la falta de nucleos productivos se caracterizan por la tendencia a la dispersion de la produccion. Cuando la produccion no se concentra en una zona; es mas, cuando la produccion no se radica en una zona a escala, la productividad es ineficiente en asegurar el suministro constante del producto.

Es por ello que un suelo malogrado con F. oxysporum no solo representa un problema inmediato para la fragil economia de un nucleo familiar campesino, sino que mella de inmediato el animo de establecer una produccion a escala nacional.

No se puede permitir tal escenario, es necesario encontrar con suma urgencia variedades resistentes al patogeno que erradiquen el abandono de los cultivos y los descensos de la productividad nacional, todo lo cual trae consigo pobreza al sector productivo.

1.3 Pregunta De Investigacion

Son las accesiones elite de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana L) resistentes y/o susceptibles a aislamientos patogenicos de cepas de Fusarium oxysporum?

1.4 Hipotesis

Existe al menos una accesion elite de de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana L) resistente a aislamientos patogenicos de cepas de Fusarium oxysporum.

2. JUSTIFICACION

La competitividad de los mercados internacionales demanda que Colombia este acorde con la normatividad de los paises importadores. Los productos colombianos pueden gozar de amplia aceptacion y representatividad internacional si logran sobrepasar las barreras fitosanitarias, legales y a lo sumo politicas de quienes los importan para consumo. Es por ello que se hace imperativo que la agroindustria colombiana conozca, adopte y formalice los estandares minimos de calidad de los productos que exporta. La uchuva, producto vanguardia y esperanza de la exportation colombiana, debe responder satisfactoriamente normativas como la Globalgap. Para ello se trabaja en la elimination de los problemas fitosanitarios, de inocuidad y de malas practicas agricolas que tanto mellan la calidad natural de nuestros productos.

Colombia debe impedir que el creciente problema fitosanitario de la fusariosis acabe una de sus industrias nacientes mas prosperas de la ultima decada. La uchuva corre el riesgo de disipar su caracter como producto vanguardia y esperanza para el incipiente agro negocio internacional Colombiano. Ano tras ano la fusariosis agudiza la situation productiva de la fruta y gana terreno en los centros productores. Es imperativo lograr una solution a corto o mediano plazo que finalice, o por lo menos disminuya, la incidencia de la enfermedad limitante, a la vez que respeta las buenas practicas agricolas en armonia con la normatividad pedida.

Este proyecto contribuye en ayudar a solucionar el gran problema fitosanitario como es la fusariosis causada por el hongo Fusarium oxysporum, principal agente causal de la marchitez de la uchuva y uno de los pocos identificados con certeza a la fecha, a traves de una de las mejores alternativas de tratamiento a nivel economico, ecologico, agronomico y a lo sumo practico: la busqueda de resistencia varietal de ecotipos poco o nada estudiados.

3. OBJETIVOS

3.1 General:

-1- Evaluar la resistencia y/o susceptibilidad de diferentes accesiones de uchuva (Physalis peruviana L) a partir de una coleccion de aislamientos de Fusarium oxysporum.

3.2 Especificos:

3.2.1 Establecer y estandarizar una escala de evaluacion de sintomas de la enfermedad en Physalis peruviana L, para determinar la patogenicidad de las cepas de Fusarium oxysporum..

3.2.2 Hallar la concentracion optima del inoculo de Fusarium oxysporum que induzca los sintomas de la enfermedad sobre Physalis peruviana L, usando una cepa previamente conocida por su patogenicidad

3.2.3 Establecer una coleccion de trabajo de Physalis peruviana L evaluada por su resistencia, tolerancia y/o susceptibilidad a Fusarium oxysporum en invernadero.

4. MARCO TEORICO

4.1 El hospedero: La uchuva (Physalis peruviana L).

La uchuva se encuentra ubicada en una de las familias mas importantes para el hombre. En esta familia descuellan plantas alimenticias, medicinales y ornamentales, dentro de las cuales las alimenticias tienen preponderancia mundial. Esta familia solo es equiparable en importancia para el hombre con la antigua Graminea, actualmente subdividida en el sistema mas aceptado.

4.1.1 FAMILIA SOLANACEAE Juss (Linnaeus, C., 1753).

Descripcion botanica

Habito: Plantas herbaceas, arbustos, arboles, lianas terrestres o epifitas, erectas o decumbentes, a menudo armadas, glabras o pubescentes, los tricomas simples, dendriticos o estrellados, con frecuencia glandulares.

Hojas: alternas, a veces geminadas, simples o pinnado compuestas, enteras o pinnatipartidas, glabras o pubescentes.

Flores: Inflorescencia terminal, puede cambiar a una posicion lateral, opuesta a las hojas, internodal o axilar, solitaria o en cima, racimo, panicula o umbela. Flores completas, la mayoria perfectas, rara vez dioicas, desde tamano pequeno hasta muy grandes, algunas fragantes, en general pentameras, actinomorfas o zigomorfas

Caliz: gamosepalo, campanulado a tubular, casi siempre 5-lobado, a veces 4-6 lobado o truncado, en algunos casos con un epicaliz con una serie de dientes secundarios, persistente, en ocasiones acrescente en el fruto.

Corola: gamopetala, rotacea, tubular, campanulada, infundibuliforme,

hipocrateriforme o urceolada; limbo 5-lobado, plegado, valvado o imbricado en prefloracion.

Estambres: epipetalos, por lo general 5 o reducidos a 4 o a 2, los filamentos libres o unidos, algunas veces con apendices en la base.

Anteras: bitecas, las tecas paralelas y conectadas, conectivo a veces agrandado, la dehiscencia por hendiduras longitudinales o en poros terminales.

Ovario: supero (un poco infero en Solandra), de dos carpelos unidos, bilocular, el numero de loculos se incrementa o se reduce por proliferacion o reduccion de los septos, con muchos ovulos, placentacion axilar, disco o receptaculo hipogino, rara vez perigeno.

Estilo: largo, simple; estigma pequeno, entero, capitado o apenas bilobado.

Fruto: en su mayoria una baya o capsula, rara vez drupaceo; semillas muchas a numerosas, a menudo comprimidas, rara vez aladas o pubescentes, el embrion recto o arqueado y periferico, cilindrico o aplanado, no plicado, endospermo craso (Dunal, M. F., 1852; Bentham et al., 1873; Seithe, A., 1962; D'Arcy, W.G., 1973; Gentry et al., 1974; Nee, M., 1986; Rzedowski, G. C. de, J. Rzedowski et al., 2001 citados por Ponce et al., 2003).

Familia que comprende 96 generos y alrededor de 2,300 especies (D’Arcy 1991). Es de distribucion cosmopolita; sin embargo, se encuentra con mayor frecuencia en regiones tropicales, subtropicales y zonas templadas; en un intervalo altitudinal de 0 a 3000 m. Solanaceae incluye especies de gran importancia economica: alimenticia, como la papa, Solanum tuberosum L.; jitomate, Solanum esculentum L.; berenjena, Solanum melongena L.; chile, Capsicum spp.; y tomate de hoja, Physalis spp.; otras de uso industrial como el tabaco, Nicotiana tabacum L.; ornamentales como petunia, Petunia spp.; floripondio, Brugmansia spp.; copa de oro, Cyphomandra spp.; y huele de noche, Cestrum nocturnum L. A algunas especies de la familia se les atribuye uso medicinal: Cestrum spp., Datura stramonium L., Nicandra physalodes Gaertn., Physalis spp. y Atropa belladona L. (D’Arcy 1974).

La uchuva, a su vez, pertenece al genero Physalis:

4.1.2 GENERO PHYSALIS (Linnaeus, C., 1753).

Tipo: Physalis alkenki L.

Descripcion botanica

Habito: Hierbas anuales o perennes, algunos sufrutices y pocos arbustos, desde 20 cm hasta 2 m de alto; con rizomas en la mayoria de las perennes; erectas, procumbentes, postradas o extendidas, con frecuencia se apoyan en otras plantas; glabras o pubescentes, los tricomas simples a ramificados o estrellados, algunas veces glandulares, por lo comun viscidas y con olor fetido. Tallos con ramificacion dicotomica, pocos o muy ramificados desde la base; cilindricos, pocos angulosos; lisos o costatos; herbaceos o algunas veces lignificados en la base, en algunas especies llegan a enraizar en los nudos basales.

Hojas: pecioladas, alternas, rara vez parecen opuestas, solitarias o geminadas, desiguales en tamano, la pequena hasta un medio menor que la mayor; limbo foliar en su mayoria ovado, en ocasiones orbicular, lanceolado o linear lanceolado; el margen entero, repando, sinuado, aserrado o solo con algunos dientes; el apice agudo, obtuso y pocas veces acuminado; la base decurrente, cuneada, simetrica u oblicua, rara vez subcordata o hastada.

Inflorescencias: solitarias la mayoria, pocas fasciculadas o en falsos racimos por la reduccion de los entrenudos. Botones esfericos u ovoides, apiculados, glabros o pubescentes, los tricomas adpresos o no, simples.

Flores: pediceladas, axilares y pendulas, los pedicelos cortos o algunas veces alcanzan hasta 5 cm de largo

Caliz: 5-lobado, los acumenes de los lobulos de forma igual a los mencionados en el fruto.

Corola: campanulado rotada, por lo comun refleja, en pocas especies tubular campanulada, con el limbo extendido o angosto o bien urceolada con el limbo constricto, desde 0.5 mm hasta 6 cm de largo; limbo de la corola casi siempre 5- angulado, pocas veces 5-lobado; amarillo, amarillo verdoso o amarillo crema, blanco o purpura. Lobulos de la corola con cinco maculas, las maculas simples de color uniforme o palidecen hacia el borde, o compuestas por pequenas manchas o puntos agregados, de tono contrastante con el color de la corola o de poca intensidad, a veces inmaculados; cuello de la corola ornamentado con tricomas cercanos a las maculas, pocas veces ausentes, los tricomas blancos, simples, en algunos casos poco ramificados.

Estambres: cinco, anteras con dehiscencia longitudinal, purpuras, azules, azules con una linea amarilla o amarillas; filamento filiforme.

Ovario: con un estilo filiforme, estigma claviforme, algunas veces capitado.

Caliz: en el fruto acrescente, inflado vesicular, cubre por completo a la baya durante la fructificacion, 5-angulado o 10-costato, con cinco angulos mas rominentes o cilindrico, de menos de 1 a 6 cm de largo, en la mayoria de las especies de 1-2.5 cm de ancho; lobulos del caliz ovados, lanceolados, deltoides o angostamente triangulares, el apice agudo, corto acuminado, subulado o caudado subulado. Pedicelos de 0.6 a 6 cm de largo, pocas veces robustos y recurvos.

Fruto: una baya suculenta, en su mayoria sesil y pocas veces sobre un ginoforo, la baya de color verde, naranja, amarilla o con tonos purpuras, de 0.8-1.5 cm de diametro (hasta 4 cm en el tomate cultivado). Semillas numerosas, de 100 a 300, reniformes o lenticelares, faveoladas, de 1.2-2 mm de diametro, amarillas o de color cafe dorado (Dunal, M. F., 1852; Bentham et al., 1873; Seithe, A., 1962; D'Arcy, W.G., 1973; Gentry et al., 1974; Nee, M., 1986; Rzedowski, G. C. de, J. Rzedowski et al., 2001 citados por Ponce et al., 2003).

Physalis se ubica en la subfamilia Solanoideae y en la tribu Solanae. Es genero americano que se distribuye en Estados Unidos de America, Mexico, Centroamerica, Sudamerica y Las Antillas, con algunas especies presentes en el Viejo Mundo. El taxon incluye cerca de 90 especies, mas de la mitad de estas crecen en Mexico, siendo su centro de diversidad (D’Arcy Op. cit.; Martinez 1998).

4.1.2.1 Relacion del genero Physalis con otros generos:

Physalis se relaciona con los llamados generos “physaloides”. En Norte America se encuentran Chamaesachara, LeucoPhysalis, Quincula y Jaltomata. Esta ultima se extiende desde el suroeste de Estados Unidos hasta Bolivia. Entre los taxones sudamericanos se cuentan Deprea y Larnax, mientras que Saracha esta restringida al noroeste de sudamerica y Athenaea a Brasil. Por otra parte, Physaliastrum y ArchiPhysalis se localizan de manera exclusiva en China y Japon. Physalis tiene semejanza con los taxones mencionados en algunos rasgos florales y/o el caliz acrescente en el fruto. Sin embargo, se distingue de ellos porque produce una baya suculenta y el caliz es inflado vesiculoso durante la fructificacion.

Estrada y Martinez (1998) proporcionan una clave de identification y distincion de dichos generos. El macizo de las especies que se conocen en la actualidad concuerdan con la description de Linneo, que caracterizo a Physalis por la presencia de corolas rotaceas a campanuladas, pendulas; caliz acrescente, inflado durante la fructificacion y anteras con dehiscencia longitudinal. Cuatro especies se cultivan por su fruto: P. peruviana L. (uchuva, cape gooseberry) y P. pruinosa L. (ground cherry, tomate de cascara) se usan para mermeladas; P. alkekengi L. (linterna china) se usa como ornamental; y P. ixocarpa Brot. (considerada sinonimo de Physalis philadelphica) (Tomatillo, tomate de cascara) se usa como hortaliza y verdura para las salsas (Willis, 1966 citado por Moriconi et al., 1997; McCain, 1993; Nee, 1986; Menzel, 1951).

4.1.3 Physalis peruviana L.

4.1.3.1 Taxonomla

La clasificacion botanica de la uchuva segun las ordenes de Engler es la siguiente (Ponce et al., 2003):

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4.1.3.2 Nombres:

En Espanol, ademas del nombre de uchuva la Physalis peruviana L se conoce con los siguientes nombres: uvilla, copa capoli, agua y mate, amor de bolsa, cereza del Peru, cuchuva, miltomate, motobobo, embolsado, sacabuche, cereza de judas, yuyo de hojas, cereza de invierno, cereza de la tierra, tomate de cascara.

En ingles: Cape gooseberry (grosella del Cabo), peruvian grandcherry (cereza del Peru), grauncherry.

En Colombia: "Guchuba" (Boyaca), "hierbabuena" (Cundinamarca), "uchuva" (Cundina- marca), "uchuvo" (Cundinamarca), "uvilla" (Huila), "vejigon" (Huila, Tolima), tomate" (Magdalena) (Florez et al., 2000).

Indistintamente de la nominacion se refiere a la misma fruta de la misma planta, aunque los homonimos son bastantes frecuentes, tal como nombrar uchuva a Physalis cordata o a P. angustiphisa. Prefierase siempre referirse a ella como P. peruviana (D’Arcy, 1991).

4.1.3.3 Descripcion Botanica

Habito: Es una planta perenne, herbacea, arbustiva y fuertemente ramificada. Crece normalmente sin tutorado hasta una altura de 1 a 1,5 m. En plantas que se desarrollan con un tallo principal, se encuentran de 4 a 5 ramas productivas dominantes. Despues de la maduracion las hojas se amarillean y se caen. Las flores son solitarias y hermafroditas, son facilmente polinizadas por insectos, el viento o autopolinizacion.

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Figura 1. Habito herbaceo de la uchuva y su crecimiento rustico. Fuente: Perez, 1986

Raiz: Son fibrosas y se encuentran entre unos 10 y 15 cm de profundidad, el sistema radical es ramificado y profundiza con sus raices principales hasta unos 50 cm, proporcionandole un buen anclaje a la planta. El desarrollo de raices esta relacionado con el tipo y textura del suelo, recomendandose un suelo arcillo arenoso.

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Figura 2. Raiz de uchuva. Notese la fuerte raiz principal. Fuente: Victor Pulido.

Tallo: Es herbaceo, cubierto de vellosidades suaves, color enteramente verde, con nudos y entrenudos. En cada uno de los nudos nace una hoja, que protege a un nUmero de yemas que se desarrollan dando origen a ramas o tallos principales. Crece sin tutorado hasta una altura de 1,5 m. aprox. Con poda y espaldera supera los 2,5 m., terminando su desarrollo vegetativo con la formacion de una inflorescencia.

Hojas: son simples, enteras y acorazonadas, dispuestas en forma alterna en la planta. El limbo es entero y presenta vellosidades que las hacen suaves al tacto, muy pecioladas y de tamano variable.

Flores: Son solitarias, pedunculadas y hermafroditas, se originan en las axilas y estan constituidas de una corola amarilla en forma tubular, originada en cinco petalos soldados con cinco puntos morados en su base.

A

Figura 5. Flores de uchuva: A. Flor donde destacan las manchas internas. B. Seccion inferior de la flor gamopetala. Fuente: Salgado et al, 2006.

Caliz: El caliz gamosepalo esta formado por 5 sepalos persistentes, es velloso con venas salientes y una longitud de 4 a 5 cm que cubre al fruto durante todo su desarrollo. En su madurez se va tornando de color paja y traslucido, de textura apergaminada. Su importancia radica en que protege al fruto contra insectos, pajaros, enfermedades y situaciones climaticas extremas. Ademas de servir como una fuente de carbohidratos durante los primeros 20 dias del crecimiento del fruto (Florez et al., 2000).

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Figura 6. Caliz gamosepalo de uchuva. Fuente: Salgado et al, 2006.

Fruto: Es una baya jugosa en forma de globo u ovoide con un diametro entre 1,25 y 2,15 cm con un peso de 4 a 10 g que contiene unas 100 a 300 semillas. Su estructura interna es similar a la de un tomate en miniatura. La baya varia de color amarillo al ocre o amarillo naranja cuando madura, su piel es delgada y lustrosa y esta recubierta con un caliz. Su sabor varia desde acido hasta muy agrio. Se consume al natural, en ensaladas, helados y tartas. Es un fruto muy rico en vitaminas, sobre todo vitamina C (Florez et al., 2000).

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Figura 7. Fruto de uchuva. A: sin capacho. B: con capacho. Fuente: Ivan Calvo.

4.1.3.4 Origen

En relacion con su lugar de origen existen controversias. Algunos autores consideran que puede provenir de Peru, de las mismas areas que el tomate (Morton, 1987; Criollo e Ibarra, 1992; Chia et al., 1997 Legge, 1974), de los valles bajos de Peru y Chile, donde era conocida y consumida por los Incas (Profiagro, 2007), de diversas areas de Peru y Ecuador (Bartholomaus et al., 1990) y otros consideran que el centro de origen y diversification se ubica principalmente en Colombia, Peru y Ecuador (Medina, 1991), aunque se encuentra distribuida en las zonas altas de los Andes donde crece como planta silvestre (Perez, 1996; Romero, 1961; Trillos et al, 2008), desde Venezuela hasta Chile, en alturas entre 1500 y 3000 msnm (Profiagro, 2007). Actualmente se encuentran cultivos en diversas partes del mundo, como Sur y Centro de Africa, Antillas, Australia, Nueva Zelanda, China, India, Malasia, Filipinas, Estados Unidos e Inglaterra (Morton, 1987), siendo los principales productores Colombia, Sudafrica, Nueva Zelanda, Australia, Kenia e India (Abak et al., 1994).

La uchuva (Physalis peruviana L.) esta ampliamente distribuida en America Latina, se encuentran 10 Bancos de germoplasma que cuentan con 486 accesiones de P. peruviana (IPGRI, 2000). El Banco con mayor numero de accesiones esta Colombia, en los centros de investigation de CORPOICA en Tibaitata (Cundinamarca) y La Selva (Antioquia), con 98 accesiones (Fischer et al., 2005). Una colecta realizada en los ultimos anos en el centro y suroriente de Colombia permitio constituir una coleccion de trabajo en la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, con 222 accesiones, de las cuales el 65,77% son materiales silvestres, el 16,67% materiales cultivados y el 17,56% en estado de maleza, y en donde la mayoria de las accesiones corresponden a P. peruviana (Bonilla et al., 2008).

4.1.3.5 Distribution y ecologia

La uchuva crece como planta silvestre y semisilvestre en zonas altas y se ha expandido a casi todos los altiplanos de los tropicos y a varias partes de los sub tropicos, incluyendo Malasia y China, entre otras. Esta especie se encuentra principalmente en la region tropical de America, las Antillas y Australia. Ademas de Colombia, tambien existen otros paises productores, como Sudafrica, Nueva Zelanda, Australia, Kenia e India. En Colombia es comun la presencia de poblaciones silvestres en los bosques andinos por encima de los 2.200 m.s.n.m. De hecho, esta especie se ha herborizado en los departamentos de Antioquia, Boyaca, Cesar, Cundinamarca, Huila, Magdalena, Narino, Putumayo, Quindio y

Tolima, a altitudes de 1.300 a 3.700 m.s.n.m., mientras que en Nueva Zelanda crece al nivel del mar (FAO, 1982).

La uchuva es clasificada como maleza (Perez 1986), comun en las tierras frias de Colombia, se destaca por ser muy rustica, crecer en toda clase de suelos, prefiriendo los rastrojos y lugares mas o menos sombreados (Romero, 1991). El National Research Council (1989) la describe como una planta pionera para suelos recientemente formados y todavia sin vegetacion y destaca su robustez, habilidad de adaptacion y que esta predestinada para ser cultivada en areas marginales. Tambien se siembra en asociacion con otros cultivos para un uso mas efectivo de la tierra, como por ejemplo con frutales como la curuba, feijoa, tomate de arbol y hortalizas como arveja y frijol o tambien con tuberculos, maiz y cereales.

La uchuva es apta como planta de cobertura para proteger los terrenos de la erosion, sobre todo por su crecimiento vigoroso y expansion rapida sobre el suelo. En Nueva Zelanda se cultiva en suelos pobres y secos para limitar el crecimiento de la planta y, segun Klinac (1986), suelos fertiles fomentan el desarrollo vegetativo de manera exuberante, mientras con poca fertilidad se induce a la produccion de frutos.

La planta de uchuva contiene ademas esteroles, que actuan como repelentes contra varios coleopteros, sin embargo esta propiedad, hasta ahora, esta muy poco investigada (Fischer, 2000).

4.1.3.6 Requerimientos Eco fisiologicos De La Planta

.6.1 Altitud

En Colombia la uchuva prefiere sitios entre 1800 y 2800 m.s.n.m con el aumento de la altitud se incrementa la radiacion ultravioleta y la temperatura baja, ocasionando en la uchuva un porte mas bajo de la planta, hojas mas pequenas y gruesas que permiten filtrar mejor la radiacion UV, aplazando el primer pico de produccion, situacion que junto con los factores climaticos, repercute de una manera positiva en su estado fitosanitario (Fischer y Angulo, 1999).

.6.2 Temperatura

La planta crece en temperatura promedio anual entre los 13 y 1833, temperaturas muy altas pueden perjudicar la floracion y fructificacion; no obstante, se reporta que en Hawai temperaturas diurnas entre 27 y 303 no afectan el cuajamiento de los frutos (National Research Council, 1989). En suelos calientes (22-29C), el crecimiento longitudinal de las ramas hace que el numero de frutos aumente, comparado con las temperaturas edaficas de 15C; pero en suelos de mayor temperatura, como en las laderas expuestas directamente al sol, aumenta la caida prematura de frutas y hojas por una senescencia anticipada.

Pese a que esta planta es susceptible a heladas, despues de una helada ligera suelen ocurrir rebrotes de las ramas basales. Entre tanto, las plantaciones no prosperan cuando las temperaturas nocturnas son constantemente menores a los 10°C (Fischer, 2000).

.6.3 Agua y humedad

Las precipitaciones deben oscilar entre 1000 a 2000 mm bien distribuidos a lo largo del ano, con una humedad relativa del 70 al 80%. Las precipitaciones demasiado altas, especialmente en suelos aluviales, conllevan a un crecimiento vegetativo exuberante y atrasan su fructificacion. Una alta humedad durante la epoca de cosecha deteriora el fruto, ademas este tipo de estres puede estancar el crecimiento; el encharcamiento, ya sea durante pocas horas, causa la muerte del sistema radical y, posteriormente el de toda la planta. Asi, en zonas de alto riesgo de humedad se recomiendan los suelos tipo arcillo- arenoso con un buen drenaje y enriquecidos con un alto porcentaje de materia organica.

Un suministro irregular de agua puede causar el rajado de los frutos, asi como por una poda muy severa y, posiblemente por deficiencia de Calcio y Boro, con un crecimiento rapido inicial de la planta, y en el caso de una fertilizacion abundante, especialmente nitrogenada, los primeros frutos tienden a rajarse mas, comparados con los de las plantas menos vigorosas (Fischer, 2000).

.6.4 Luz

La fructificacion de la uchuva parece ser fomentada por una alta radiacion solar (en el altiplano): sin embargo la planta tambien crece en asociacion con un bosque abierto, bajo cierta sombra; dentro de los invernaderos, en donde se presenta una intensidad luminica menor (sin luz UV) y una mayor temperatura, la uchuva tiende a un mayor crecimiento longitudinal y lateral de ramas en comparacion con el campo abierto. Dias cortos con ocho horas de luz, fomentan la induccion floral y por tal razon, se puede clasificar como planta cuantitativa de dia corto (Heinze y Midasch, 1991).

.6.5 Viento

La uchuva puede crecer a pleno sol; sin embargo, es recomendable construir una barrera contra los vientos fuertes, por ejemplo una cerca viva, puede ser necesaria para proteger la planta de la deshidratacion, deformacion y estancamiento del crecimiento y, ademas de una caida prematura de flores y frutos (Lopez, 1998).

4.1.3.7 Generalidades del Cultivo

El cultivo de uchuva se siembra en Colombia en la region Andina principalmente en los departamentos de Cundinamarca, Boyaca, Antioquia y Tolima. Las zonas productivas estan ubicadas entre los 2.000 y 2.550 metros de altitud, con temperaturas de 13° a 18°C, y las zonas de vida bosque muy humedo Montano bajo (bmh- MB) y bosque muy humedo Premontano (bmh-Pm), y en las zonas agroecologicas Fk, Fh y Fn. (Fischer, 2005)

La instalacion del cultivo se presenta en el momento en que el negocio se encuentra atractivo para las comercializadoras internacionales. Teniendo en cuenta que la mayor demanda de uchuva se genera en los mercados internacionales durante los meses de marzo, abril, noviembre y diciembre, el productor de uchuva para exportation, planea las siembras y la recoleccion del fruto de tal forma que le permitan obtener una mayor production en los meses de mayor demanda en el mercado europeo (Fischer, 2005).

En las zonas productoras, el periodo vegetativo se encuentra entre 6 y 7,5 meses, dependiendo de la altura de la zona; el ciclo productivo inicia entonces a partir del 6° a 8° mes, con una o dos recolecciones semanales, hasta completar la vida util del cultivo que es de aproximadamente dos anos. En zonas como Granada se reporta una fase productiva de hasta 18 meses, mientras que Boyaca esta entre 12 y 15 meses de produccion. Dentro del proceso de establecimiento del cultivo, la fertilization se maneja de forma similar a la utilizada en cultivos como papa o arveja, o de acuerdo con las recomendaciones entre los mismos productores (Bonilla et al., 2009).

4.1.3.8 IMPORTANCIA ECONOMICA DE LA UCHUVA

El cultivo de la uchuva se inicio de manera semi comercial en el ano de 1985 (Rodriguez et al., 2000) y hoy es la fruta mas importante dentro del grupo de promisorias de Colombia (Bonilla et al., 2009). La uchuva es el segundo frutal de exportation de Colombia, despues del banano, siendo Europa el principal destino de la fruta, encontrandose que mas del 60% de la production se exporta a Alemania y Holanda (CCI, 2002, Salazar et al., 2008). La uchuva incremento su produccion de 4 toneladas en 1993 a 13.723 toneladas en 2008. Igualmente, el area sembrada paso de 6 hectareas cultivadas en 1993 a 954 hectareas en 2008. De esto se deduce que los rendimientos crecieron, pasando de una productividad de 0,7 toneladas/hectarea en 1993 a 14,38 toneladas/hectarea en 2008 (MADR, 2004 Y 2009).

.8.1 Exportaciones

El valor de las exportaciones de frutas frescas colombianas, excluido banano y platano, llego a una cifra record de US$ 28 millones en 2006, donde la uchuva participo con US$ 16,6 millones (equivalentes al 59%), el bananito con US$2,8 millones (10%); la granadilla, con US$ 3,5 millones (12,6%), y el tomate de arbol y la pitahaya con 3,13% y 2,4% respectivamente (MADR, 2006). El valor de las exportaciones totales paso de US$9,5 millones en 1997 a US$28,0 millones en el 2006, que equivale a un crecimiento del 33,9% en el valor de las mismas (Tabla 3). Durante el 2007, las ventas internacionales de esta fruta llegaron a 25,6 millones de dolares (8 millones de kg), lo que represento un incremento del 11% con respecto al 2006, ano en el que habian sumado 23 millones de dolares.

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Fuente: M ADR, 2006.

En el 2005 se exporto uchuva por valor de US 23,8 millones FOB y 6.422 t de fruta fresca, con incrementos del 70% con respecto a las exportaciones del 2004 (MADR- CCI, 2006), y etre el 2005 y el 2007 se presento un crecimiento promedio anual del 4%, al pasar de USD

23,8 millones a USD 25,6 millones. El volumen de exportaciones entre el 2005 y el 2008 se ha mantenido en un promedio de 6.305 t (FOB de 24,2 millones de dolares) con una reduccion en el 2008 a 5.750 toneladas, posiblemente como resultado del bajo precio del dolar y la reduccion en area sembrada.( PROEXPORT BACEX, 2008) (Figura 8).

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Figura 8. Volumen exportado (Toneladas) de Uchuvas (uvillas) (Physalis peruviana) Tornado de Bonilla et al, 2009.

De acuerdo con lo anterior, a exception del platano y el banano, la uchuva es el frutal que mas contribuye en el total de las exportaciones (Tabla 4), excepto en el periodo 2008 y reasumiendo en el 2009 (Bonilla et al., 2009).

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Tabla 4. Porcentaje de contribucion de la uchuva en el valor total de las exportaciones de frutas (miles de dolares).

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Fuente: MADR, 2006. Tornado de Bonilla et al, 2009.

Para el periodo 2005 a 2008 figuran como principales empresas exportadoras: OCATI S. A., EL TESORO FRUIT S. A., NOVA CAMPO S. A., SCI, I CARIBBEAN EXOTICS S. A., - FRUTERA ANDINA S. A. y C I FRUTIREYES LTDA con 3616, 3457, 3376, 2297 y 2275 toneladas exportadas respectivamente, representando en promedio para cada empresa un valor FOB exportado de 11,2 millones de dolares (Figura 9).

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Figura 9. Principales empresas exportadoras de Uchuvas (uvillas) (Physalis peruviana) (Toneladas). Tornado de Bonilla et al, 2009.

.8.2 Centros de produccion

.8.2.1 Productores

Los productores se segmentan segun el tamano y nivel tecnologico que tienen, de tal forma que se cuenta con pequenos y medianos productores; el eslabon de grandes productores no es significativo. En el comun de los agricultores, los productores de uchuva se clasifican en pequeno productor (empresa familiar y campesina) con un rango entre 600 y 5.000 plantas y mediano productor (empresas medianas) que va de 5.000 a 15.000 plantas. En el pais, la mayoria de los productores son pequenos y no existe una diferencia significativa en cuanto a tecnologias se refiere, entre unos y otros.

Para los pequenos productores los cultivos son muy pequenos, de huerta casera, como los que prevalecen en Antioquia, generalmente, manejados por mujeres, pero siguiendo las recomendaciones tecnicas que exige el cultivo, lo que les permite, aprovechar y minimizar el efecto contaminante en el suelo y el agua. Adicionalmente, las labores de desmalezada son ejecutadas manualmente, causando minimos efectos sobre la erosion de los suelos y maximizando la eficiencia en el uso de insumos (Diaz, R., 2004).

Los productores medianos, como por ejemplo en el departamento de Antioquia, no viven permanentemente en la zona productora y contratan la totalidad de la mano de obra. Las labores de cosecha las delegan a las mujeres y asumen el costo de la asistencia tecnica, pero reciben apoyo en capacitacion para las labores de cosecha y seleccion de la comercializadora. Su nivel de escolaridad corresponde a secundaria y superior. Mantienen contratos de compra con las exportadoras (Diaz, R. 2004).

.8.2.2 Area sembrada

La uchuva se cultiva principalmente en Cundinamarca, Boyaca y Antioquia concentrandose la produccion en Cundinamarca, especialmente en los municipios de Granada y Silvania (Lanchero et al., 2007). En el ano 2004, la uchuva representaba el 2% del area de frutales (360ha), de las cuales el 75,89% estaban en Cundinamarca principalmente en los municipios de Granada (27%), Silvania (26%) y Pasca (14%); el 10,38% en Boyaca en los municipios de Arcabuco (3%), Umbita (2%), Miraflores (2%) y Santa Sofia (2%) y el 5,06% en Antioquia. (MADR, Agronet, 2008). Para el ano 2005, el 90,5 % de la produccion provenia de Cundinamarca con 464 ha, seguido por Boyaca con un 6,3% (42 ha) y Antioquia con el 1,2% (Espinal et al., 2005). Sin embargo, el desplazamiento de la produccion por problemas fitosanitarios de fusariosis (Bonilla et al., 2009) y altos costos de fertilizantes ha llevado a que Boyaca cuente con cerca de 400 ha de uchuva con una productividad promedia de 25 t/ha, liderando en este momento la produccion a nivel nacional. (MADR, Agronet, 2008). Un argumento que explica la congregacion de los cultivos mas eficientes y exitosos en esta zona es su cercania con la capital, lo cual facilita la comercializacion (Observatorio de Agrocadenas, 2008).

A nivel nacional en el 2004 se establecieron 361 ha, en 569 lotes para un area promedia de 0,63 ha y 499 productores (DANE, 2004) y en Cundinamarca se encontraron 320 lotes con un promedio de 0,86 ha/lote, con un alto aporte de mano de obra familiar, con un promedio 443 jornales/ha/ano (Torrado, et al., 2005), valores que superan a cultivos como el algodon, la cana de azucar y la palma que ocupan 70, 82 y 90 jornales/ha/ano, respectivamente (Toro, 2001).

La uchuva se cultiva en predios pequenos, en parcelas entre 3 y 5 ha, con un promedio de 1 ha en uchuva, alternado con otros frutales y hortalizas y con alta participacion de mano de obra familiar, uso intensivo de agroquimicos, bajo nivel tecnologico y sin asistencia tecnica adecuada (Espinal et al., 2005).

.8.2.3 Produccion

En la ultima decada se ha visto un gran dinamismo de la produccion y crecimiento del cultivo, pasando de 932 toneladas en 1995 a 11.327 en el 2004, un crecimiento en el area sembrada para exportation de 20ha en 1994 a 792 ha en el 2004 (MADR-Asohofrucol, DANE, 2004) y con incrementos en el consumo interno con una tasa del 79% promedio anual entre 1995 y 2003, pasando de 10 g a 160 g per capita/ano (Torrado et al., 2005), aunque los rendimientos se han disminuido pasando de 27 t/ha en 1996 a 14,3 t en el 2004 (IICA-MADR, 2003, 2007).

Se presenta durante todo el ano, con epocas de mayor oferta entre octubre y enero, y las de menor oferta, entre abril y julio; la estacionalidad esta relacionada con la variation de la demanda en los mercados europeos (Fischer, 2005). Por esta razon, los productores de uchuva para el mercado nacional tratan de llevar una programacion de siembra, aunque sin ninguna formalidad ni concertacion entre productores.

La produccion de uchuva es liderada por el departamento de Cundinamarca que reporta cerca de 5.000 toneladas de produccion aproximada en promedio para un periodo de 10 anos (1995-2005), sin que se reporte una cifra igual para el resto de departamentos, tan solo una participation menor de Tolima y Boyaca, que para el mismo periodo considerado, alcanzan un promedio de alrededor de 50 y 500 toneladas respectivamente. Es asi como en Granada, Cundinamarca, la produccion de 15 a 20 t/ha/ano produce rentabilidades del 41,8% y 63,1% en plantaciones tradicionales y con Buenas Practicas Agricolas (Torrado et al., 2005).

Sin embargo, information oficial de la Secretaria de Agricultura de Boyaca indica que en Boyaca existen 400 hectareas de cultivo de uchuva, con una productividad promedio de 25 toneladas, y que su produccion es puesta y registrada en Bogota a traves de las empresas exportadoras, aspecto por el cual se distorsiona el origen de esta produccion, la cual se atribuye en parte a Cundinamarca. Esto podria indicar que Boyaca viene liderando a nivel nacional la produccion, considerando que en Cundinamarca se presentan problemas de desplazamiento de cultivos por problemas sanitarios, ademas de bajas motivaciones por el precio y porcentajes de exportation que les asignan las exportadoras.

Se ha encontrado una variation en produccion de entre 4 t/ha en 1993 a 13,7 t/ha en el 2008 y con variaciones en el area sembrada de 6 ha en 1993 a 954 ha en el 2008, pasando de una productividad de 0,7 t/ha a 14,3 t/ha en el 2008 (MADR, 2004 Y 2009). En cuanto al area sembrada en relation con la produccion y el rendimiento, no hay una correlation directa entre variables, puesto que departamentos como Antioquia y Tolima, que no cuentan con areas extensas en relacion con Cundinamarca, que posee el area mas grande, pueden tener un rendimiento mayor o cercano a este departamento, sin que su produccion sea considerable (Figura 10). Para el caso de Antioquia, la razon que aducen los productores, obedece al hecho que estos sistemas productivos son manejados por mujeres cabezas de familia y no alcanzan areas mayores de una hectarea, asi que tienen un excelente manejo de los insumos, las densidades de siembra y practicas culturales del cultivo, que por esta razon, se piensa, sus rendimientos pueden superar a los demas departamentos (Bonilla et al., 2009).

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Figura 10. Area de Uchuva por departamentos de 2000-2005. Tomado de Bonilla et al, 2009.

De acuerdo con los reportes del grupo de investigacion de CORPOICA, las mayores diferencias en costos de produccion se pueden explicar por el uso de insumos, encontrandose que en el municipio de Ventaquemada el costo de insumos es el 34% del total de los costos y en Tuta alcanza el 51% de los costos en donde se aplican 26 bultos de fertilizante compuesto, 20 kg de fungicidas y 20 litros de insecticida mas que en otras zonas de produccion, con el costo adicional de la aplicacion de estos insumos (Bonilla et al, 2009). Asi, los mayores costos de produccion estan relacionados con los insumos, con la mano de obra, los materiales de tutorado, transporte y agroquimicos (Quintero et al., 2005).

La falta de tecnologias adecuadas en el cultivo y el desconocimiento de requerimientos nutricionales, uso de biofertilizantes, manejo del analisis de suelos y la falta de asistencia tecnica han llevado al uso excesivo de fertilizantes y enmiendas, que se reflejan en las aplicaciones de gallinaza y/o porquinaza entre 2.500 y 5.000 kg. cada cuatro meses, es decir, entre 10 y 20 t/ha de abono organico al ano, acompanado de 400-600 kg/ha de fertilizante qmmico compuesto y de fertilizantes foliares y de smtesis qwmica como nitrato de potasio, lo cual representa un costo entre el 15% (Torrado, 2005) y el 25% (CCI, 2009).

.8.2.4 Rendimiento

El rendimiento promedio nacional del cultivo de uchuva, para el ano 2006, fue de 18 toneladas por hectarea. Sin embargo, Antioquia y algunas zonas de Boyaca presentan rendimientos promedio superior a 36 toneladas por hectarea.

Los mayores rendimientos por ciclo productivo se encuentran entre 26 y 36 toneladas/ha, siendo mayores en Granada, Cundinamarca y Ventaquemada, Boyaca; esto representa un promedio por planta de 13 a 18 Kg/ciclo productivo, como se presenta en el grafico de la Figura 11 (Bonilla et al., 2009).

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Fuente: Grupo de trabajo, Corpoica, 2008.

Figura 11. Produccion (toneladas) promedio en algunos municipios de Cundinamarca y Boyaca. Tomado de

Bonilla et al, 2009.

4.1.3.8.3 Destino de la fruta

Paises Bajos es el principal destino de las ventas internacionales de frutas exoticas, ya que cuenta con el 37% del mercado, equivalente a USD10, 9 millones (Legiscomex, 2008).

Para el 2008 la uchuva fresca se destino en mas de un 80% a los paises de la Union Europea, principalmente a Holanda (37%), Alemania (28%), Francia (9%), Suecia (7%) y Gran Bretana (5%) (Proexport, 2008). Segun MADR, 2008, entre 1996 y 2007, las exportaciones a Suecia, Francia y Reino Unido, se han mantenido, aunque con una leve tendencia a la baja en los ultimos anos, en tanto que las exportaciones a Holanda y Alemania han crecido de forma exponencial para el mismo periodo (Figura 12) (Bonilla et al., 2009).

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Figura 12. Tendencia de exportaciones al mundo de la Uchuva en los ultimos 10 anos. Datos promedio de 1999 a 2009. Fuente: MADR, 2008, Legiscomex, 2008; Bonilla et al., 2009.

Para proexport 2008 los principales paises de destino de exportaciones de uchuva fresca corresponden a Paises Bajos (8.557 toneladas), Alemania (6.822 toneladas), Belgica (4.711 toneladas), Suecia (1.531 toneladas), Reino Unido (783 toneladas), Francia (688 toneladas), Canada (508 toneladas), y Estados Unidos (366 toneladas). Con un menor volumen exportado, figuran paises de destino como Espana, Suiza, Italia, Brasil y Japon (Figura 13).

Entre las principales empresas importadoras —ubicadas especialmente en Europa— sobresalen: PSL GMBH (Alemania), FRUIT IMPORT FACILITIES (Alemania), TFC HOLLAND (Paises Bajos), HAGE INTERNACIONALB V (Belgica), JB MARKETING BVBA (Belgica) y NATURES PRIDE (Belgica).

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Puente: PROEXPORT BACEX, 2008.

Figura 13. Paises importadores de Uchuvas colombianas (Toneladas) en el 2008. Tomado de Bonilla et al, 2009.

Las principales zonas de procedencia de uchuva en fresco para exportation corresponden a Cundinamarca con 22.281 toneladas y a Antioquia con 2.360 toneladas, exportadas entre los anos 2005-2008, siendo la ciudad de salida del mayor porcentaje del producto exportado Santa Marta, seguido, en orden de importancia por Bogota, Cartagena y Buenaventura. Boyaca tambien es una de las principales zonas de procedencia de la uchuva en fresco para exportacion.

4.1.3.8.4 Consumo interno

De acuerdo con information de FAO, en Colombia el consumo per capita anual de frutas frescas es de aproximadamente 4,1 kg., presentando niveles muy bajos frente a otros paises latinoamericanos, como Costa Rica con 49 kg/hab., Cuba con 23,1 kg/hab. y Ecuador con 21,8 kg/hab. Entre 1993 y 2002, el consumo de frutas frescas en Colombia crecio el 1,1% (Bonilla et al., 2009).

En el quinquenio 1995-2000, el consumo aparente de uchuva en Colombia mostro uno de los crecimientos mas dinamicos del conjunto de las frutas colombianas (74,5% promedio anual). Del mismo modo, el consumo per capita crecio a una tasa promedio anual de 72,7% en el mismo periodo, al pasar de 0,001 kilos en 1995 a 0,11 kilos por persona al ano al final del periodo, como puede verse en la tabla 5. (CCI, 2005).

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Fuente: CCI, 2005. Tornado de Bonilla et al, 2009.

Aunque los precios internos presentan una tendencia a la baja, el mercado interno paso de absorber 410 toneladas en 1998 a 7.247 toneladas en 2003, lo que represento un crecimiento del 43,9% del consumo aparente de uchuva en Colombia. Igualmente, el consumo per capita crecio a una tasa anual promedio de 42,21% en el mismo periodo al pasar de 0,01 kilos en 1998 a 0,16 kilos por persona ano en 2003.

Sin embargo, de acuerdo con una encuesta realizada por la CCI (2005), en coordination con el SENA, que incluyo hogares de Bogota, Cali, Medellin, Bucaramanga y Barranquilla, noto que unicamente el 27% de los hogares encuestados habia consumido uchuva y de ellos, solo el 17% reporto haberlo consumido el ultimo mes. Bogota es la ciudad que concentra la mayor participation de hogares demandantes de uchuva en todos los estratos, mientras que las ciudades que registran el menor numero de familias compradoras de esta fruta fueron Cali y Barranquilla, en razon a su desconocimiento (Bonilla et al., 2009).

4.1.3.8.5 Precios

El comportamiento de precios de la uchuva en la comunidad europea ha variado de la siguiente forma: en los anos 1997-1999 el precio fue U$ 12,4/kg, con una reduction en los anos 2000-2002 a U$ 8,3/kg y en 2l 2008 alcanzo niveles mas bajos de U$ 7.26/kg (Bonilla et al, 2009).

4.1.3.9 Normatividad

El mercado mundial tiende actualmente por el consumo de los denominados productos "limpios", es decir, productos que no presenten problemas fitosanitarios ni trazas de agroquimicos; y de productos inocuos, es decir, que no causen danos al ambiente, ni a la salud del consumidor y que garanticen adecuadas condiciones a los trabajadores. Al respecto la legislation en varios paises exige una disminucion considerable del uso de plaguicidas quimicos, la implementation de medidas fitosanitarias integradas y la utilization de buenas practicas agricolas (BPAs) y las buenas practicas de manofactura (BPMs)(http://www.cci.org.co/noticias.html ; http://www.eurep.org/fruit/index_html).

Ejemplo de ello es la normatividad GlobalGAP. Esta iniciativa inicialmente fue conocida como EurepGAP. Consistio en la union de expendedores, comercios, mercados, centros e hipercentros europeos de ventas de productos agricolas provenientes de los mercados americanos, especialmente de los suramericanos, interesados en la trazabilidad, inocuidad y cumplimiento de las BPAs y BPMs de los productos que ellos ofretian. Para ello crearon un certificado que asegura el cumplimiento de tales preceptos, ofreciendo productos confiables al gran numero de consumidores que surten. Este consorcio de mercados amplio su numero de miembros a nivel mundial, constituyendose la normatividad GlobalGAP.

Actualmente los productores nacionales de uchuva luchan por alcanzar tales estandares para obtener el certificado GlobalGAP y asi poder seguir exportando sus productos al mercado mas rentable para esta en el mundo: La union Europea.

4.1.3.10 Usos

Las bayas de esta especie se consumen en fresco o se almacenan para luego mezclarlas enteras o tajadas en ensaladas y cocteles de frutas. El fruto se cuece frecuentemente para usarlo en pies, pudines y helados, tambien se puede enlatar o procesar como mermelada (Verhoeven, 1991).

En la obra de Garcia-Barriga (1913) se mencionan los siguientes usos para esta especie: "Los frutos, que son comestibles y de sabor agradable, contienen un aceite, por lo que son usados como vermifugo; generalmente se les da a los ninos 10 a 15 frutos diarios en ayunas por espacio de 8 dias y luego un purgante. El fruto tambien contiene acido citrico, de ahi sus propiedades diureticas. Se dice que los frutos son narcoticos y en forma de jarabe son utilizados contra la tos ferina de los ninos".

Ademas, de acuerdo con un estudio de realizado por la Corporation Colombia Internacional, la Universidad de Los Andes y el Departamento de Planeacion Nacional (1994), en diferentes regiones de Colombia se le atribuyen a esta planta otras propiedades medicinales tales como las de purificar la sangre, disminuir la albumina de los rinones, aliviar problemas en la garganta, fortificar el nervio optico, limpiar las cataratas y controlar la amibiasis.

El valor nutricional de la uchuva es muy alto, ya que este fruto es una excelente fuente de provitamina A y vitamina C (Hermann, 1994b), tambien presenta cantidades importantes de vitaminas del complejo B, tales como tiamina, niacina y vitamina B12. Los niveles de proteina y fosforo son excepcionalmente altos, mientras que el contenido de calcio es bajo. Segun el National Research Council, el jugo de la uchuva madura tiene altos contenidos de pectinaza, lo que disminuye los costos en la elaboracion de mermeladas y otros preparativos similares (Fischer y Almanza, 1993).

4.1.4 Taxones relacionados con la Uchuva Usados en este estudio:

4.1.4.1 Physalis philadelphica L., 1786.

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Figura14. Flores de P. Philadelphica. A. Detalle de la mancha floral interna concentrica y las anteras. Fuente: USDA, 2003. B. Accesion 09u063. Fuente: Victor Pulido, 2009.

Tipo: no citado, sin localidad precisa, nombre o numero del colector, solo la mencion de que es originaria de Norte America (Ponce et al, 2003).

Sinonimia cientlfica: P. chenopodifolia Willd = Physalis aequata Jacq. = P. ixocarpa Brot. Ex Horn. Algunos autores opinan que los nombres P. aequata y P. ixocarpa no son sinonimos de P. philadelphica, sino que en realidad corresponden a dos especies diferentes no conocidas del Nuevo Mundo (Ponce et al., 2003).

Otros nombres comunes Tomatillo, tomate, tomate de cascara, tomate verde, tomate de milpa. Mexican ground cherry, husk tomato.

Descripcion Botanica

Tomada de (Ponce et al., 2003).

Habito: Herbacea anual, erecta, ramificada, extendida, hasta de 1 m de alto, glabra o en ocasiones con pelos esparcidos de 15 a 60 cm de alto, las partes jovenes con algunos tricomas simples, cortos, menores de 1 mm de largo. Tallo cilindrico, liso, glabro.

Hojas: alternas, limbo de 3.7-7.9 mm de largo, 1.5-4.5 cm de ancho, ovado a lanceolado ovado de 2 a 8.2 cm de largo por 1 a 6 cm de ancho, apice agudo a ligeramente acuminado, base oblicua o atenuada, cuneada a truncada, margen entero a dentado, los dientes agudos en numero de 2 a 6 en cada lado, cortos; peciolo de 1-2.5 cm de largo.

Flor: Flores solitarias con pedicelo de 0.7 a 1 cm de largo; lobulos del caliz de forma ovada, de 0.7 a 1.3 cm de largo, con pelos largos mas o menos tiesos; corola de 0.8 a 2.3 cm de diametro, amarilla que puede presentar manchas de color azul-verdoso que no contrastan fuertemente, o bien, manchas de color morado; anteras azules o de color azul-verde, de 2 a

3.5 mm de largo, generalmente retorcidas despues de la dehiscencia, caliz de 4-7 mm de largo, dividido cerca de la mitad en lobulos deltoides u ovados, por lo comun con tonalidades purpuras obscuras (Figura 14).

Corola amarilla, de 0.9-1.6 cm de largo, 1-2 cm de diametro, el cuello pubescente, maculas simples, purpuras a azules claras en ejemplares de herbario, de 2-4 mm de largo. Estambres con anteras azules, convolutas despues de la dehiscencia, de 2.5-3 mm de largo, filamento purpura, de 2-3 mm de largo. Ovario con un estilo hasta de 10 mm de largo, estigma claviforme.

Caliz globoso o con diez lineas tenues en el fruto, muy inflado sobre la baya, de 1­2.7 cm de largo, 1-2.5 cm de ancho, de color verde con tonalidades purpuras en la base, glabro; pedicelos en fructificacion hasta de 1.2 cm de largo.

Fruto: baya hasta de 1.5 cm de diametro. Semillas de contorno obovado, oval, reniforme o circular, de 1.1 a 2.3 mm de largo y 1.2 a 2.3 mm de ancho, comprimidas, casi planas, superficie reticulado-foveolada a reticulada, color amarillo a cafe.

Plantulas: Hipocotilo de 12 a 40 mm de largo, con pelos; cotiledones de lamina ovada, apice agudo, borde entero, con pelos; epicotilo ausente o hasta de 2 mm de largo; hojas alternas, lamina aovada, apice romo a agudo, borde entero a crenado, con pelos (Espinosa y Sarukhan, 1997).

Altitud: Crece desde el nivel de mar hasta los 2 300 m.

Habitat: Se desarrolla como ruderal, asociada a diversos tipos de vegetacion o como arvense.

4.1.4.2 PhysaHs floridana Rydb., 1903.

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Figura 15. Flores y fruto de P. floridana=P. pubescens. A. Fruto con y sin capacho. Fuente: USDA, 2003. B. Accesion 09u139. Fuente: Victor Pulido, 2009.

Tipo: U.S.A., Florida, Walton Co., summer 1885, Curtis s.n. (holotipo: NY; isotipos: F, NY: microficha MEXU!) (Ponce et al., 2003).

Physalis floridana Rydb es, segun (Ponce et al., 2003), un sinonimo de los muchos que tiene Physalis pubescens L.

4.1.4.3 Physalis pubescens L., 1753.

Tipo: “In India Utraque”, sin algun dato de localidad o colector. (Holotipo: LINN 247.11 microficha IDC 137, microficha MEXU!) (Ponce et al., 2003).

Sinonimia cientffica:=Physalis villosa Miller =Physalis turbinata Medikus =Physalis barbadensis Jacq =Physalis obscura Michaux var. glabra Michaux, Physalis barbadensis Jacq. var. glabra (Michaux) Fernald, Physalis pubescens L. var. glabra (Michaux) Waterfall =Physalis obscura Michaux var. viscido-pubescens Michaux =Physalis viscido-pubescens (Michaux) Dunal =Physalis neesiana Sendtner in Martius =Physalis hirsuta Dunal var. integrifolia Dunal, Physalis pubescens L. var. integrifolia (Dunal) Waterfall =Physalis hirsuta var. repandodentata Dunal =Physalis floridana Rydb = Physalis angustiloba Waterfall.

Habito: Herbacea anual, erecta, ramificada, hasta de 90 cm de alto, viscida, fetida, con pubescencia densa, los tricomas de longitud diversa, hasta de 2 mm, simples, septados, a veces glandulares, blanquecinos o un poco cinereos. Tallo cilindrico, liso, con la base algo lenosa, pilosa, con tricomas densos, lanosos, blanquecinos.

Hojas: alternas en la base, despues geminadas, la menor 1/2 mas pequena que la mayor, limbo de 2.4-11 cm de largo, 1.4-9.8 cm de ancho, ovado a suborbicular ovado, en ocasiones el tercio superior asimetrico y lunulado, apice agudo a acuminado, base oblicua o truncada, pocas veces subcordata, margen entero, repando, en ocasiones con pocos dientes o aserrado, de color verde claro, traslucido y lustroso al secar; peciolo de 0.9- 6 cm de largo.

Flor: solitaria; pedicelo 3-10 mm de largo; caliz de 4-7 mm de largo, 2-4 mm de ancho en la base de los lobulos, estos de 4-5 mm de largo (Figura 15).

Corola: amarilla, de 8-12 mm de largo, 8-15 (-30) mm de diametro, campanulada, rotado pentangular, maculas simples, contrastantes, de color cafe rojizo, de 2.5 mm de largo. Estambres con anteras azules, de 2-4 mm de largo, con el conectivo amarillo, filamento de 2.5 mm de largo. Ovario con un estilo de 4 mm de largo, estigma claviforme.

Caliz: 5- angulado en el fruto, de color verde claro a hialino, una vez mas largo que ancho, 2-3.8 cm de largo, 1.3-2.6 cm de ancho, lobulos triangulares, angostos, acuminados o un poco subulados, a veces se cierran en el apice; pedicelo en fructificacion de 7-17 mm de largo.

Fruto: una baya de 12 mm de diametro (Figura 15).

Distribucion: del NE de EUA a lo largo de la costa del Atlantico, Mexico, Centro America, Argentina y Las Antillas. Introducida y establecida en el Viejo Mundo.

Altitud: Se encuentra en un intervalo altitudinal de 1.030-2.610 m.

Habitat: Physalis pubescens se desarrolla en lugares perturbados, en vegetacion marginal, ruderal o arvense, en canadas con arroyos temporales, pastizales, bosque de pino-encino yecotonias del bosque tropical caducifolio con encinar.

Fenologia: Florece y fructifica de junio a octubre principalmente, pero hay algunos ejemplares herborizados en febrero con frutos.

Observaciones: Entre las caracteristicas diagnosticas que permiten reconocer a Physalis pubescens estan el caliz 5-angulado en el fruto, maculas de la corola simples, de 2.5 mm de largo, que contrastan con el color del limbo de la corola, anteras azules y base del tallo pubescente. Physalis pubescens es bastante variable en la densidad de la pubescencia, se encuentran individuos desde glabrescentes hasta aquellos con pubescencia densa. Asimismo, varia la forma de las hojas, ya que por lo comun son ovadas y enteras con la base oblicua, pero llegan a ser aserradas con la base subcordata y el apice ligeramente acuminado.

4.1.4.4 Physalis viscosa L.

Es un sinonimo de P. cinarescens, segun (Ponce et al., 2003).

Physalis cinerascens (Dunal) Hitchc. var. cinerascens, 1894.

Tipo: Mexico, Matamoros, circa Matamoros urbem, Apr 1831, Berlandier 2316. (Lectotipo: GH; Isolectotipo: F, NY) (Ponce et al., 2003).

Sinonimia cientlfica:=P. viscosa L. var =P. pensylvanica L. var. Cinerascens =P. curassavica L. var. sinuatodentata (Schlecht.) Dunal =P. mollis Nutt. var. cinerascens (Dunal) Gray =P. mollis Nutt. var. parvifolia Rydb =P. saltillensis =P. viscosa L. subsp. mollis (Nutt.) Waterfall var. cinerascens (Dunal) Waterfall =P. viscosa L. var. yucatanensis Waterfall.

Habito: Herbacea perenne, el rizoma hasta de 35 cm de largo, angosto ca. de 1 mm de diametro, la planta postrada a un poco erecta, ramificada desde la base, extendida, densamente pubescente, los tricomas estrellados, le confieren un aspecto blanquecino cenizo. Tallo un poco costato, la base algo lenosa, los entrenudos cortos.

Hojas: solitarias o geminadas, la mayor 1/3 mas pequena que la menor, limbo de 1.5-6.7 cm de largo, 1.3-5.4 cm de ancho, ovado, suborbicular u ovado truliforme, apice obtuso a agudo, base cuneada a truncada, decurrente, margen entero, repando a sinuado dentado; peciolo de 0.5-3.5 cm de largo, un poco engrosado.

Flor: solitaria; botones ovoides, de 6 mm de largo; pedicelo en flor de 0.6-2.2 cm de largo; caliz de 5-6 mm, casi igual de ancho a todo lo largo, dividido en 1/3 en lobulos deltoides, de 1-2 mm de largo.

Corola: amarilla, de 10-11 mm de largo, 8-13 mm de diametro, campanulada ha rotado refleja, maculas simples, de color cafe obscuro a negras, ca. de 2 mm de largo. Estambres con anteras amarillas, de 3-4 mm de largo, filamento de 2 mm de largo. Ovario con un estilo de 7 mm de largo, estigma claviforme.

Caliz: 10-costato en el fruto, casi cilindrico, de 1.4-3 cm de largo, 1.1- 2.1 cm de ancho, lobulos deltoides, de 4-5 mm de largo; pedicelo en fructificacion de 1.3-6 cm de largo.

Fruto una baya de 10 mm de diametro.

Distribucion: EUA; Mexico. La accesion usda en este estudio es originaria del Jardin Botanico, donador Birmingham, UK.

Altitud: Se desarrolla entre 1 700 y 2 100 m.

Habitat: La especie medra en lugares secos, en laderas calizas con vegetacion de pastizal, matorral o bosque tropical caducifolio, en zonas perturbadas.

Observaciones: Physalis cinerascens se caracteriza por la pubescencia densa con tricomas estrellados en toda la planta y su aspecto cinereo. Son distintivos tambien los pedicelos largos en el fruto, hasta de 6 cm de largo y las hojas ovado truliformes.

4.1.4.5 Physalis pruinosa L., 1753.

Tipo: sin localidad, fecha o colector, solo se menciona que “habita en America”. (holotipo: Herb. Linn. no. 247.13, LINN, microficha MEXU!) (Ponce et al, 2003).

Sinonimia cientffica:= Physalis maxima Mill = Physalis cordifolia Dunal = Physalis nicandroides Schltdl.

Habito. Herbacea anual, erecta, ramificada, viscida, fetida, hasta de 80 cm de largo, pubescente, los tricomas simples, unos cortos y otros largos, algunos glandulares. Tallo un poco costato, con pubescencia densa.

Hojas: solitarias o geminadas, la menor 1/3 mas pequena que la mayor, limbo de 3.6-13 cm de largo, 2.1-6 cm de ancho, ovado, suborbicular a cordato, apice acuminado, base oblicua, truncada a subcordata, margen generalmente aserrado, a veces entero; peciolo 0.8-4.7 cm de largo.

Flores: solitarias, botones ovoides, de 3 mm de largo, excedidos por los lobulos del caliz; pedicelo en flor de 1.2-4.3 cm de largo; caliz de 8-11 mm de largo, pubescente, dividido casi hasta la base en lobulos caudado subulados, hasta de 8 mm de largo.

Corola: amarilla, 8-12 mm de largo, 8-13 mm de diametro, campanulada, extendida a refleja, maculas simples, largas, alcanzan casi el borde del limbo, de color cafe con tonalidades de color de rosa claro, palidecen hacia el borde. Estambres con anteras amarillas, de 2.5-3 mm de largo, filamento azul, de 2 mm de largo. Ovario con un estilo de 7 mm de largo, estigma claviforme.

Caliz: 5-angulado en el fruto, de 2.3-6 cm de largo, 1.1- 4 cm de ancho, al inicio de color verde, despues de color cafe dorado, lobulos caudado subulados, de 1.1- .5 cm de largo; pedicelo en fructificacion de 2.8-3.5 cm de largo.

Fruto una baya hasta de 1.5 cm de diametro.

4.1.4.6 Physalis angulata L., 1753.

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Figura 16. Physalis angulata. Detalle del caliz del fruto y detalle de la flor.

Fotografia de Maria Chacon. Fuente: Ponce et al., 2003.

Tipo: Herb. Linn. 247.9 (LINN, microficha MEXU!) (Ponce et al., 2003).

Sinonimia cientlfica: =Physalis capsicifolia Dunal =Physalis angulata L. var. capsicifolia (Dunal) Griseb.

Habito: Herbacea anual, erecta a extendida, hasta de 60 cm, ramificada, pubescente en las partes jovenes y calices floriferos, los tricomas simples, muy cortos o cerca de 1 mm de largo, divaricados, blancos. Tallo anguloso, glabro o glabrescente.

Hojas: alternas, limbo de 2.5-9 cm de largo, 1.6-4.5 cm de ancho, ovado, el tercio superior atenuado, apice agudo, base oblicua o cuneada, margen aserrado o sinuado aserrado, los senos hasta de 5 mm de profundidad; peciolo de 0.6-4.4 cm de largo.

Flor: solitaria; botones ovoides, de 3 mm de largo; pedicelo en flor de 4-5 (-8) mm de largo; caliz de 3-4 mm de largo y de 2.5-3 mm de ancho en la base de los lobulos, estos cortos, de 1-2 mm de largo, triangulares (Figura 16).

Corola: amarilla, campanulada, no extendida, pequena, de 5 mm de largo, 5-8 mm de diametro, maculas simples, purpuras, claras al secar, ca. de 1 mm de largo. Estambres con anteras azules o amarillas, de 1-1.2 (-2.5) mm de largo, filamento purpura. Ovario con un estilo corto, de 2 mm de largo, estigma capitado.

Caliz: 10-costato o globoso en el fruto, las costillas incospicuas, de 1.4-3.5 cm de largo, 1.4-2.6 cm de ancho, lobulos triangulares, apice agudo, de 3-4 mm de largo; pedicelo en fructificacion de 6-10 mm de largo, con pubescencia corta. Fruto una baya de 11-13 mm de diametro (Figura 16).

Distribucion: EUA, Mexico hasta Panama, Sudamerica, Las Antillas y en el Viejo Mundo.

Altitud: Crece desde el nivel del mar hasta los 2 400 m.

Habitat: Prospera como arvense asociada a cultivos de maiz o arroz, a orillas de rios, en pastizales o margenes del bosque de pino-encino o bosque tropical caducifolio.

Observaciones: Physalis angulata se caracteriza por los tallos angulosos, las hojas ovadas con el borde aserrado, los dientes agudos y el apice atenuado, asi como por las corolas pequenas y el caliz globoso y grande en el fruto. Se puede confundir con P. philadelphica que tambien posee el caliz globoso en el fruto y algunas veces las hojas dentadas. Sin embargo, la segunda se distingue con facilidad por presentar las anteras contortas despues de la dehiscencia y los tallos redondos.

4.1.4.7 Genero Nicandra Adans., 1763.

Sinonimia cientlfica: Calydermos Ruiz & Pavon, Fl. Peruv. 2: 43 (1799) = Pentagonia Heist. ex Fabr., Enum.: 184 (1759).

Descripcion botanica: Hierbas anuales, glabras. Tallos erectos, ramificados. Hojas simples, alternas, pecioladas. Flores actinomorfas, hermafroditas, pediceladas, solitarias, axilares. Caliz campanulado, con 5 sepalos unidos entre si por el margen interno de las auriculas, herbaceo en flor, persistente, muy acrescente y escarioso en fruto. Corola campanulada, con 5 lobulos sinuados o muy cortos y tubo mucho mas largo que los lobulos. Androceo con 5 estambres insertos a la misma altura en la base de la corola, ± iguales, inclusos; filamentos libres; anteras libres, dorsifijas, de dehiscencia longitudinal. Estigma capitado. Fruto baya, aparentemente seco con pericarpo delgado, con 3-5 loculos, esferico, de dehiscencia irregular, cubierto por el caliz. Semillas subreniformes o de seccion obovada o redondeada, alveoladas.

Observaciones: Genero monotipico. La ralz contiene alcaloides pirrolidinicos y tropanicos.

4.1.4.7.1 Nicandra physalodes (L.) Gaertner, 1791.

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Figura 17. Nicandra physalodes. A. Planta juvenil mostrando el detalle del habito herbaceo. Fuente: infojardin.com. B. Accesion 09u141. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Sinonimia cientlfica: Atropa physalodes L = Physalis daturifolia Lam., = Calydermos erosus Ruiz & Pavon =Physalis peruviana Mill., Gard. Diet. ed. 8: n° 16 (1768), non L., Sp. Pl., ed. 2: 1670 (1763) = Physalis spectabilis Salisb., = Pentagonia physalodes (L.)

Descripcion botanica

Habito: Hierba anual, robusta, glabra. Tallos hasta de 150 cm, eon costillas gruesas y redondeadas.

Hojas: ovadas, obtusas, peeioladas, irregularmente lobadas o sinuadas; peciolo hasta de 110 mm; limbo hasta de 175 x 130 mm, atenuado, eon nervadura marcada, al menos por el enves, con cilios cortos y dispersos en el margen (Figura 17).

Flores: pediceladas, solitarias, axilares, en general pendulas; pedicelos hasta de 32 mm, erectos o erecto-patentes, glanduloso-puberulentos (Figura 17).

Caliz campanulado, con sepalos ovados, acuminados, sagitados, con auriculas acuminadas, soldados entre si por el margen interno de las auriculas, con venacion reticulada muy marcada; lobulos 8,5-18 x 4,5-15 mm en flor y hasta de 34 x 23 mm en fruto.

Corola 10,5-38 mm, campanulada, azul o lila, a veces con la garganta blanca, vilosa interiormente en la zona de insercion de los estambres.

Estambres: insertos a la misma altura en la base de la corola, ± iguales, inclusos; filamentos 3-5 mm, con la base ensanchada, triangular y en general vilosa en los margenes; anteras 2,3-4,2 x 1-1,5 mm, ovado-oblongas, amarillentas.

Estilo: 3-5 mm; estigma 0,8-1,2 mm de anchura.

Fruto: 13-23 mm de diametro, pardo. Semillas 1,5-2,2 x 1,4-1,7 mm, negruzcas cuando maduras.

Ruderal; 5-600 m. Nativa de Peru, se encuentra cultivada como planta ornamental y localmente naturalizada en el Sur de Europa, Macaronesia, Norte de America, India, Mozambique y Australia. Dispersa por la Peninsula Iberica.

4.1.4.8 Genero Solanum

[Solanum, nombre romano de los tomatitos del diablo o hierba mora -Solanum nigrum L.-, que procede del latin sol: sol, o tal vez solanus: el viento del este, sin que se sepa a ciencia cierta las razones que justifica tal denomination. Es posible que se deba a la forma estrellada de las flores, o bien a la capacidad atribuida a los tomatitos de diablo de provocar la locura, lo mismo que ciertos vientos persistentes. En etimologia popular, ha evolucionado a partir del latin solamen: alivio, consuelo, aludiendo al empleo de algunas de sus especies como sedantes y narcoticos] (Bohs, 2005).

Habito: Hierbas anuales o perennes, arbustos o pequenos arboles, inermes o espinosos, glabros o pubescentes, con pelos ramificados, estrellados o simples, glandulosos o eglandulosos. Tallos erectos, ascendentes o decumbentes, a veces volubles y trepadores (Del Monte & E. Sobrino, 1992).

Hojas: esparcidas, a veces anisogeminadas, en general pecioladas (Del Monte & E. Sobrino, 1992).

Flores: actinomorfas, a veces debilmente zigomorfas, hermafroditas, rara vez

funcionalmente unisexuales, en cimas helicoides o escorpioides que forman inflorescencias umbeliformes, corimbiformes paniculiformes o racemiformes, rara vez reducidas a una sola flor, terminales, axilares, o extraaxilares, ebracteadas (Del Monte & E. Sobrino, 1992).

Caliz: campanulado, con 5(9) lobulos, persistentes y frecuentemente acrescente.

Corola: rotacea o estrellada, rara vez campanulada, con el tubo muy corto y el limbo pentagonal con 5(8) lobulos, extendidos o reflejos. Androceo con 5(8) estambres iguales o desiguales, insertos ± a la misma altura en el tubo de la corola; filamentos unidos en la parte inferior formando un anillo adnado a la corola, la parte distal libre; anteras libres, en general conniventes o, a veces, soldadas, basifijas o subdorsifijas, con dehiscencia poricida o bien comienza en un poro apical y continua longitudinalmente hacia la base, introrsas, a veces la inferior mucho mas larga y corniculada. Estigma capitado, globoso o aplanado, a veces deprimido en el centro (Del Monte & E. Sobrino, 1992).

Fruto: baya, carnosa o seca, con 2(7) loculos, a veces con esclerosomas. Semillas discoideas, ovoideas, obovoideas, elipsoideas o reniformes, muy comprimidas, lisas, reticuladas o frecuentemente foveoladas. x = 12. Se estima que este genero puede estar formado por c. 1200 especies de distribution cosmopolita.

Observaciones: Aunque se han senalado distintos tipos de alcaloides en algunas especies del genero, los mas importantes y frecuentes en la mayoria de las especies son los alcaloides esteroldicos (Weese & Bohs, 2007).

4.1.4.8.1 Solanum auriculatum

Es un sinonimo de S. mauritianum Scop., 1788.

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Figura 18. Solanum mauritianum. A. Planta juvenil con la inflorescencia en corimbo. Fuente: Flora uruguaya.com. B. Accesion 09u178. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Habito: Arbusto o arbolillo densamente pubescente, con pelos estrellados, sesiles o ± pedicelados, fetido. Tallos (100)200-400(450) cm, erectos, ramificados.

Hojas: 200-350(400) x 60-110(200) mm, ovado-elipticas, largamente acuminadas, cuneadas, suavemente pubescente por ambas caras, verde obscuras por el haz con pelos erectos y ramificados y mas palidas y con suave tomento estrellado por el enves, con un par de falsas estipulas foliaceas 20-30 mm y ± cordadas en la base del pedolo; pedolo (20)30- 40(50) mm (Figura 18).

Flores: actinomorfas, hermafroditas, pediceladas, en cimas hasta de 15 cm de diametro, corimbiformes, multifloras, pedunculadas; pedunculo c. 150 mm, ramificado en la 1/2 superior; pedicelos 20-40 mm, no articulados (Figura 18).

Caliz: hasta de 7 mm, campanulado, con 5 lobulos, densamente estrellado- pubescente, acrescente; tubo mas corto o igual que los lobulos; lobulos oblongo- elipticos, agudos.

Corola: 20 mm de diametro, 1,5 veces la longitud del caliz, estrellada o rotacea, con 5 lobulos, violeta, con pelos estrellados por el dorso; lobulos c. 7 x 6 mm, ovado- triangulares. Estambres iguales, a veces unos de ellos mas largo; filamentos 0,2-1,5 mm, glabros; anteras hasta de 3 mm, oblongas, amarillentas, libres. Ovario viloso; estilo cilfndrico algo ensanchado y pubescente en la base; estigma globoso. Fruto c. 15 mm de diametro, sobrepasando 1-2 veces el caliz, globoso, fragil, densamente estrellado-pubescente, amarillo-anaranjado. Semillas c. 1,5 mm de diametro, discoideas, pardas. n = 12*.

Ruderal, nitrofila y viaria, en cunetas y baldios; 50-100 m. Originaria de America Central, introducida y naturalizada en muchos paises tropicales y en las islas Azores. Subespontanea en Portugal.

En este estudio tambien se usaron las especies Physalis mexicana y Physalis ixocarpa.

4.2 El patogeno: Fusarium oxysporum.

Fusarium oxysporum es un hongo cosmopolita que existe en muchas formas patogenicas, parasitando mas de 120 especies de plantas Gimnospermas y Angiospermas, gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas (Bosland, 1988).

F. oxysporum presenta una amplia distribution, casi se puede decir que se encuentra distribuido en todo el mundo (Palma, 2004), pudiendose encontrar desde suelos de tipo artico hasta en suelos deserticos, sin contar con el amplio numero de hospederos que puede infectar (Leslie y Summerell, 2006). Estas caracteristicas, sumadas a la amplia variabilidad natural del hongo lo han convertido en el patogeno de plantas mas importante del mundo (Agrios, 2008), asi como uno de los componentes mas estudiados en la fitopatologia moderna.

F. oxysporum esta incluido dentro de los organismos patogenicos causantes de marchitez vascular, problemas de dumping-off y pudricion de corona y raiz. Las enfermedades de tipo vascular a menudo resultan cuando los vasos del xilema son bloqueados en algunas ocasiones por geles compuestos de azucares neutrales encontradas en las paredes celulares de los hospederos (Leslie y Summerell, 2006).

Este hongo ha sido reconocido como el agente causal de la pudricion vascular de mas de 120 especies de plantas, incluidas especies de la familia de las solanaceas tan importantes como el tomate y el frijol y de otras familias como el melon, donde es la principal enfermedad de estos y otros cultivos (Gomez, 2000; Steinkellner, 2005).

Ademas, F. oxysporum es un patogeno emergente oportunista de humanos. Junto con F. solani y F. verticillioides, F. oxysporum es responsable de practicamente todos los casos clinicos de fusariosis diseminada en humanos (Gupta et al., 2003 citado por Di Pietro, 2004). El creciente interes de F. oxysporum como patogeno humano no se debe solamente al incremento en el numero de infecciones, muchas de las cuales con fatal desenlace, sino

tambien a su resistencia generalizada a los antifungicos clinicos actualmente disponibles en el mercado (Guarro et al., 1999 citado por Di Pietro, 2004).

4.2.1 Taxonomia

Clasificacion taxonomica de Fusarium sp de acuerdo al Centro Nacional de Information Biotecnologica NCBI.

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Algunas especies tienen un estado sexual reconocido dentro del genero Gibberella o Nectria, aunque se desconoce el teleomorfo exacto de esta especie (Di pietro, 2004, Agrios, 2008).

F. oxysporum produce tres clases de esporas, a saber:

a) Microconidias: Esporas unicelulares, sin septas, hialinas, elipsoidales a cilindricas, rectas o curvadas; se forman sobre fialides laterales, cortas, simples o sobre conidioforos poco ramificados. Las microconidias tienen 5-12 micras de largo por 2,5-3,5 micras de ancho (Nelson, 1981 citado por Garces et al 2007 y Sandoval, 2010) (Figura 19).

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Figura 19. Microconidias de F. oxysporum e hifas del micelio del hongo en medio CPD (20x, ph 1, contraste de fases). Fuente: Victor Pulido, 2010.

b) Macroconidias: Esporas moderadamente curvadas en forma de media luna o de canoa, con varias celulas, de 3 a 5 septos transversales, de paredes delgadas, fusiformes, largas, con la celula basal elongada y la celula apical atenuada; las macroconidias tienen un tamano de 27 a 46 micras de largo por 3,0 a 4,5 micras de ancho (Nelson, 1981; Leslie et al 2006; Sandoval, 2010) (Figura 20).

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Figura 20. Macroconidias creciendo en medio CLA (100x, ph 3, contraste de fases). Fuente:

Rodriguez, 2009.

c) Clamidosporas: Esporas de resistencia ante condiciones ambientales desfavorables, de paredes gruesas formadas a partir de la condensation del contenido de las hifas y de las conidias. Se encuentran simples o en pares, terminales o intercalares; tienen un tamano de 5 a 15 micras de diametro. Gracias a ellas el hongo sobrevive en el suelo como saprofito de vida libre en ausencia de plantas hospedantes (Garret, 1977 citado por Garces et al 2007 y Sandoval, 2010) (Figura 21).

Su longitud, la cantidad de sus septos, la forma de sus celulas apicales y basales y ademas, la organizacion de las fialides, son caracteres utilizados comunmente en la determination morfologica de Fusarium (Nelson, 1981; Leslie et al 2006).

A

Figura 21. Clamidosporas de F. oxysporum en CPD. A. Clamidosporas intercalares en pares, tipicas de F. oxysporum, en medio CPD (100x, ph 3, contraste de fases). B. Clamidosporas terminales, acompanadas de microconidias, crecidas en medio CPD (100x, ph 3, contraste de fases). Fuente:

Victor Pulido, 2010.

4.2.2 Caracteristicas morfologicas claves en medio PDA.

La morfologia de la colonia en PDA varia ampliamente. El color del micelio varia de blanco a violeta palido, se producen abundantes macroconidias en una masa central de color naranja palido al violeta palido, en algunos aislamientos pueden producirse esclerocios de color cafe, azul o azul muy oscuro (Leslie y Summerell, 2006) (Nelson et al, 1983). F. oxysporum usualmente produce pigmentos de color -violeta o magenta oscuro, pero algunos aislamientos no producen ningun tipo de pigmento. La tasa de crecimiento es rapida (1cm/dia aproximadamente), en el anverso de la colonia se pueden presentar colores que van desde el azul oscuro hasta el violeta oscuro y esos colores pueden ser visibles a traves del micelio cuando se ve la colonia desde arriba (Nelson et al, 1983). Cuando se cultiva en PDA, algunas cepas de F. oxysporum cambian rapidamente a su forma pionotal, (colonia mucosa no algodonosa) con un micelio de color amarillo o anaranjado (Sandoval, 2010).

4.2.3 Caracteristicas de Fusarium oxysporum en medio CLA

Las macroconidias se forman en puntos anaranjados a nivel macroscopico, (conjunto de esporodoquias). Dichas macroconidias son de longitud corta y media, ligeramente curvada a casi rectas, de paredes delgadas con 3 a 4 septos usualmente. La celula apical es corta y es ligeramente curvada en algunos aislamientos. La celula basal tiene forma de pie. Las macroconidias se forman de monofialides en conidioforos ramificados en esporodoquios y, en menor medida, de monofialides de hifas. Las microconidias generalmente no tienen septos, pueden ser ovaladas, elipticas o reniformes (con forma de rinon), y se forman en abundancia en falsas cabezas en monofialides cortas. Las clamidosporas se forman en abundancia en las hifas en la superficie del agar.

4.2.4 Formas especiales y razas

Con base en su especificidad patogenica sobre determinadas variedades de una misma especie de planta, las diferentes especies del genero Fusarium se han subdividido en formas especiales, por este motivo las pruebas de patogenicidad y las caracteristicas de virulencia de los aislamientos del hongo han sido el principal criterio para diferenciar las formas especiales de sus razas fisiologicas (Bosland, 1988).

Y es que el taxon forma especial (f. sp.) se emplea para cepas indistinguibles morfologicamente, pero con propiedades fisiologicas diferentes en su habilidad para parasitar un hospedante especifico; con lo que se pueden categorizar aislamientos que causan enfermedades de una especie, genero o familia en particular (Bosland y Williams, 198780; Bosland, 198881); es decir que aislamientos con el mismo rango de hospedantes se asignan a una forma especial. Dentro de la especie hay mas de 120 formae speciales descritas que afectan a una gran variedad de cultivos como algodon, tomate, tabaco, melon, garbanzo, platano, cana de azucar, cafe entre otros (Di Pietro, 2004).

Ahora, dentro de una determinada forma specialis se diferencian diferentes razas fisiologicas que se distinguen por su patron de virulencia frente a distintos cultivares de la planta (Di Pietro, 2004). El caracter raza fisiologica puede o no correlacionarse con el linaje clonal (Kistler 1997). Por ejemplo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi presenta un alineamiento entre raza, grupo de compatibilidad vegetativa y patrones de "DNA fingerprint", pero en otras formas especiales como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici las razas se encuentran repartidas en diferentes linajes clonales del patogeno (Elias et al, 1993); contrario a lo que sucede con Fusarium oxysporum f. sp. melonis, caso en el cual un unico linaje clonal contiene todas las razas del patogeno (Jacobson y Gordon, 1988).

En cuanto al origen de las formas especiales de Fusarium oxysporum ha existido controversia acerca de si es o no monofiletico. En algunos casos se ha observado que geneticamente, los aislamientos ubicados dentro de la misma forma especial presentan mayor similitud, que en aquellos aislamientos que pertenecen a diferentes formas especiales. Tal es el caso de aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, radicis- lycopersici, niveum y cubense, lo cual se interpreta por un posible origen monofiletico (Kistler, 1997). Por el contrario, hallazgos de Appel y Gordon (1994), sugieren que ciertos aislamientos dentro de una forma especial son menos similares geneticamente a otros de la misma forma especial, que a aislamientos no patogenicos o pertenecientes a otras formas especiales, colocando en duda su origen monofiletico.

4.2.5 Distribucion.

El rango de hospederos es bastante amplio, por lo que se encuentran reportes de especies susceptibles distribuidas en varias familias, entre ellas: Solanaceas (Capsicum frutescens L., Solanum melongena L. esculentum), Leguminosae (Arachis hypogaea L., Astragalus glycyphyllos L., Glycine max L., Phaseolus vulgaris L., Pisum sativum L., Trifolium spp., Vicia faba L.), Cucurbitaceae (Cucumis spp.) y Chenopodiaceae (Beta vulgaris L., Spinacia oleracea L.), entre muchisimas otras. (Palma, 2004).

4.2.6 Sintomas de la enfermedad.

4.2.6.1 Sintomas externos: Los primeros sintomas se observan cuando la planta tiene frutos verdes a maduros, con un amarillamiento de las hojas basales que gradualmente alcanza a las hojas mas jovenes. En infecciones graves las plantas se marchitan y mueren en forma rapida (Palma, 2004; Rodriguez, 2010). Hay perdida de turgencia, epinastia, clorosis de hojas, postracion de la planta y necrosamiento del cuello del tallo (Figura 22).

Figura 22. Sintomas de la marchitez vascular en uchuva causada por F. oxysporum en invernadero. A. Hoja clorotica de uchuva, con signos de necrosis perimetral. B. Hoja sin turgencia de uchuva. C. Postracion del tallo de uchuva. D. Necrosis de las hojas. Fuente: Victor Pulido, 2010.

4.1.6.2 Sintomas internos: El sistema radical se torna cafe y la raiz principal se pudre por completo. El tejido cortical de raices presenta lesiones de color cafe-rojizo y luego se extiende de 5 a 10 cm desde la raiz por el tejido vascular del tallo (no mas de 25 cm sobre el nivel del suelo) (Palma, 2004; Rodriguez, 2010) (Figura 23).

A

Figura 23. Sintomas de la marchitez vascular en uchuva causada por F. oxysporum en campo. A. Sintomas externos tipicos de la marchitez vascular en uchuva producida por Fusarium oxysporum. Notese la aguda clorosis y la acentuada perdida de turgencia. B. Sintomas internos tipicos de la marchitez vascular en uchuva

causada por Fusarium sp. Se observan los vasos conductores de color cafe -rojizo correspondientes al xilema

infectado por el hongo. Fuente: Rodriguez, 2010.

4.3 PATOSISTEMA Fusarium-UCHUVA

Diversos estudios fitopatologicos han demostrado que la mayoria de plantas son afectadas al menos por una enfermedad asociada al hongo Fusarium. Una reciente revision del listado de enfermedades vegetales conservada por la Sociedad Americana de Fitopatologia (www.archos.com apsnet.org / online / comun / search.asp) revela que de las 101 plantas contenidas en la lista y consideradas de gran importancia economica, 81 presentan al menos una enfermedad asociada a Fusarium (MADR- proyecto uchuva-Fusarium, 2007).

Poco o nada se conoce sobre el patosistema Fusarium - uchuva, sin embargo, informacion sobre la interaction entre este patogeno y otras solanaceas como tomate son de gran ayuda para la comprension y estudio de las bases geneticas de la resistencia a esta enfermedad.

La mayoria de los hongos de este genero que producen marchitamientos vasculares pertenecen a la especie Fusarium oxysporum. Todos los marchitamientos vasculares, sin considerar el tipo de patogeno que lo ocasione, tienen ciertas caracteristicas en comun. Las hojas de las plantas infectadas o de partes de plantas infectadas pierden turgencia, se debilitan, adquieren una tonalidad que van del verde claro al amarillo verdoso, decaen y finalmente se marchitan, se tornan amarillas, empardecen y mueren. Los cortes transversales que se hacen de tallos y ramas infectados muestran varias zonas cafes decoloradas dispuestas en forma de un anillo completo o interrumpido que consta de tejidos vasculares decolorados. En los vasos xilemicos de tallos, raices y otros organos infectados, puede haber micelio y esporas del hongo. Algunos de los vasos xilemicos son obstruidos por el micelio, las esporas o bien por los polisacaridos que produce el hongo. Con frecuencia, las celulas parenquimatosas en torno a los vasos del xilema son estimuladas por las secreciones del patogeno para que se dividan excesivamente y, esto aunado a las paredes adelgazadas y debilitadas de los vasos, da como resultado la disminucion del diametro o el colapso total de los vasos (Agrios, 1998).

Para el caso particular de tomate, el marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum es una de las enfermedades mas prevalentes y daninas. La enfermedad se encuentra distribuida en todo el mundo causando grandes perdidas, especialmente en variedades susceptibles y bajo condiciones climaticas favorables. El hongo sobrevive en restos de cultivo de una temporada a otra y posee estructuras de resistencia que le permiten perdurar en el suelo por espacio de 6 anos. Es favorecido por temperaturas calidas (20°C) asociadas a alta humedad relativa. El hongo penetra en la planta a nivel del suelo ya sea por el tallo o por raices superficiales, y luego es trasladado a toda la planta por los haces vasculares. El manejo de esta enfermedad es basado en la siembra de variedades resistentes.

El uso de cultivares resistentes es el metodo de control ideal por economico, seguro, no contaminante y confiable para controlar las enfermedades en la produccion agricola (Stakman y Harrar, 1957; Oyervides, 1999). En tomate y en particular para esta enfermedad, este es el metodo mas satisfactorio (Blancard, 1997), de ahi que una de las prioridades sea encontrar variedades de plantas cultivadas capaces de resistir los danos causados por dicha enfermedad.

La importancia de las variedades resistentes es reconocida universalmente, pues el exito o el fracaso de un cultivo, depende frecuentemente de la reaccion que tenga este frente a un patogeno determinado. Alvarez (2000), indica que la resistencia a enfermedades es indiscutiblemente la contribucion mas grande de la produccion de plantas mejoradas de tomate y ha estado con el desarrollo de los cultivares resistentes a los patogenos comunes (entre ellos Fusarium). Jimenez (2003), senala que utilizando tecnicas de laboratorio para seleccionar plantas resistentes a diferentes microorganismos patogenos, ayuda o facilita y acelera el trabajo de mejoramiento para resistencia a enfermedades que en condiciones de campo puede tardar meses, contribuyendo asi a reducir los costos de produccion a los agricultores.

4.4 MEDICION DE LA ENFERMEDAD:

La estimacion de una enfermedad o fitopatometria, es la medida de enfermedad, entendida como el dano visible, a partir de la medida del valor "X" con dimension 1 en terminos epidemiologicos (Horsfall y Cowling, 1976).

El objetivo principal de la estimacion de danos provocados por enfermedades es ayudar a tener un conocimiento de estas desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo. La determinacion de metodos utiles que permitan estimar danos provocados por diferentes patogenos conlleva a un mejor entendimiento de las enfermedades que provocan (James, 1971 ; Castano-Zapata, 1989 ; Castano-Zapata y Zaini, 1989 ; Castano-Zapata y del Rio, 1993).

4.4.1 Principios De Estimacion De Danos

La evaluacion de germoplasma genetico por su resistencia a enfermedades requiere de metodos precisos y estandarizados que permitan a los investigadores de diferentes paises hablar el mismo lenguaje, para que los resultados sean comparables y se obtenga una comparacion mas eficiente entre las diferentes instituciones involucradas en el mejoramiento de resistencia (Castano-Zapata, 1989).

Si deseamos entender cualquier enfermedad, debemos conocer la severidad. Una sola lesion sobre un tejido puede ser suficiente para determinar la incidencia, pero no es tan explicita o distintiva como la presencia de varias lesiones que pueden provocar el necrosamiento o muerte del tejido atacado; ahi es donde radica la importancia de estimar la severidad de una enfermedad (James, 1971; Castano y Zapata, 1989).

4.4.2 Diagramas estandares de severidad.

La severidad de una enfermedad se define como el area o volumen de tejido enfermo, y se mide en terminos de proporcion de tejido enfermo sobre tejido sano (Castano y Perez, 1997). Narro, en el 2000, la define como el porcentaje de dano ocasionado a la planta para cada una de las variedades evaluadas; mientras que la incidencia de una enfermedad se define como el numero de plantas enfermas sobre el numero total de plantas por 100.

El diagrama estandar, consiste en una serie de ilustraciones que representan diversos grados de severidad de una enfermedad. Cuando el numero de clases es muy reducido, la escala no tendra capacidad discriminativa o de resolucion. Por el contrario, si el numero de clases es muy alto, se pierde tiempo decidiendo cual es el mejor grado que concuerda con la muestra en observation (Castano y Perez, 1997).

Cada vez que se estima el dano provocado por la enfermedad, se debe anotar el estado de desarrollo de la planta y la localization del dano. Cuando se evalua una muestra, esta debe distribuirse dentro de las categorias definidas por el diagrama estandar. El indice de la enfermedad se obtiene multiplicando el numero de unidades de cada categoria por el porcentaje promedio de la misma, se suman estos productos y se divide por el numero total de unidades muestreadas. Este indice es muy util en comparaciones, pero no en descripciones o evaluaciones de resistencia (Castano y Perez, 1997).

4.4.3 Uso de una escala de severidad.

La escala general de cualquier enfermedad consiste en una description numerica y verbal de los ceses o categorias que se distinguen.

La medicion de la intensidad de una enfermedad (incidencia o severidad), es un requisito indispensable en estudios epidemiologicos basicos, como la caracterizacion cuantitativa de epidemias, en estudios aplicativos de pronostico, en la comparacion de diversas practicas de manejo de enfermedades, asi como para determinar la importancia economica de las mismas por medio de los modelos de estimation de perdidas (Campbell y Madden, 1990; Kranz, 1988).

En el caso de la medicion de una enfermedad con base en severidad, constituye un problema complejo ya que se pueden inducir errores graves de precision, exactitud y reproducibilidad, asi como a menor eficiencia con respecto a una medicion con base en incidencia. En este sentido la mayor informacion que normalmente proporciona una medicion de severidad, puede tener un alto costo que debe minimizarce, ya que este no puede eliminarse totalmente. Una forma de disminuir las inconveniencias indicadas, es seleccionar un sistema de medicion que permita aproximar satisfactoriamente el valor de una medicion estimada al valor real del grado de una enfermedad. Para este fin, es necesario considerar las limitaciones que tienen los diversos metodos que se han empleado en la epidemiologia (James, 1971; Van Schoonhoven y Pastor, 1987; Cassanello et al., 1989; Campbell y Madden, 1990).

Existen diversos metodos automatizados para medir la intensidad de una enfermedad (sistemas remotos, uso de video, etc.); sin embargo, los metodos visuales son ampliamente utilizados, debido a la simpleza, sencillez y costos de los mismos (van Schoonhoven y Pastor, 1987; Jaraba et al., 1999). De estos metodos, el uso de escalas es de los mas comunmente utilizados, a pesar de que la gran mayoria son arbitrarias en cuanto al intervalo seleccionado entre las diversas clases, que usualmente se emplean para categorizar diferentes grados de intensidad de una enfermedad (Tovar et al., 2002). Adicionalmente, las escalas en general no cuentan con representaciones fotograficas de la severidad asociada a las diversas clases de forma tal que asistan a un evaluador en la medicion de una enfermedad (Tovar et al., 2002). Esto hace que el sistema de evaluacion sea inexacto, impreciso y poco reproducible durante su aplicacion practica.

Una posible opcion para disminuir estas fuentes de error es el uso de escalas diagramaticas, las que permiten establecer clases con base en un sistema grafico que elimina la designation arbitraria de categorias de una enfermedad (Tovar et al., 2002). Este tipo de sistema de medicion tiene la ventaja adicional de ser practico y de facil uso. Es conveniente aclarar, que no todos los sistemas de medicion con base en escalas diagramaticas son meramente graficos, pudiendo haber logaritmicas, lineales (Van Schoohoven y Pastor, 1987) o totalmente arbitrarias (Shokes et al., 1987; Cassanello ket al., 1989; Hock et al., 1992).

5. METODOLOGIA

5.1 LUGAR DE EJECUCION

El bioensayo se llevo a cabo en los invernaderos del Centro de investigacion de la Corporation Colombiana de Investigacion Agropecuaria (Centro de Investigacion Corpoica- Tibaitata) durante el segundo semestre de 2009 y el primero de 2010, en el municipio de Mosquera, ubicada a los 4°41’40" norte y 74° 12’08 " este, con una altitud de 2543 msnm. Cuenta con una temperatura promedio de 14°C, humedad relativa de 79 a 82% y precipitation anual de 646 a 758 mm.

5.2 MATERIALES

5.2.1 Uchuva:

Se conformo una coleccion de 290 entradas de 10 taxas (si consideramos a P. philadelphica como una especie diferente de P. ixocarpa y a P. floridana como sinonimo de P. pubescens) asi: 218 P. peruvianas (75,17%), 39 P. philadelphicas (13,45%), 2 P. angulatas (0,69%), 3 P. floridanas (1,03%), 2 P. pruinosa (0,69%), 1 P. viscosa (0,34%), 1 P. mexicana (0,34%), 2 P. ixocarpas (0,69%), 1 Nicandra physalodes (0,34%), 1 Solanum auriculatum (0,34%) y 20 sin registro de especie (6,89%) (Tax. Vag. Taxun vagum: taxon incierto).

La coleccion de trabajo de las 290 entradas iniciales se establecio con base en material procedente de las 3 colecciones mas completas de Uchuva de Colombia para el 2009, a saber U. Nacional, U. De Narino y Corpoica sede La Selva, Rio Negro, Antioquia, conjunta con Corpoica, Tibaitata, Mosquera; asi como de material del sector productivo de la empresa Novacampo y del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (U.S.D.A.) (Tabla 6):

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De las 290 entradas se planeo evaluar 60 entradas, no obstante se evaluaron 70, asL 51 P. peruvianas (72,86%), 6 P. philadelphicas (8,57%), 1 Nicandra physalodes (1,43%), 2 P. angulatas (2,83%), 2 P. floridanas (2,83%), 2 P. pruinosas (2,83%), 1 P. viscosa (1,43%), 1 P. mexicana (1,43%), 2 P. ixocarpas (2,83%), 1 tax. vag. (1,43%), 1 Solanum auriculatum (1,43%).

Las entradas estaban representadas por material elite correspondiente a los ecotipos Kenia, Sudafrica, Peru y Colombia, por material silvestre, semisilvestre, asilvestrado, domesticado, comercial y por las mal llamadas malezas. Las semillas y plantas de las colecciones originales provienen de todas partes del mundo: Colombia, Ecuador, Guatemala, India, Nepal, Reino Unido, Sudafrica, Kenia, Polonia, Portugal.

Para identificar las entradas se escogio un codigo que contenia el ano de recepcion de la accesion, la letra de la especie en mencion (por el predominio de la uchuva en la coleccion se escogio la u) y un numero consecutivo de la accesion: v.g. Accesion 09u255. Con todos los datos adquiridos se conformo la base en excel-2007 de trabajo de uchuva y taxas relacionados (en adelante BT) (Anexo 1).

5.2.2 Fusarium oxysporum:

Las cepas de F. oxysporum provienen del estudio realizado por Rodriguez, A., 2010, donde se caracterizaron hasta el nivel de especie 25 aislamientos obtenidos de plantas que mostraban los sintomas de infeccion por fusariosis de fincas productoras de uchuva de los departamentos de Cundinarmarca y Boyaca (Tabla 1). En total se visitaron 9 fincas, de las cuales en 7 se encontro el patogeno.

Debido a que en el suelo normalmente se encuentran formas no patogenicas de Fusarium (Gordon et al., 1997), el aislamiento se hizo a partir de la raiz, tallo y corona de plantas infectadas (Rodriguez, 2010). La identification se hizo por medio de la clave de Nelson et al., (1983), desde medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (Potato Dextrose Agar - PDA) y desde el medio especializado para Fusarium Agar Hoja de Clavel (Carnation Leaf Agar - CLA) (Anexo 2), tras la purification de los tejidos y la homogenization de las cepas con cultivos monosporicos (Anexo 3). A su vez se compararon con las claves de Gerlach y Nirenberg (1982); Singh et al. (1991); Mathur y Kongsdal (2003) y Leslie y Sumerell (2006).

Todos los aislamientos fueron identificados macro y microscopicamente como Fusarium oxysporum Schltdl. Cada uno de ellos fue corroborado molecularmente como F. oxysporum tras analizar la region espaciadora intergenica (IGS) del ADNr y una region del gen CO1 (Citocromo oxidasa 1). A su vez 3 aislamientos: DIA1, DIA3 y MAP5 (Figura 24), seleccionados con base en su grado de incidencia y severidad en campo, fueron comprobados a nivel de induction y reproduction de sintomas por postulados de Koch, y por alineamiento de secuencia de las regiones anteriormente mencionadas usando la herramienta CLUSTALW. Como resultado de este analisis, se obtuvo una identidad y cobertura del 100% y un valor E de 0,0 entre el aislamiento original obtenido en campo y el reaislado obtenido una vez realizada la inoculation en invernadero. Todas estas pruebas confirmaron que F. oxysporum es el patogeno responsable de la marchitez vascular en los campos de Cundinamarca y Boyaca.

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Figura 24. Dos cepas de Fusarium oxysporum caracterizadas en el proyecto y utilizadas para calibracion del inoculo. A. Anverso y reverso respectivamente de una colonia de la cepa MAP5. Fuente: Rodriguez, 2010. B. Anverso y reverso de la cepa DIA5. Fuente: Victor Pulido, 2010. Se observan caracteres como el color de la colonia, forma y color del micelio aereo y color difuminado en el agar.

5.3 METODOS

Para conocer cual(es) son la(s) accesiones de uchuva resistente(s) y/o tolerante(s) a Fusarium oxysporum se hizo necesario estandarizar 4 pasos (Figura 25.):

1. Establecimiento de una escala con la cual se mide la enfermedad
2. Determination de la concentration optima de inoculo
3. Selection de la cepa mas patogenica y/o agresiva de Fusarium oxysporum
4. Evaluation de resistencia y/o susceptibilidad de las accesiones de uchuva a la cepa mas patogenica de Fusarium oxysporum seleccionada y utilizada a la concentracion mas letal.

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Figura 25. Esquematizacion del proceso metodologico. Se hace notoria la necesidad de establecer primero la escala de severidad para evaluar los tres pasos restantes. Adviertase que se puede hallar primero tanto la cepa mas patogenica, como la concentracion mas optima, para evaluar la resistencia / susceptibilidad de las

accesiones. Fuente: Victor Pulido, 2010.

5.3.1 ESCALA DE SEVERIDAD:

El grado de severidad de la enfermedad fue estimado mediante la escala de la tabla 7, basada en las escalas propuestas por el CIAT (1987) para Phaseolus vulgaris L., la del Servicio Nacional para la Sanidad Agraria del Peru (SENASA), titulada: Escala diagramatica para evaluacion de severidad de Sclerotinia sclerntiorum y Thanatephorus cucumeris, modificadas para P. peruviana L., bajo los parametros de sintomatologia tipica de la fusariosis, la escala de Estupinan y Ossa, 2007 para Fusarium oxysporum sobre Physalis peruviana,

0. Resistente: ningun sintoma visible. = 0 % de dano.

1. Resistente: Lesiones pauperrimas en hojas; decoloracion exigua. < 5 % de dano.
2. Poco Susceptible a: Pocas lesiones aisladas en hojas; decoloracion al verde claro con sendas zonas verde oscuras. > 6 - <10 % de dano.
3. Poco Susceptible b: Lesiones escasas, marchitamiento en el borde de la hoja; hojas infectadas a baja intensidad color verde claro o un poco amarillo, perdida de turgencia. >11- < 20 % de dano.
4. Moderadamente susceptible a: Infeccion evidente en las hojas, decoloracion al amarillo palido, bordes de la hoja deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infeccion ligera a moderada en el tallo, clorosis. >21-< 40 % de dano.
5. Moderadamente susceptible b: Infeccion severa de las hojas, color amarillo ocre y sus tonalidades, hoja deshidratada hacia la nervadura central, bordes color cafe, “quemados”; postracion del pedicelo; perdida total de turgencia; Infeccion moderada en el tallo, color morada o violeta en la base, clorosis y/o necrosis. >41-< 60 % de dano.
6. Susceptible a: Lesiones severas en las hojas, “quemadura” total, marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliation prematura; postracion del tallo, mancha morada en la base de este. >61-< 70 % de dano.
7. Susceptible b: Hojas muertas o con 100% de marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliacion prematura, postracion aguda, mancha morada o violeta del tallo evidente. >71-< 80 % de dano.
8. Altamente Susceptible a: Hojas muertas, con una de ellas o sin ellas; marchitamiento, clorosis, necrosis y defoliacion aguda, tallo sin vigor. >81 -< 90 % de dano.
9. Altamente Susceptible b: planta muerta. >91 -< 100 % de dano.

Esta escala esta comprendida en 5 categorias, las cuales se describen a continuation y se resumen en la tabla 7:

0. Resistente: de ningun sintoma visible a lesiones escasas en hojas; decoloration escasa a moderada. 0-5% de dano.

1. Poco susceptible: de lesiones escasas en las hojas, marchitamiento, clorosis; a lesiones evidentes, decoloracion al amarillo palido, bordes de la hoja deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infection ligera a moderada en el tallo, clorosis. 6-20% de dano.
2. Moderadamente Susceptible: de infecciones evidentes en las hojas, decoloracion al amarillo palido, bordes de las hojas deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infeccion ligera a moderada en el tallo, clorosis; a infeccion severa de las hojas, color amarillo ocre y sus tonalidades, hoja deshidratada hacia la nervadura central, bordes color cafe, “quemados”; postracion del pedicelo; perdida total de turgencia; Infeccion moderada en el tallo, color morada o violeta en la base, clorosis y/o necrosis. 21-60% de dano.
3. Susceptible: de lesiones severas en las hojas, “quemadura” total, marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliation prematura; postracion del tallo, mancha morada en la base de este; a hojas muertas o con 100% de marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliacion prematura, postracion aguda, mancha morada o violeta del tallo evidente de dano. 61-80% de dano.
4. Altamente susceptibles: de hojas muertas o sin ellas; marchitamiento, clorosis, necrosis y defoliacion prematura, tallo sin vigor; a planta muerta. 81-100% de dano.

Tabla 7. Escala utilizada en el proyecto para determinar el grado de severidad de la enfermedad y de resistencia varietal. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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La escala fue ajustada de 0 a 9. Estos valores se resumieron en cuatro categorias (0 a 4), bajo los terminos basados en los trabajos de Hernandez et al., 2007, Araya y Araya, 2000 y Tovar et al, 2002.

5.3.2 CALIBRACION DEL INOCULO

Con el fin de determinar la respuesta de resistencia o susceptibilidad a los aislamientos de F. oxysporum sobre las 70 entradas de uchuva, se comenzo por estandarizar una prueba de patogenicidad utilizando un genotipo susceptible de uchuva, ya reportado (Figura 26), y la cepa de F. oxysporum MAP5 de comprobada capacidad patogenica (obtenida del proyecto "Busqueda de alternativas de control biologico de Fusarium oxysporum en el cultivo de uchuva Physalis peruviana") para de esta forma obtener un modelo que permitio evaluar la resistencia de las accesiones.

Dicha prueba, propuesta por Jimenez, P en el proyecto "Busqueda de alternativas de control biologico de Fusarium oxysporum en el cultivo de uchuva Physalis peruviana", consistio en la obtencion del inoculo en caldo papa dextrosa (Zuniga et al, 1997; Jimenez y Zitter, 2005) (Anexo 2, Figura 27), el cual posteriormente se ajusto a tres concentraciones diferentes: 1x103, 1x104 y 1x105 unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/mL) a partir del cultivo de la cepa MAP5 de F. oxysporum (Figura 27), usando la camara de Neubauer (Anexo 4).

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Figura 26. Genotipo susceptible de uchuva usado en la calibracion del inoculo. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Para cada una de las concentraciones se emplearon 10 plantas del genotipo susceptible. El experimento se realizo en condiciones de invernadero (18-25 °C de temperatura y 70-80% de humedad relativa) y consistio en extraer las 10 plantas de uchuva de la bolsa original, sumergir 9 de ellas durante 3 minutos en 500 mL de inoculo ajustado a una de las tres concentraciones, retornando las plantas luego a bolsas de 2 kg (Zuniga et al., 1997). Toda la operacion se efectuo igual con la planta testigo o control visual, cambiando la invivision del sistema radical de inoculo a agua pura. El procedimiento se repitio 2 veces para cada concentracion.

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Preparacion del medio Caldo Papa Dextrosa (CPD)

Dextrosa+Autoclavadq,

Figura 27. Medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (CPD). Para ver su preparacion, remitirse al anexo 2. Fuente:

Victor Pulido, 2010.

Durante 45 dias despues del primer sintoma de la enfermedad las plantas fueron monitoreadas usando la escala de 0 (ningun tipo de sintoma visible) a 9 (muerte de la planta). Se tuvo especial atencion al numero de dias que transcurrieron desde la inoculacion hasta el colapso de la planta y, una vez esta colapsaba, se re aislo el patogeno de individuos al azar para verificar los postulados de Koch. Para ello se hicieron cortes a nivel del cuello del tallo (Rodriguez, 2010), los cuales fueron lavados con sucesivos banos de hipoclorito de sodio al 1,5 % v/v, durante un minuto. Se colocaron 4 discos de tallo de cada en planta en medio PDA, los cuales fueron incubados durante 8 dias a 28C.

De esta manera se obtuvo la dilucion del patogeno con la cual se presenta el 100% de susceptibilidad de acuerdo a los sintomas ya establecidos y por lo tanto esta fue la concentracion de inoculo a la cual se evaluo las accesiones de uchuva y taxas relacionados.

Con base en la informacion obtenida de las evaluaciones con las tres concentraciones de inoculo (Anexo 5), se generaron graficas de incidencia y severidad de la enfermedad vs. concentracion de inoculo. Estas curvas fueron utilizadas para seleccionar graficamente la concentration mas adecuada para la evaluation y para determinar la concentration que induce la muerte del 50% y del 75% de los individuos (CL50 y CL75), asi como grafico de cajas de las concentraciones y su repetition empleando el programa estadistico MiniTAB 14.0. Se hicieron transformaciones a escala binaria de 0 y 1; y dos analisis de regresion logistica, uno considerando el dia de observation (DDO) y las concentraciones dentro del modelo, y el otro considerando solo las concentraciones independientemente para cada DDO.

5.3.3 CEPA MAS PATOGENICA de F. oxysporum:

La cepa mas patogenica se escogio durante la primera etapa del proyecto (Rodriguez, 2010), en atencion a los siguientes criterios:

1. Identidad exacta de la cepa como F. oxysporum a partir de identification microbiologica convencional y de tecnicas moleculares (amplification de regiones intergenicas ribosomales y conservadas del genoma de Fusarium) que permitieron su identificacion hasta nivel de especie de las regiones CO1 e IGS (Rodriguez, 2010).
2. Datos de incidencia de la enfermedad en campo.
3. Ensayos de patogenicidad sobre un genotipo susceptible de uchuva.

Se selecciono la cepa que cumpliera con estos 3 criterios, mostrando la mayor patogenicidad tanto en campo como en invernadero.

5.3.4 EVALUCION DE LAS ACCESIONES

5.3.4.1 Esterilizacion de las entradas:

Las 70 entradas fueron esterilizadas con multiples banos de Hipoclorito de sodio al 1% v/v durante 1minuto bajo camara de flujo laminar, haciendo enjuagues sucesivos con agua grado molecular. Las semillas por accesion esterilizadas superaron por vez las 50, retornandolas despues del lavado a sobres de papel plenamente identificados. Se cuido no mezclar material de distinto origen o entrada (Figura 28).

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Esteri izacion de semi as

Lavadosen NaCly agua, por 1 min

Figura 28. Diagrama de flujo en el proceso de esterilizacion de semillas. Fuente: Victor Pulido, 2010.

5.3.4.2 Germinacion:

Luego se sembraron las semillas en bandejas de germinacion de 72 alveolos, en sustrato de turba canadiense Kekule®-vermiculita 50/50% en invernadero (18 a 25 °C, 70 a 80% de humedad relativa) (Figura 29). Para maximizar el porcentaje de germinaciones exitosas se sembraron 3 semillas por alveolo, 12 alveolos por accesion, para un total de 36 semillas por accesion y 2.520 semillas por el experimento. Asi mismo se sembraron in vitro 10 plantas por accesion, para las 290 entradas de la coleccion, con un total de 2.900 plantas. Aquellas accesiones cuyas semillas no germinaron, o germinaron pocas para el experimento, se sembraron en camaras humedas mantenidas en condiciones de invernadero. Siete accesiones de escaso porcentaje de germinacion in vitro, con pocas semillas (menos de 10, en un caso 2), se clonaron, con seis clones para cada una, para un total de 42 clones. Posteriormente se endurecieron en camara humeda y en invernadero. Estas fueron la 09u005 (uchuva silvestrada), 09u135 (P. angulata), 09u149 (P. philadelphica), 09u215, 09u216, 09u217 (estas tres ultimas son los ecotipos Kenia, Colombia y Peru, respectivamente) y 09u274 (cultivar de NOVACAMPO). De estas se tomaron para la evaluacion los clones las accesiones 09u005, 09u215, 09u216 y 09u217 (Para los porcentajes de germinacion ver el Anexo 1).

Figura 29. Germinacion de las semillas. A: Vista de las bandejas de germinacion de las 70 entradas de uchuva y taxas afines. B: detalle de bandeja con plantas de un mes de edad. Estas plantas no estan listas para transplantar, pues no soportarian el procedimiento. C: observense algunas plantulas de las accesiones 09u199 y 09u201. Se puede apreciar la diferencia de germinacion. D: La mayoria de las accesiones de esta bandeja ya se transplantaron. Fuente: Victor Pulido, 2010.

5.3.4.3 Trasplante:

Esterilizacion del sustrato: Se preparo sustrato suelo- cascarilla de arroz en proporcion de 3 a 1, a partir de suelo de capote tamizado y cascarilla de arroz quemada. El sustrato fue empacado en bultos de 45 Kg y esterilizado a 121 °C, 15 psi, durante 30 minutos por ciclo, dos ciclos en total.

Una vez las semillas alcanzaron el tamano de transplante (Figura x), fueron pasadas a vasos plasticos de ± 255 g de capacidad (9 onzas= 255,145707 g) de sustrato suelo- cascarilla de arroz en proporcion de tres partes a uno. Se transplantaron 12 plantulas con minimo un par de nomofilos, de tamano muy similar (entre 5 a 7 cm de altura), cuyas edades oscilaban entre el mes y el mes y medio de vida (Figura 30), para cada una de las accesiones de uchuva. Para taxas relacionados todos, excepto Nicandra physalodes y Solanum auriculatum, tuvieron la mismas variables de seleccion de plantulas de edad, tamano y numero de hojas verdaderas. Para Nicandra physalodes la edad fue de dos a dos meses y medio de vida, con un tamano de seleccion igual al de la uchuva. En el caso Solanum auriculatum la edad fue de tres meses de vida, con un tamano de seleccion tambien igual al de la uchuva.

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Figura 30. Estado ideal para trasplante. En la fotografia se observan plantulas de mes y medio de vida, 5 cm de altura y 4 hojas verdaderas; todas de uchuva. Fuente: Victor Pulido, 2010.

5.3.4.4 Inoculacion:

5.3.4.4.1 Produccion de inoculo.

El inoculo se obtuvo probando dos tecnicas, la primera reportada por Padilla et al (1980) y la segunda reportada por Namiki et al (1994) (Figura 31). En la primera, se emplearon las tres cepas confirmadas taxonomicamente como Fusarium oxysporum; se hicieron crecer durante diez dias a 28C en medio PDA contenido en una caja petri de 10 cm de diametro y transcurrido este tiempo, se hizo un raspado del micelio aereo que posteriormente fue aforado a 500 ml de inoculo, ajustandolo a la concentration optima previamente determinada. Para la segunda tecnica, las mismas cepas fueron cultivadas en medio liquido

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CPD (Caldo Papa Dextrosa) (Anexo 2, Figura 27) durante 10 dias a 28C en Shaker en agitacion constante a 140 rpm. Al cabo de los 10 dias, tras inspeccionar el crecimiento en el medio liguido se verifico la pureza del medio en camara de Neubauer. Posteriormente los cultivos fueron filtrados a traves de gasa esteril y centrifugados en tubos tipo falcon de 50 ml durante 10 minutos a 2000 g; el pellet de propagulos fue resuspendido en agua esteril y llevado nuevamente a la concentration optima al volumen mencionado. Todos los calculos de las alicuotas para ajustar las concentraciones se hicieron a partir de conteo en camara de Neubauer. Finalmente se opto por la segunda tecnica.

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Figura 31. Comparacion de los pasos basicos de las dos metodologias ensayadas para, inicialmente, definir la forma de obtener el inoculo en masa. Fuente. Rodriguez, 2010.

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5.3.4.4.2 Inoculation de plantas de uchuva:

Basada en la tecnica “dip root inmertion” segun Namiki et al (1994), consistio en sumergir el sistema radicular de 11 plantulas de cada accesion en 500 mL del inoculo previamente obtenido, durante 3 minutos (Anexo 6). Cada una de las plantas fue extraida de su vaso, retirado el sustrato y sumergida en agua para eliminar cualquier residuo solido. Enseguida fueron sumergidas los 3 min. en el inoculo y retornadas al mismo vaso con el mismo sustrato de cada planta, tal como se muestra en la Figura 32.

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Figura 32. Proceso de inoculacion: 1: obtencion de propagulos en masa. 2 y 3: verificacion del crecimiento fungico puro, calibracon de la alicuota de propagulos para ajustar la concentration. 4 y 5: alicuota de propagulos y aforado de la solution de inoculo. 6, 7 y 8: Extraction de la planta y su sistema radicular sin dano. 9: lavado de la raiz. 10: dip root inmertion durante 3 min. 11 y 12: retorno de la plantula a su vaso con el sustrato original.

Fuente: Victor Pulido, 2010.

Para acelerar el procedimiento, se inocularon las 11 plantulas de cada accesion al tiempo (Figura 33).

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Figura 33. Plantulas con el sistema radicular sumergido en el inoculo. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Luego fueron distribuidas en dos hileras por accesion, evaluando el mayor numero de accesiones tecnicamente posible en cada ocasion (Figura 34).

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Figura 34. Distribucion en hileras de las accesiones. A: accesiones de la ultima ronda de inoculacion. B: accesiones de la primera ronda de inoculacion. C: vista superior de una accesion de P. philadelphica y de P. peruviana de la misma edad. D: vista frontal de una accesion de uchuva. Se marco cada individuo para evitar errores en la evaluacion. Fuente: Victor Pulido, 2010.

5.3.4.5 Evaluacion:

Se efectuo durante 45 dias despues del primer sintoma, de una a dos semanas despues de la inoculacion, de dos a dos meses y medio despues del trasplante a vaso y, mas o menos, a los 4 meses de haber sido sembradas las semillas, todo lo anterior segun el tiempo de crecimiento de la especie, cuando las plantulas superaron el estado critico para su supervivencia (Agrios, 2008). Se hizo sobre individuos que poseian, por lo menos, dos pares de hojas verdaderas o nomofilos, ostentando regularmente seis (Figura 35).

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Figura 35. Plantula en el estado ideal para su evaluacion. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Consistio en el registro del grado de severidad de la enfermedad de cada una de las plantas de cada una de las accesiones que componen la coleccion del experimento (las 70 entradas), consignadas diariamente, a la misma hora, durante los 45 dias de evaluacion. Estos registros fueron recopilados en un documento excel 2007, conformando la base de evaluacion de las accesiones.

5.3.4.5.1 Analisis estadistico:

De las accesiones: Se hizo un analisis de conglomerados a partir de un analisis de componentes principales bajo el procedimiento Princomp de SAS 9.1.3, con el fin de eliminar la information redundante de los datos. Se escogio el primer componente principal del la salida de Princomp de SAS. A partir de este, se hiso el analisis de conglomerados utilizando el algoritmo de Ward, mediante el procedimiento Cluster de SAS 9.1.3.

Se tomaron como variables informativas la incidencia de la enfermedad y la severidad. Por incidencia se entendio el porcentaje de plantas muertas o con un valor de 9 (escala de severidad), obtenido a partir del numero de plantas muertas sobre el numero de plantas inoculadas. Por severidad se entendio la frecuencia de cada uno de los datos de la escala de severidad, de cada una de las plantas, tomando la moda de cada accesion.

Se realizo una regresion logistica con escala binaria de 0 y 1, donde: 0= x<4 (incluye los valores 0, 1,2 y 3) y 1= x>3 (incluye los valores 4, 5, 6, 7, 8 y 9) (Tabla 8), El valor de x esta comprendido entre 0 y 9 de la escala de severidad, siendo un valor discreto. Los valores de 0 corresponden a la categoria de Resistentes; los valores de 1 corresponden a No resistentes o Susceptibles de dicha escala (Tabla 8).

Tabla 8. Transformation a escala binaria de la escala de severidad. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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6. RESULTADOS

6.1 ESCALA DE SEVERIDAD:

Se obtuvieron 1.800 registros fotograficos del experimento, con los cuales se conformo una escala diagramatica cuyas ilustraciones corresponden a la sintomatologia de la enfermedad de marchitez vascular causada por F. oxysporum sobre plantas y plantulas de uchuva y taxas afines mantenidas en condiciones de invernadero. Las condiciones de invernadero fueron de 20<C± 213 y 14 al 30% de humedad relativa .

Categoria 0. Resistente

De ningun sintoma visible a lesiones escasas en hojas; decoloracion escasa a moderada. 0-5% de dano (Figura 36).

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Figura 36. Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva resistente. Fuente: Victor Pulido, 2010.

0. Resistente a: ningun sintoma visible. = 0 % de dano.

1. Resistente b: lesiones pauperrimas en hojas; decoloracion exigua. < 5 % de dano en la hoja.

Categoria 1. Poco susceptible

De lesiones escasas en las hojas, marchitamiento, clorosis; a lesiones evidentes, decoloracion al amarillo palido, bordes de la hoja deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infeccion ligera a moderada en el tallo, clorosis. 6-20% de dano (Figura 37).

Figura 37. Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva poco susceptible. Fuente: Victor Pulido, 2010

2. Poco Susceptible a: Pocas lesiones aisladas en hojas; decoloracion al verde claro con sendas zonas verde oscuras. > 6 - <10 % de dano.

3. Poco Susceptible b: Lesiones escasas, marchitamiento en el borde de la hoja; hojas infectadas a baja intensidad color verde claro o un poco amarillo, perdida de turgencia. >11- < 20 % de dano.

Categoria 2. Moderadamente Susceptible

De infecciones evidentes en las hojas, decoloracion al amarillo palido, bordes de las hojas deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infeccion ligera a moderada en el tallo, clorosis; a infeccion severa de las hojas, color amarillo ocre y sus tonalidades, hoja deshidratada hacia la nervadura central, bordes color cafe, “quemados”; postracion del pedicelo; perdida total de turgencia; Infeccion moderada en el tallo, color morada o violeta en la base, clorosis y/o necrosis. 21-60% de dano (Figura 38).

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Figura 38. Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva moderadamente susceptible.

Fuente: Victor Pulido, 2010

4. Moderadamente susceptible a: Infeccion evidente en las hojas, decoloracion al amarillo palido, bordes de la hoja deshidratados, color cafe, “quemados”, sin o con poca turgencia; Infeccion ligera a moderada en el tallo, clorosis. >21-< 40 % de dano.

5. Moderadamente susceptible b: Infeccion severa de las hojas, color amarillo ocre y sus tonalidades, hoja deshidratada hacia la nervadura central, bordes color cafe, “quemados”; postracion del pedicelo; perdida total de turgencia; Infeccion moderada en el tallo, color morada o violeta en la base, clorosis y/o necrosis. >41-< 60 % de dano.

Categoria 3. Susceptible

De lesiones severas en las hojas, “quemadura” total, marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliation prematura; postracion del tallo, mancha morada en la base de este; a hojas muertas o con 100% de marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliacion prematura, postracion aguda, mancha morada o violeta del tallo. 61-80% de dano (Figura 39).

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Figura 39. Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva susceptible. Fuente: Victor Pulido, 2010

6. Susceptible a: Lesiones severas en las hojas, “quemadura” total, marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliacion prematura; postracion del tallo, mancha morada en la base de este. >61-< 70 % de dano.

7. Susceptible b: Hojas muertas o con 100% de marchitamiento, clorosis, necrosis y/o defoliacion prematura, postracion aguda, mancha morada o violeta del tallo evidente. >71-< 80 % de dano.

Categoria 4. Altamente susceptibles

De hojas muertas o sin ellas; marchitamiento, clorosis, necrosis y defoliacion prematura, tallo sin vigor; a planta muerta. 81-100% de dano (Figura 40).

Figura 40. Planta y hojas representativas del estado de la planta de uchuva altamente susceptible. Fuente:

Victor Pulido, 2010

8. Altamente Susceptible a: Hojas muertas, con una de ellas o sin ellas; marchitamiento, clorosis, necrosis y defoliation aguda, tallo sin vigor. >81 -< 90 % de dano.

9. Altamente Susceptible b: planta muerta. >91 -< 100 % de dano.

Las fotografias anteriores corresponden a los sintomas obtenidos durante la fase de calibration del inoculo, donde se estandarizo la escala. Para las plantulas de las accesiones, la escala diagramatica en hojas contiene los mismos parametros, con una sintomatologia que se manifiesta mas rapidamente (Figura 41):

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Figura 41. Escala diagramatica en hojas de las plantulas de uchuva. No se muestra el estado o grado 9. Este se obvia porque plantulas de tal estado no tienen hojas. Fuente: Victor Pulido, 2010.

El estado general de la plantula es muy similar al de las plantas adultas, caracterizandose por presentar una etiologla igual para casi todos los grados de severidad de la enfermedad (Figuras 42, 43, 44 y 45); no obstante, en 8 las plantas permanecen erectas, a diferencia de las plantas adultas que se postraban, sobreviviendo con una hoja (Figura 42 y 45), y en 9 las plantulas casi siempre no tienen hojas, siendo un fuste muerto.

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Figura 42. Plantula en grado 8. Sobrevive con una sola hoja. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 43. Escala diagramatica de las plantulas de uchuva. Las plantulas corresponden a distintas accesiones. En primer plano se observa la clorosis progresiva de la hoja de uchuva, con la concomitante perdida de turgencia

de la planta en general. Fuente. Victor Pulido, 2010.

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Figura 44. Escala diagramatica de las plantulas de uchuva. Las plantulas corresponden a distintas accesiones. En primer plano se observa la clorosis progresiva de la hoja de uchuva hasta alcanzar una necrosis total y epinastia; la perdida de turgencia se hace mas evidente. Fuente. Victor Pulido, 2010.

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Figura 45. Escala diagramatica de las plantulas de uchuva. Las plantulas corresponden a distintas accesiones. En primer plano se observa perdida de turgencia, postracion y muerte del tallo y la planta en general. Notese que en 8 la plantula solo tiene una hoja terminal verde y que la postracion sucede en 9. Fuente. Victor Pulido,

2010.

Durante la observacion y seguimiento de sintomas se presento un caso particular una vez terminado los 45 dias, lo que conllevo a una ambiguedad del estado 9, en el cual una aparente plantula muerta o 9 retono de subito (Figuras 46 y 47).

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Figura 46. Aparente plantula muerta que retono al cabo de una semana y media. El tejido meristematico activo del tallo produjo crecimiento foliar incluso cuando el tallo se necroso en la parte axial. Fuente. Victor Pulido, 2010.

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Figura 47. Plantula que retono al cabo de una semana de haber sido dada por muerta. Fuente. Victor Pulido, 2010.

Se observo que, aun cuando el tallo estaba severamente afectado, la planta retonaba

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(Figura 48):

Figura 48. Plantula de 3 meses de edad con el tallo necrosado en la parte central. Este tallo presento pudricion del tejido parenquimatoso adjunto a los haces vasculares. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Internamente se observo obliteracion y oclusion de la raiz principal y de muchas de las secundarias (Figura 49), disminucion del sistema radicular hasta tener bajas densidades y/o poca fibrosidad (Figura 50), crecimiento de las raices laterales por encima de las ramificaciones (Figura 49 y 51), raices adventicias (Figura 49), raices excesivamente alongadas, asi como raices atrofiadas (Figura 50).

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Figura 49. Planta sobreviviente en la que se encontro la ralz principal obstruida y obliterada. A: Estado general. B: sitio de separacion. C: Crecimiento de ralces laterales, aun por encima del margen de la ramita (flecha).

Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 50. Planta sobreviviente en la que se encontro una aguda disminucion de las ralces laterales. A: notese la rama muerta y las pocas ralces que acompanan la ralz principal. B: ralz principal (flecha). Aunque esta presente no es vigorosa como se observa en la figura 2. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 51. Planta sobreviviente en la que se observo fuertes ralces secundarias a cambio de la inexistente ralz pivotante. Fuente: Victor Pulido, 2010.

6.2 CALIBRACION DEL INOCULO:

Se registraron 2700 datos, 2430 de ellos informativos (Anexo 5). Se encontro que la concentracion de 10.000 ufc/mL es la mas letal, siendo la concentracion optima para evaluar las accesiones. Se hizo un analisis de medias usando MiniTAb 14.0, donde no se evidencio una diferencia marcada en las medias (Tabla 9). No obstante, al realizar el grafico de cajas se observa que 104 presenta el grupo graficamente mas homogeneo, donde la variable respuesta es mas proxima a 9 (Figura 52).

Tabla 9. Analisis de medias de los 45 dias de evaluacion de las concentraciones. Las medias no son muy distantes entre si. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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El analisis de boxplot y el analisis de medias no fueron satisfactorios para determinar la concentracion letal o la mas optima. Por ello se recurrio a usar las curvas de severidad como criterio de seleccion (Figuras 53, 54, 55 y 56).

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Figura 52. Grafico de cajas (boxplot) de las concentraciones (Tratamientos). Aunque se observa que 104 es el grupo mas homogeneo, as! como el mas cercano a 9, no es suficiente para designarlo como la concentracion mas letal, consistiendo por ende en un mero indicio.

6.2.1

Analisis grafico: Para realizar las comparaciones se uso el promedio de severidad de sintomas de la enfermedad obtenido durante los 45 dias de evaluacion (Cadena et al., 2003) (Figuras 53, 54 y 55), y las graficas de incidencia de la enfermedad.

Figura 53. Graficos de severidad de 1.000 ufc/mL. No se alcanza la meseta, en promedio, de plantas muertas o

9. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Figura 54. Graficos de severidad de 10.000 ufc/mL. Se alcanza la meseta, en promedio, de plantas muertas o 9, exactamente a los 24 dias del primer sintoma de la enfermedad. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 55. Graficos de severidad de 100.000 ufc/mL. No se alcanza la meseta, en promedio, de plantas muertas

o 9. Fuente: V^ctor Pulido, 2010.

Solo la concentracion de 10.000 ufc/mL alcanzo, en promedio, el grado de severidad de 9 (Figura 56), siendo por este analisis la unica letal para el 100% de las plantas (Figura 57). Esto sucedio a los 24 dias de evaluacion en ambos casos. Cabe resaltar que en todas las concentraciones, incluidas las replicas, a los 24 dias se alcanzo un pico importante de dano de la enfermedad; no obstante, el dia en que la primera planta colapso vario ampliamente en todas las concentraciones, encontrandose entre los 9 y 25 dias del primer sintoma visible (Figuras 58, 59 y 60).

Figura 56. Comparacion grafica de las concentraciones con base en la severidad. 10.000 ufc/mL de F. oxsyporum es la concentracion letal para la uchuva. Fuente: Victor Pulido, 2010.

El porcentaje de plantas muertas por concentracion corroboro estos datos, asi:

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Figura 57. Comparacion grafica de las concentraciones con base en la incidencia. Nuevamente se observa que 10.000 ufc/mL de F. oxsyporum es la concentracion letal para la uchuva, siendo la unica donde el 100% de las

palntas murieron. Fuente: Victor Pulido, 2010.

El analisis grafico por dia (Figuras 58, 59 y 60) mostro la misma tendencia que las figuras 53, 54 y 55.

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Figura 58. Incidencia de la enfermedad en 1.000 ufc/mL. En la replica no murio ninguna planta. Fuente: Victor

Pulido, 2010.

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Figura 59. Incidencia de la enfermedad en 10.000 ufc/mL. Todas las plantas inoculadas murieron el dia 25 de evaluacion. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 60. Incidencia de la enfermedad en 100.000 ufc/mL. No murio ninguna planta, aunque si tuvieron sintomas agudos de la enfermedad. Fuente: Victor Pulido, 2010.

6.2.2 Regresion Logistica:

Se analizaron los 2430 datos informativos. Se tomo la probabilidad acumulada del evento- sintoma 1 para cada una de las observaciones de las concentraciones. Se considero a cada concentration y su repetition como un solo tratamiento. Las probabilidades de ocurrencia del evento fueron iguales para cada una de las 18 observaciones por dia de cada tratamiento, esto sin considerar el control visual. Para abreviar la tabla de resultados se toman las probabilidades acumuladas de cada 5 dias de observation. La regresion logistica empleada fue de tipo dicotomica o binomial puntual (Silva, 1995), pues los resultados dependieron solo de un ensayo, tomandose el evento 1 de resistencia o susceptibilidad como referente o variable dependiente. Casi siempre se toma al evento 0 como variable dependiente (Silva, 1995), no obstante, se opto por 1 para restringir aun mas la notion de resistencia, agregando robustez a los resultados. Esto tambien aplico para el caso de las accesiones.

DDO y Concentraciones: Considero el dia de observation (DDO) y las concentraciones dentro del modelo, es decir, la probabilidad que se de el evento o sintoma 1 (No resistencia o susceptibilidad) para cada concentration en cada dia. Este modelo fue satisfactorio (Tabla 10), siendo el efecto de probabilidad dependiente del dia (Tabla 11). Las probabilidades segun la concentracion y el dia se enlistan en la tabla 12. El analisis cumplio con los supuestos estadisticos (Tabla 10).

Tabla 10. Estadisticos del modelo DDO y concentraciones. Fuente: S.A.S. 9.1.3. Primcomp.

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Tabla 11. Regresion logistica del modelo DDO y concentraciones.

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Tabla 12. Probabilidades en relacion al dia de observacion (DDO) y a la concentracion de inoculacion.

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DDO: Considera solo las concentraciones independientemente para cada DDO, es decir, la probabilidad que se de el evento o sintoma 1 (No resistencia o susceptibilidad) en cada dia, segun las concentraciones (Tabla 13). El modelo fue satisfactorio hasta el dia 35. Desde el dia 36 al 45 no se pudo realizar el analisis de maxima probabilidad estimada, pues esta parecia estadisticamente no existir.

Tabla 13. Probabilidad del sintoma en las concentraciones segun el dia. Fuente: S.A.S. 9.1.3

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6.2.3 Comprobacion de los postulado de Koch:

Se escogieron dos plantas colapsadas de cada concentration para comprobar los postulados de koch. Se corroboro por caracteristicas macroscopicas coloniales a F. oxysporum como patogeno presente en todas las plantas muertas. Dichas caracteristicas fueron las mismas observadas en la cepa MAP5 (v.g.: color difuminado en el agar) (Figura 61). Solo una muestra se contamino con presencia bacterial.

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Figura 61. Ejemplo de re aislamiento del patogeno. A: anverso de uno de los re aislamientos de plantas colapsadas. B: reverso del re aislamiento. No se observa contaminacion. Fuente: Victor Pulido, 2010.

6.3 EVALUACION DE LAS ACCESIONES

6.3.1 Analisis de severidad: se seleccionaron 70 entradas de uchuva provenientes de diferentes universidades y centros de investigacion, que se listan en la tabla 6. La resistencia / susceptibilidad fue evaluada teniendo en cuenta el promedio de los datos de severidad de cada accesion obtenido diariamente y el promedio del ultimo dia de evaluacion. Se lista este ultimo por ser el dato mas relevante en cuanto a supervivencia de la planta (Tabla 14). Cabe aclarar que la accesion 09u047, segun los datos de la escala de severidad es poco susceptible (P.S), se observo en realidad un comportamiento y una etiologia de la enfermedad poco severa sobre la planta (Figura 62). Por ello se considero a la accesion como resistente.

Tabla 14. Resultado de evaluacion de las accesiones utilizadas durante este estudio. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Categorias de evaluacion: S: susceptible; A.S: altamente susceptible; M.S: moderadamente susceptible; P.S: poco susceptible; R: resistente.

Origen de las accesiones: N.S: Norte de Santander; B: Boyaca; C: Cundinamarca; N: Narino. U.S.D.A.: Departamento de agricultura de los Estados Unidos. U.K.: Reino Unido; J.B.: Jardin Botanico. Las accesiones que provienen de Narino y Antioquia, son todas de las universidades homonimas al departamento. Las accesiones de Boyaca, Caldas, N.S., Cundinamarca y Cauca son en su gran mayorla de la coleccion original Corpoica. Fuente: Corpoica, 2009. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Figura 62. Accesion 09u047. Esta accesion fue escogida como resistente con base en su vigor, mostrado durante todo el experimento, y a su poca susceptibilidad. Fue la unica accesion que, aunque tuvo epinastia y defoliacion, no manifesto ningun otro sintoma y crecio mucho mas que las demas. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Se registraron 36.584 datos, 30.691 de ellos informativos (Anexo 7). Se encontraron 3 accesiones resistentes (4,28%) (Figura 63, Tabla 15) y 67 susceptibles (95,71%) (Tabla 14, Anexo 1, Figura 64). De estas, 39 fueron altamente susceptibles (55,71%), 15 susceptibles (21,43%), 8 moderadamente susceptibles (11,43%) y 5 poco susceptibles (7,14%).

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Figura 63. Accesiones resistentes al cabo de mas de 45 dias de evaluacion. A y B: 09u178- S. auriculatum; C y D: 09u139- P. floridana; E y F: 09u279- P. peruviana. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Figura 64. Ejemplo de algunas accesiones susceptibles. A y B: Altamente susceptibles: 09u171, 09u237, respectivamente. C y D: susceptible: 09u128. E y F: moderadamente susceptibles: 09u138, 09u078 respectivamente. G y H: poco susceptible: 09u173.

Tabla 15. Resumen de la evaluacion de las accesiones. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Se obtuvieron 63 individuos sobrevivientes (9,24%; Tabla 16) al cabo de 7 meses de la primera evaluacion y 2 semanas de la ultima; de 682 plantas evaluadas. Los individuos correspondieron tanto a accesiones resistentes como de las otras 4 categorias. Unicamente se considera como individuos resistentes a los pertenecientes a las accesiones resistentes (excepto la 09u047, la cual es poco susceptible), pues estos mostraron una resistencia desde el primer dia hasta el ultimo de evaluacion, al contrario de individuos que estuvieron a punto de morir, retonaron y finalmente sobrevivieron. Estos fueron:

Tabla 16. Individuos sobrevivientes (Julio del 2010).

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El termino antes del guion es la accesion; el termino despues del guion es el numero de la planta. Fuente: Victor Pulido, 2010.

En total se registraron 18 individuos resistentes (Tabla 16, individuos de las accesiones resistentes). Tanto los individuos sobrevivientes como los resistentes fueron trasplantados de vaso a bolsas de 5 Kg de capacidad, con sustrato suelo, previamente solarizado durante 60 dias (Figura 65). Los individuos sobrevivientes son tolerantes a la enfermedad, en mayor o menor grado.

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Figura 65. Plantas sobrevivientes y resistentes en bolsas de 5 kg de capacidad. Plantas resistentes de S. auriculatum al cabo de 3 meses de finalizada la evaluacion. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Para conservar el germoplasma de los individuos resistentes se hicieron multiplicaciones in vitro. No obstante, casi todos los pases in vitro de las accesiones resistentes tuvieron problemas de contaminacion, pues aun el patogeno se encuentra presente en estas plantas, manifestando smtomas a los 10 meses de finalizada la evaluacion de la accesion (Figura 66).

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Figura 66. Ejemplo de plantas resistentes y sobrevivientes. A: Planta resistente numero dos de la accesion 09u139, N. physalodes. Esta fue una de las plantas de donde se tomaron esquejes. B: Planta tolerante numero dos de la accesion 09u140, P. peruviana. La flecha blanca indica las hojas cloroticas. C: Planta tolerante numero dos de la accesion 09u210, P. peruviana. La flecha amarilla indica el lugar donde se necroso el tallo, ampliado en D. Este podrla ser un tipo de respuesta hipersensible.

Por esto se procedio a realizar esquejes de tales individuos. Estos esquejes son conservados en invernadero a 20°C± 2°C, 30 a 80 % H r (Figura 67).

6.3.2 Analisis de conglomerados:

Segun este analisis, la incidencia de la enfermedad (mortalidad) fue, para cada accesion, asi:

Tabla 17. Incidencia segun el procedimiento Primcomp de SAS 9.1.3.Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Se elimino la information redundante con la selection del primer componente principal, usando el algoritmo de Ward para crear un analisis de cluster. Se escogio un cluster de 6 grupos, con un sprsq (semi partial r squared) de 0,0004 y un rsq (r-aquared) de 0,999 (Tabla 18, Figura 68).

Tabla 18. Estadisticos de conformation de los clusteres a partir de los datos de incidencia y severidad.

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Figura 68. Dendograma de las accesiones. Los caracteres del estado son la escala binaria, la incidencia y la severidad. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Cluster 1: 09u012 ,09u021, 09u022, 09u143, 09u114, 09u031, 09u056, 09u089, 09u093, 09u099, 09u108, 09u110, 09u116, 09u118, 09u132, 09u136, 09u141, 09u149, 09u150, 09u151, 09u153, 09u157, 09u166, 09u167, 09u171, 09u199, 09u202, 09u237, 09u261, 09u276, 09u278, 09u280, 09u282, 09u283, 09u289 (Figura 69).

Cluster 2: 09u047, 09u063, 09u071, 09u078, 09u139, 09u173, 09u176, 09u178, 09u279 (Figura 69).

Cluster 3: 09u045, 09u086, 09u128, 09u140, 09u148, 09u201, 09u210, 09u213, 09u218, 09u277, 09u281, 09u290 (Figura 69).

Cluster 4: 09u215, 09u134, 09u135, 09u249, 09u254, 09u275, 09u288 (Figura 69). Cluster 5: 09u124, 09u138, 09u216, 09u227, 09u274 (Figura 69).

Cluster 6: 09u005, 09u217 (Figura 69).

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Figura 69. Identificacion de los clusteres dentro del Dendograma. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Se tomo como resistente solo a aquellas accesiones que tuvieran una mortalidad de 0,000, y una moda del sintoma o severidad de 0 (09u139, 09u178 y 09u279) o 1 (09u047).

6.3.3 Regresion logistica:

Se analizaron 30691 datos de 682 plantas, con una moda de 495 datos por accesion (tabla 19).

Tabla 19. Estimados estadisticos de la regresion logistica de las accesiones. Corresponden al DDI (dia despues de la inoculacion, contado a partir del primer sintoma visible) dependiente de cada accesion entendida como un tratamiento. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Resistentes (R): 0= x<4 (incluye los valores 0, 1, 2 y 3); Susceptibles (S): 1= x>3 (incluye los valores 4, 5, 6, 7,

8 y 9); E: evaluacion. La evaluacion se hizo a partir de la probabilidad del dia 45

7. DISCUSION

7.1 Escala de severidad:

La escala establecida en este estudio fue fruto del esfuerzo de eliminar el componente subjetivo en la formulacion de una escala a traves de dos estrategias:

1. Consulta de la etiologia de la enfermedad producida por F. oxysporum reportada para Physalis peruviana y para taxas afines, tales como el tomate y el frfjol; asi mismo se busco contrastar con la etiologia de especies alejadas, como fueron palmas y musaceas.

2. Consulta de las escalas propuestas para esas enfermedades.

La primera estrategia responde a la variabilidad patologica del patogeno, pues es bien sabido que la coevolucion de este hongo con cada una de las mas de 200 plantas que parasita, ubicadas en familias distintas, ha creado casos de extrema especificidad.

La segunda estrategia responde a la necesidad de establecer una escala para el caso exacto de la infeccion de F. oxysporum en uchuva en invernadero, cuyos grados y categorias se ajustasen lo mas real posible a cada uno de los estadios de la enfermedad, para con ello, no solo agregar rigor cientffico a la labor de identification de la enfermedad por sus smtomas externos, sino a la cuantificacion de la severidad de la misma de una forma clara y sencilla. Atendiendo a ambos preceptos de claridad y sencillez se opto por utilizar fotografias como elementos de cotejo.

Etiologia de la enfermedad:

Los smtomas presentes en diferentes hospederos de familias distintas tienen tantos factores en comun como disimilitudes.

Los marchitamientos vasculares, sin considerar el tipo de patogeno que los ocasione, tienen ciertas caracteristicas en comun: las hojas de plantas infectadas o de partes de plantas infectadas pierden su turgencia, se debilitan, adquieren una tonalidad que va del verde claro al amarillo verdoso, decaen y finalmente se marchitan, se tornan amarillas, empardasen y mueren. Las hojas pueden estar extendida o bien enrolladas (Estupinan y Ossa, 2007). Los retonos y plantas jovenes tambien se marchitan y mueren; los cortes transversales que se hacen de tallos y ramitas infectados muestran varias zonas cafes decoloradas. En los vasos xilemicos de tallos, raices y otros organos infectados, puede haber micelio y esporas del hongo. Algunos de los vasos xilemicos son obstruidos por el micelio, las esporas o bien los polisacaridos que produce el hongo (Barrera et al., 1995). Para el caso particular de la fusariosis vascular causada por F. oxysporum son la epinastia, el retraso del crecimiento, el amarillamiento y marchitez progresiva de las hojas y del tallo, llevando con frecuencia a la muerte de la planta (Di Pietro, 2004).

Internamente se destaca por la necrosis de los haces vasculares, caracterizada por coloraciones cafes, purpuras o violetas (Leslie y Summerell, 2006).

No obstante, v.g. en palmas no se producen sintomas externos a nivel del tallo, estando la sintomatologia supeditada a la clorosis de las hojas basales, sin un patron definido y constante de necrosamiento (Garofalo y Macmillan, 2005), aunque la clorosis es lateral y puede, en ciertos casos, ser seguida hasta el raquis de la hoja (Garofalo y Macmillan, 2005; Elliott y Des Jardin, 2010).

Asi, cuando la marchitez afecta a plantas lenosas no produce plantas marchitas y encorvadas sino mas bien hojas secas, muerte regresiva de ramas o el tallo completo. La marchitez en Phoenix canariensis es de este tipo y los sintomas son similares a los de la marchitez de la mimosa Albizia julibrissin y de la marchitez del waxmirtle, Myrica cerifera, de las palmas Syagrus romanzoffiana y de Washingtonia robusta (Garofalo y Macmillan, 2005; Elliott y Des Jardin, 2010), diferenciandose de otras marchiteces vasculares, sobre todo de plantas herbaceas.

De tal forma, la sintomatologia asociada a la enfermedad puede ser poco clara, sobre todo cuando se toman sintomas de especies alejadas, catalogando como marchitamiento por F. oxysporum a enfermedades que no lo son. Tal fue el caso de la palma de aceite colombiana, que en el ano 2000 presento perdidas por 5 mil millones de pesos por una enfermedad que inicialmente fue designada al patogeno F. oxysporum por su etiologia, pero que luego se desecho de facto al encontrar a Thielaviopsis paradoxa en todas las plantas enfermas y no a F. oxysporum (Cenipalma, 2002). En Uganda se presento un caso similar en banano, el cual no se pudo asignar a ninguna causa, siendo el principal sospechoso F. oxysporum, aunque pruebas lo vincularon mas con un fitoplasma (Kangire y Rutherford, 2001).

En especies de la misma familia, como el tomate, las diferencias en la etiologia son menores, e incluso muy parecidas a las encontradas en nuestro estudio (patosistema uchuva-Fusarium) dentro de las que se destacan los siguientes sintomas de marchitez: la epinastia de los peciolos, la clorosis de las hojas basales hacia el apice, con un descoloramiento, perdida de turgencia y decaimiento unilateral (Estupinan y Ossa, 2007; Randhawa, 2005; Ascencio et al., 2008iCarrillo et al., 2003). Hay pudricion cortical del tallo de color cafe, al nivel del suelo; a menudo no se ve hasta que la corteza del tallo es desprendida. En el tallo la coloracion es rojiza, extendiendose hacia arriba del cuello de 5 a 10 cm y usualmente a no mas de 30 cm, tambien se presentan pudriciones severas o la perdida de la raiz primaria, y numerosas lesiones cafe- grisaceas en el punto de emergencia de las raices laterales, asi como la proliferation de raices adventicias por encima de la lesion del tallo (Jarvis y Shoemaker, 1978, citados por Cubedo, 2008), se observa ademas un amarillamiento a lo largo de los margenes de las hojas mas viejas. Este amarillamiento es seguido por la necrosis y el colapso del peciolo de la hoja (Jones, 1991). El tejido vascular se vuelve pardo oscuro, aunque la medula permanece sana, las bases de los tallos afectados se alargan y las plantas mueren frecuentemente (Beckman, 1987) Otra especie referente es el frijol, en el cual no solo se ha establecido una sintomatologia parecida, sino que ha sido usado como modelo de escala de severidad para uchuva. Por ejemplo, Estupinan y Ossa en el 2007 toman la escala propuesta por el CIAT (1987) para Phaseolus vulgaris y la aplican a la uchuva sin considerar argumentos como los antes expuestos, accion que si se tomo en este estudio. Por ello no reportan sintomas a nivel de raices o tallo. Ademas, usando aislamientos de varias especies, buscaron determinar la especificidad de un aislamiento que llamaron Fusarium oxysporum f.sp. uchuva, importante para buscar especificidad de huesped, sin embargo no realizaron , entre otras pruebas, compatibilidad vegetativa o analisis de secuencias de regiones especificas del genoma, basandose, para ese caso, solo en los resultados de susceptibilidad de la cepa en distintos hospederos.

El hecho radica en que, aunque autores reconocidos en el area fitopatologica estipulen sintomatologias parecidas de la misma enfermedad en especies diferentes (como el caso de Agrios en 1985 y ediciones posteriores, hasta el 2008, para la marchitez vascular de F. oxysporum), la complejidad de un patogeno como este, que exhibe alrededor de 120 formas especiales, producto de una marcada coevolucion, no puede ser desconocida en aras de la generalization. Bien se sabe que este hongo interactua diferente segun la especie hospedera e, inclusive, que su ciclo de vida y modo de infection responden a condiciones ambientales tales como temperatura y humedad relativa.

Esto se debe a que las enfermedades en plantas precisan de los tres elementos esenciales para su aparicion y desarrollo: Hospedero, patogeno y condiciones ambientales; todas supeditadas al tiempo (Agrios, 2008). Cuando la patogenicidad del patogeno es afectada directamente por la virulencia del patotipo se producen, incluso, cambios en la etiologia de la enfermedad no solo a nivel inter especifico sino intra especifico, al punto que lineas de hospederos de la misma variedad de una especie geograficamente separadas manifiestan sintomas por los cuales se pueden identificar razas del patogeno (Jimenez-Gasco et al., 2005). Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp. ciceris es un hongo que habita el suelo y esta patogenicamente especializado sobre especies de Cicer (KAISER et al., 1994), en cuyas poblaciones pueden distinguirse dos patotipos (denominados de Amarillez y Marchitez) que difieren en virulencia (definida por la cantidad de enfermedad que pueden causar en un cultivar del huesped), y ocho razas patogenicas (razas 0, IA, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) que pueden ser identificadas por la reaction que determinan en un conjunto de cultivares y lineas diferenciadoras de razas (HAWARE y NENE, 1982; JIMENEZ-DIAZ et al, 1993). De las ocho razas, seis (razas lA, 2, 3, 4,5y6) causan el smdrome de Marchitez (clorosis y flacidez rapida de tejidos aereos y coloracion castano-oscura del tejido vascular y medular) y dos (razas 0 y 1B/C) causan el smdrome de Amarillamiento (amarillamiento progresivo, defoliation y coloracion vascular y medular) (Figura 1); y las ocho razas tienen una distribution geografica distintiva (Haware y Nene, 1982; Jimenez-Gasco et al., 2001).

En el caso particular de tomate se han identificado 3 razas espetificas cuyos smtomas, aun en la misma lmea parental de una variedad de tomate, difieren. Apodaca en el 2006 reconoce que la susceptibilidad de las plantas varia segun la cepa que se use del patogeno. Ello ocasiona que una variedad resistente sea afectada en mayor o menor grado segun el sitio de origen geografico de la cepa.

Por estas razones, como fase inicial del estudio de un patosistema desconocido como lo es uchuva - Fusarium oxysporum, se hace inmediatamente relevante y determinante identificar en primera instancia los smtomas de la fusariosis producida por una cepa de una especie cuya identidad no deje duda, sobre plantas de la especie hospedera que se estudia. En este caso se hizo patente tal necesidad al constatar la falta de literatura que reportara la etiologia de la marchitez vascular producida por F. oxysporum sobre plantas de Physalis peruviana L, lograda gracias a los reportes de la enfermedad tanto en otras especies como en especies cercanas y taxas relacionadas. Ademas, tal necesidad fue remarcada al encontrar al hongo parasitando cultivos de uchuva de zonas productoras colombianas, siendo este confirmado solamente hasta realizar estudios minuciosos de identification y caracterizacion en laboratorio, invernadero y actualmente en campo (Rodriguez, 2010).

Dicha etiologia fue estudiada procurando las condiciones mas propicias en la que la planta de uchuva pudiera ser mas susceptible a la infection por Fusarium. Estas condiciones fueron: Cepa seleccionada, aislada de campos y plantas infectadas de uchuva; previamente identificada como F. oxysporum y de patente capacidad patogenica; concentracion optima de inoculo y de condiciones ambientales en invernadero que aseguraran la supervivencia y capacidad de infeccion de este (v.g. riego constante, humedad relativa y temperatura constante); todo lo cual aseguraba la infeccion, permitiendo llevar una trazabilidad confiable de tal etiologia y una confiabilidad de los resultados de resistencia en las condiciones mas optimas para una infeccion positiva.

La calibration del inoculo, fase de estandarizacion de la escala y bioensayo de la concentration mas efectiva, permitio senalar la sintomatologia de la enfermedad, asi como construir una escala que eliminara el componente subjetivo del evaluador, por medio de la determination de fases discretas o categorias de cada uno de los estadios o grados que atraviesan las plantas durante el padecimiento de la marchitez vascular, a traves de fotografias; evidencias reales de un fenotipo enfermo. Este tipo de escalas permiten dar un indicio rapido al evaluador del tipo de enfermedad presente en un campo afectado, buscando con ello generar estrategias oportunas que minimicen el dano producido por las epifitias.

Se logro establecer la escala diagramatica de marchitez vascular de uchuva producida por F. oxysporum. En ella se puede apreciar que los 10 grados y 5 categorias propuestos correspondieron a fenotipos enfermos diferenciables a simple vista (Figuras 36 a 40).

Segun Jones (1997), el primer sintoma que se detecta en la enfermedad del marchitamiento vascular, en general, es el amarillamiento unilateral de las hojas viejas (Estupinan y Ossa, 2007). En este experimento no se observo en todas las plantas este sintoma en particular, al igual que lo reporta Cordoba en el 2003; solo fue evidente en una planta de 861 plantas y plantulas evaluadas. Asi mismo, la clorosis y decaimiento lateral, considerado en la hoja y el tallo, no se observo durante todo el experimento, siendo la clorosis caracteristicamente perimetral a las nervaciones de la hoja, concentrandose hacia el centro (Figura 35). Este es un factor caracteristico que la diferencia de la deficiencia de Nitrogeno, la cual produce una clorosis, pero homogenea en toda la hoja (Figura 70). La falta de unilateralidad de los sintomas se explica por el metodo de inoculation de inmersion de raiz en altas concentraciones de propagulos del patogeno en suspension acuosa.

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Figura 70. Contraste entre la etiologia reportada por Jones 1997 y la encontrada en el estudio. Fuente: Victor pulido, 2010.

La perdida de turgencia no fue un factor determinante en la enfermedad. Se observo que las plantas adultas utilizadas para la calibration del inoculo perdian turgencia en las primeras horas de la manana, y la recuperaban paulatinamente, aunque nunca por completo, hacia las horas de la tarde. Por ello se fijo la evaluation de los sintomas de las accesiones siempre a la misma hora todos los dias, correspondiente a la tarde, despues de los riegos. Este mismo comportamiento fue reportado por Estupinan y Ossa, 2007. Tambien se evidencio una gran diferencia en la perdida de turgencia entre las plantas adultas y las plantulas de las accesiones. Mientras en las primeras la perdida de turgencia se observo como un sintoma que no era determinante, presentandose desde los primeros grados o hasta los ultimos, pero sin ser continuo, en las plantulas este factor represento una constante de los grados 6 en adelante. Una posible explication es el tamano de las plantas que determina la capacidad total de traslocacion de agua.

Estupinan y Ossa, 2007, y Cubedo, 2008, indican que la epinastia solo sucede en las fases terminales de la enfermedad, donde las hojas han empalidecido y muerto. No obstante en este estudio la epinastia se presento en todas las fases de todas las plantas. Asi mismo las hojas muertas se desprendieron de la planta una vez estas murieron, y no, como se reporta para campo, siguieron adheridas a ella.

Un factor muy importante que se observo fue la elongation de los tallos de las plantas adultas por encima de la base. Esta elongacion disminuyo el grosor de los tallos creando una zona de fractura. Asi mismo los tallos elongados presentaron pequenas raices laterales a mas de 16 cm del suelo. Ello senala un fuerte estres hidrico de la planta producto de la obstruction de sus vasos xilematicos (Figura 71).

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Figura 71. Sintomas de estres hidrico. A: elongacion entre nudos con disminucion del grosor del tallo. B: Zona de fractura (Flecha). C: Raices a mas de 16 cm del suelo (flecha). D: Detalle de las raices. Estas crecieron hasta los 0,8 cm antes de secarse. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Cuando las plantas desarrollaron estas raices aereas la enfermedad estaba en un estado muy avanzado. Sin embargo se registraron recuperaciones asociadas a este hecho; inclusive las plantas sobrevivientes presentaron tales caracteristicas (Figuras 46 a 51). Las plantas estrictamente resistentes no presentaron tales caracteristicas.

Se observo plantas y plantulas que perdieron la raiz principal pero que desarrollaron fuertes raices laterales y adventicias aun por encima del punto de anclaje de las ramas y ramitas (Figuras 49 y 51). Este comportamiento no ha sido registrado anteriormente para uchuva pero si para tomate (Jarvis y Shoemaker, 1978, citados por Cubedo, 2008). En todo caso parece un mecanismo de resistencia asociado con el confinamiento del patogeno por encima de la region de lesion, puesto que todas las plantas presentaban ambos caracteres a la vez (Figura 50 A). Al parecer las plantas sobrevivian sacrificando toda la portion del tallo afectado junto con la raiz principal, al unisono las raices laterales incrementaban su volumen y longitud y, por ende, su capacidad fisiologica, mientras que se desarrollaban raices adventicias por encima del cuello de la raiz y de las ramas que ya habian retonado. Estas ramas por dominancia apical tomaron el papel principal en el aparato vegetativo de la planta, quedando la rama muerta como un vestigio (Figura 72). No obstante las plantas contenian al patogeno, pues meses despues de la recuperation muchas plantas volvian a presentar sintomas, si bien mas atenuados (Figura 66 B). Cabe resaltar que las ramas se desarrollaron y crecieron inclusive con el tallo o eje principal de crecimiento severamente afectado (Figura 48).

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Figura 72. Planta sobreviviente luego de ser extraidos los esquejes. La flecha senala el lugar donde murio la rama, sitio donde se formo un tejido coriaceo. Fuente: Victor Pulido, 2010.

En todos los casos de susceptibilidad manifiesta las raices perdieron mucho de su sistema radicular hasta muy bajas densidades. Ademas se observo atrofia y enanismo del sistema vegetativo y radicular, asi como en varios casos hubo crecimiento desmedido en longitud de la raiz principal. Todas estas son respuestas complejas a la interaccion del patosistema en la lucha por la supervivencia. Estas respuestas y signos constituyen un problema que ha de ser explicado desde la eco fisiologia del hospedero y del huesped, de forma minuciosa, en estudios proximos.

Por otro lado se observo que el resto de sintomas correspondieron con los reportados por Estupinan y Ossa, 2007 y Cubedo, 2008, para uchuva y Agrios, 2008, Di Pietro, 2004, para la marchitez producida por Fusarium oxysporum en general.

Las plantas estrictamente resistentes fueron las de las accesiones 09u178: Solanum auriculatum; y 09u139: Physalis floridana. Ello sugiere que la resistencia estuvo implicada en la primera fase de la infeccion del patogeno: reconocimiento y penetracion. O bien estas plantas de estas accesiones impidieron de algun modo el reconocimiento por senales extracelu lares del patosistema, o bien, sus tejidos dermicos obstaculizaron la penetracion de la hifa. De cualquier forma, la falta de sintomas senala que el patogeno no esta presente en las plantas. Las accesiones 09u047 y 09u279, ambas P. peruviana, presentaron para el primer caso sintomas de epinastia y defoliacion y, para el segundo, clorosis escasa (menor al 5%). Ello sugiere para el primer caso una resistencia asociada a la capacidad del patogeno para desarrollarse. Si bien el patogeno penetro en la planta y obstruyo el paso de agua, no pudo establecerse del todo, pues al dia 45 los sintomas ya no eran evidentes y 5 meses despues las plantas presentaban muy buen porte sin sintomas de la enfermedad. Para el segundo caso se sugiere un control del patogeno mas agudo, pues si bien existieron sintomas en algunas plantas de la accesion, estos fueron menores al 5% de dano general. Tras 5 meses de haber sido inoculadas, las plantas permanecian lozanas. Esto es evidencia que el patogeno fue controlado a nivel interno, durante las primeras fases de desarrollo; y que su control fue efectivo.

En cuanto a las categorias de sintomas reportadas en este estudio para el patosistema uchuva - Fusarium oxysporum, correspondieron con la designation habitual presente en multiples estudios fitopatologicos reportados en libros y revistas indexadas de alto impacto, ya mencionados durante este trabajo.

La escala de severidad puede ser nombrada a favor de la resistencia o de la susceptibilidad. Asi los grados pueden ser de la resistencia (como resistente, moderadamente resistente, etcetera), o, como en este estudio de la susceptibilidad (resistente, poco susceptible, etcetera).

El caso de poco susceptible equivale nominalmente a tolerante. El termino de tolerante en fitopatometria ha sido controvertido, pues hay posturas que lo comparten o lo rechazan (Fundora, 2005). Se entiende por tolerancia la capacidad de las plantas para producir una buena cosecha aun cuando sean infectadas por un patogeno. Las plantas son susceptibles pero no destruidas por el patogeno (Hernandez, 2010).

El diagnostico de la enfermedad causada por F. oxysporum no es facil de manera temprana, ya que el hongo coloniza el sistema vascular antes de la expresion de sintomas en la planta (Nelson, 1964; Cordoba, 2003). Cuando estos se presentan la enfermedad suele estar en un estado avanzado de infection (Cubedo, 2008). Por ello el dia en que se presenta el primer sintoma visible constituye un indicio de la severidad de la infeccion e indica el periodo de incubation de la enfermedad (Estupinan y Ossa, 2007). Este dia es diferente del dia de colapso o muerte de la planta y depende directamente de las condiciones de inoculacion, especialmente de la concentration de propagulos y de la edad de las plantas.

En este estudio a los 30 dias de haber sido inoculadas las plantas se presento el primer sintoma de la enfermedad. Este resultado concuerda con lo reportado por Cubedo 2008 y Estupinan y Ossa, 2007 para uchuva, asi como Cordoba, 2003 y Ascencio et al., 2008, en tomate, Gasco et al., 2005 en garbanzo, Araya y Araya, 2000, en frijol. Asi, la infection por marchitez vascular en plantas adultas se presenta, indiferentemente de la especie, a los 30 dias despues de la inoculacion. Este es, por tanto, el tiempo minimo de incubation para la manifestation de la marchitez vascular en plantas. En contraste, en plantulas se presento el primer sintoma de enfermedad a los 9 dias de la inoculacion. No obstante Rodriguez 2010 afirma que en el caso de uchuva la edad de la planta no influye en la velocidad de infeccion y los sintomas comienzan a evidenciarse dentro de las dos primeras semanas despues de la inoculacion, lo cual contrasta con los datos ya mencionados.

Por otro lado, los colapsos en plantas adultas se presentaron a los 9 dias del primer sintoma, 39 dias despues de la inoculacion; y en plantulas el primer colapso vario ampliamente de 7 dias a partir del primer sintoma, 16 dias despues de la inoculacion, a 14 dias del primer sintoma, 23 dias despues de la inoculacion. Ademas, las accesiones 09u012, 09u021 y 9u022 tuvieron colapsos del 100% de sus plantas solo en la primera semana, manifestando el primer sintoma a los 9 dias de la inoculacion, es decir, estas plantulas murieron en el dia 0 de evaluation. Ello demuestra que la edad es un factor que determina el grado de severidad de la enfermedad y la rapidez con que se manifiestan los sintomas, refutando lo reportado por Rodriguez, 2010.

En cuanto a la concentracion, Rodriguez 2010 reporta para una concentracion de inoculo a 106 ufc/mL 11 dias para la infeccion de las plantulas, mientras que Rosewich et al., (2003), reporta para plantulas evaluadas con una concentracion de 106 conidios/mL una infeccion a los 10 dias. En este estudio se reporta para una concentracion de 104 ufc/mL 7 a 14 dias para la infeccion. Por consiguiente, una a dos semanas parece ser el lapso de tiempo para la infeccion en plantulas.

En base a lo anterior la concentracion no parece ser determinante en la velocidad de la infeccion, pero si la edad de la planta. Esto se debe a que la infection siempre precisa de una penetration del tejido. Puede penetrar desde un conidio a millones, siendo el papel de la concentracion asegurar dicha penetracion. No obstante, no todos los conidios que penetran producen infeccion (Agrios, 2008), pues tanto la fisiologia del conidio como de la planta son necesarias para ello. En este sentido, las edades juveniles de las plantas son las mas vulnerables (Harper, 1977), sobre todo a las condiciones ambientales y al ataque de patogenos. Por ello no es extrano que las plantulas del estudio mostraran un menor tiempo de incubacion que los adultos.

7.2 Calibracion del inoculo:

Se encontro que 10.000 unidades formadoras de colonia por mililitro es la concentracion ideal para evaluar accesiones en un tiempo de 45 dias. Este valor constituye una medida mas real del numero de esporas que pueden llegar a estar en contacto con la planta en el momento de infeccion respecto a medidas del orden del millon o superiores, las cuales casi siempre son usadas para incrementar la presion de inoculo, buscando una infeccion y desarrollo adecuado de la enfermedad (Hood y Steward, 1957).

El uso de un medio liquido como vector del inoculo facilito la infeccion, proporcionando la penetracion del propagulo. Por lo general en la naturaleza la colonization es efectuada por pocos propagulos, perdiendose en el proceso gran parte del propagulo producido (Agrios, 2008). Ademas, la presencia de sustancias fungistaticas inhiben el desarrollo del tubo germinativo de las esporas del hongo, el cual ha de desarrollarse antes, inclusive, del reconocimiento fisico. El lavado de la raiz, la esterilizacion del suelo y el medio acuoso donde reposan las esporas eliminan este inconveniente al eliminar tales sustancias producidas por el hospedante y la microflora antagonica del suelo; no obstante los exudados de la planta tambien son desechados en el proceso, por lo que no promueven la germination de la espora. En contraposition el medio liquido suple esta necesidad junto con una temperatura adecuada a una alta humedad relativa, tal como fueron las condiciones del invernadero. En este sentido se ha documentado que F. oxysporum crece mas rapido a temperaturas calidas (de entre los 20 y 25 °C) (Agrios, 2008;

Estupinan y Ossa, 2007; Cubedo, 2008; Cordoba, 2003; Araya y Araya, 2000; Gordon et al., 1997; Palma, 2004), tal como las registradas durante todo el experimento (20 ± 2 C).

No se aplico un analisis de varianza porque no existian unidades de muestra al prescindir de controles tanto para las concentraciones como para el efecto negativo. Por ello se uso un control visual que descartaba unicamente problemas con el trasplante y cuyos datos no fueron incluidos en el analisis de medias y bloxplot. El grafico de cajas permitio apreciar diferencias en las medias; sin embargo, esto por si solo no constituye un factor de seleccion.

Tanto el analisis grafico de severidad vs. Concentration, como de incidencia vs. Concentration mostraron tendencia hacia 10.000 ufc/mL. No solo los resultados fueron iguales para esta concentracion, sino que en muchos casos se solapan en la respuesta. Por ello es recomendable para estudios de este tipo realizar solo el analisis de incidencia, pues es patente que ambas medidas son utiles en la medicion de la enfermedad. No obstante, la medida de la severidad implica un esfuerzo mayor de muestreo, que acompanado con los sobrecostos de tiempo y analisis, produce la misma respuesta que la incidencia pero con una relation costo-beneficio desfavorable.

Al respecto James, 1971 opina que la medida por severidad constituye un problema complejo ya que puede inducir errores graves de precision, exactitud y reproducibilidad, asi como a menor eficiencia con respecto a una medicion con base en incidencia. Van Schoonhoven y Pastor Corrales, 1987 creen que en este sentido la mayor information que normalmente proporciona una medicion de severidad, puede tener un alto costo que debe minimizarse, ya que este no puede eliminarse totalmente. Por ello depende del grado de especificidad que se busca al abordar fitopatologicamente una enfermedad limitante para escoger el metodo de cuantificacion del dano. Si se desea ser minuciosos, y se cuenta con capacidad economica y logistica, el mejor abordaje es la cuantificacion de la severidad del dano como una medida detallada de la enfermedad. Si se desea rapidez en la diagnosis del dano, austeros en los gastos y en la logistica, la incidencia es la medida que se ha de escoger. Ademas, la severidad produce una vasta cantidad de datos que, a lo sumo, detallan la incidencia de una enfermedad, asi que, la severidad esta incluida en la incidencia.

El primer analisis de regresion logistica no permitio saber cual fue la concentration mas letal. El primer modelo que contemplo tanto el DDO como las concentraciones permitio concluir que el efecto en la probabilidad que hay hacia el sintoma depende significativamente del DDO, con un error estandar minimo, y con un estimado superior a los tratamientos concentraciones (Tabla 11).

El segundo analisis tampoco permitio reconocer la concentracion mas letal. Existieron problemas en la estimation de los parametros para las probabilidades a partir del dia 36. No obstante, se observo que durante lapsos de tiempo regulares la sintomatologia no cambiaba (Tabla 13). Los cambios y, por ende, los dias que aportan datos relevantes fueron, segun este modelo, los dias 5 a 9, 12, 15 a 16, 20, 30, 34 y 37. Los cambios mas evidentes en la probabilidad del sintoma se dan en los dias 5, 15, 30 y 37. En base a estos resultados es conveniente realizar el muestreo de severidad o incidencia solo en estos dias, preferiblemente los dias 1, 5, 15, 30 y 45. Al respecto Tovar et al, 2002, aplico muestreos cada 8 dias en frijol; Fundora, 2005, cada 7 dias en pepino; Patino, 2006, cada 12, 21 y 28 dias en frijol; y Estupinan y Ossa, 2007, cada 8 dias en uchuva, todo en un tiempo no superior a 50 dias. Por ello los intervalos de muestreo propuestos son convenientes al estar en concordancia con los rangos de dias de evaluation.

Fue posible efectuar el analisis de los postulados de Koch. Como senalara Rodriguez, 2010, el estado de la enfermedad en la planta es determinante en los procesos de aislamiento de Fusarium sp. Una planta que se encuentra en un estado muy avanzado de la enfermedad, no solo va a contener el agente causal, sino tambien una gran cantidad de microorganismos secundarios que hospedan la planta despues de haberse efectuado la infection (Leslie y Sumerell 2006). En nuestro caso se logro aislar al patogeno solo en 11 de los 12 ensayos de aislamiento. Se atribuye el exito a que el tejido que se escogio para los aislamientos correspondio a tejido no necrotico de la zona del cuello de la raiz, asi como a la realizacion de varias pruebas previas de tiempos y concentraciones de hipoclorito de sodio. Asi mismo se uso cloranfenicol en los medios PDA.

7.3 Evaluacion de las accesiones:

Se busco la mayor representatividad de zonas productoras de uchuva en Colombia y en el mundo como criterio para la seleccion de las 70 accesiones usadas en este estudio. De igual manera se incluyo material considerado como elite, es decir, revestido de importancia. Por ejemplo, se incluyeron materiales comerciales de los ecotipos KENIA, COLOMBIA y PERU, asi como “variedades” comerciales que reportaron tolerancia a la enfermedad en campo. Tal es el caso de la variedad de Novacampo 09u274.

Por primera vez se encuentran genotipos de accesiones resistentes, en sentido estricto (no manifestaron sintomas) a F. oxysporum en uchuva. La accesion 09u279 es, para este estudio, el resultado bandera, pues se trata de una accesion de uchuva que no manifesto sintomas (mayores al 5% de dano) y cuyas plantas, 5 meses despues de finalizada la evaluacion, aun permanecen incolumes (Figura 73).

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Figura 73. Algunas plantas de la accesion 09u279. Notese la lozania 5 meses despues de haber sido inoculadas.

Esta accesion junto con la 09u047 son peruvianas silvestres tomadas al lado del camino, siendo consideradas como “malezas”. Cuando se busca resistencia las plantas en las cuales podria estar contenida pueden proceder de lugares inesperados, de alli es menester evaluar materiales inexplorados y mas cuando se trata de genotipos habituados a un ambiente salvaje, donde evolucionan bajo la fuerza de la seleccion natural en pro de su perpetuacion. Los cultivares domesticados con el tiempo han disminuido esta capacidad o la han perdido, pues la seleccion antropocentrica en pro de lo comercial erosiona los genes de resistencia vertical. En este sentido solo cuando un fitomejorador busca tal resistencia es cuando esta se hace relevante, estando la gran mayoria de las veces la prioridad en factores culturales de consumo como las caracteristicas organolepticas y no, en el bienestar de un genotipo silvestre.

El escenario resultado de este estudio establece la necesidad de multiplicar los genotipos encontrados, accion ya emprendida por medio de clones somaticos. Asi mismo, las otras dos accesiones resistentes, Solanum auriculatum y Physalis floridana han de ser reproducidas y conservadas. La resistencia aqui presentada se restringe solo a la cepa del patogeno evaluada, siendo una necesidad evaluar estas accesiones resistentes y poco tolerantes con otras cepas, tanto de origen geografico comun como distinto. Ademas, cabe notar que este pudiera ser un caso de alta especificidad con el hospedero, pues el 96% de las P. peruvianas evaluadas colapsaron y, de este porcentaje, todas tuvieron plantas altamente susceptibles, predominando este termino para las accesiones. No obstante, los taxas relacionados fueron moderadamente y poco susceptibles, mostrando ser de gran interes como fuentes de resistencia al patogeno. Ademas S. auriculatum a pesar de ser la especie mas alejada de la uchuva usada en este estudio, fue la que obtuvo el promedio de resistencia mas cercano a 0 o resistencia total, mostrando ser tambien de gran interes, sin embargo, se recomienda hacer evaluacion en otro tipo de solanaceas o de huespedes potenciales, asi como confirmar estos datos obtenidos no solo para la cepa evaluada sino tambien para el resto de cepas que conforman la coleccion proveniente de este estudio.

La escogencia de 09u047 se hizo con base a su gran vigor y muy poca susceptibilidad, aunado al criterio del evaluador. Durante todo el experimento esta accesion solo registro epinastia y caida de hojas, las cuales presentaban una clorosis muy leve. No obstante estos sintomas, las plantas en general siguieron sin atrofia alguna, mostrando un porte vigoroso. Es mas, estas plantas crecieron muchisimo mas rapido que las plantas de otras accesiones. El estado general de las plantas al cabo de 6 meses de terminada la evaluacion se muestra en la figura 74.

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Figura 74. 09u047-2 y 09u047-12, ejemplo del estado general de la accesion 09u047. En las flechas se senala la rama muerta de cada planta. La muerte de estas ramas sucedio al cabo de 2 mese de finalizada la evaluacion. Esta era la rama principal antes de morir. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Las otras accesiones se escogieron bajo el parametro del promedio de severidad. Segun este analisis 09u139, 09u178, 09u279 (incluida 09u047 por lo ya expuesto) son las accesiones resistentes, desechando la hipotesis nula.

Analisis de conglomerados: los datos del primer parametro usado para construir el Dendograma final del analisis de conglomerados arrojaron resultados iguales al analisis de severidad. Ello confirmo a las accesiones resistentes como tales. Este parametro fue la incidencia de la enfermedad. En ella se tomo solamente como resistente a aquellas accesiones que tuvieran 0% de plantas muertas y una severidad (entendida como el dato mas frecuente) de 0 o 1, correspondiente a la categoria 0 o resistente de la escala homonima. Segun estos parametros las accesiones resistentes fueron las mismas que las del analisis anterior, es mas, incluyo a la 09u047.

Cuando se creo el Dendograma con 6 cluster, los grupos correspondieron a las categorias fijadas en la escala de severidad (Figura 69). En este Dendograma se distingue, primero, la separacion entre susceptibles y resistentes (Figura 75). Los clados susceptibles son el 1, 3, 4 y 6; los resistentes son el 2 y el 5 de la figura 69 y la tabla 20.

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Figura 75. Divergencia entre resistentes y susceptibles. Caracteres usados: incidencia (% de plantas muertas) y severidad (moda de severidad del dia 45). Fuente: Victor Pulido, 2010.

Vemos por los estadisticos de la tabla 18 que el criterio que explica el por que estos grupos correspondieron tan bien con los analisis anteriores y con la escala de severidad es el promedio de la incidencia que, como ya se menciono, es un termino en la practica equivalente a la severidad.

Tabla 20. Grupos de acuerdo a los datos de conformacion y su equivalencia con la escala de severidad. A.S: altamente susceptible; S: susceptible; P.S: pocos susceptible; R: resistente. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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No obstante hubo transferencia de accesiones al comparar un analisis y el otro. Por ejemplo, para el analisis de severidad (promedio) hay 39 accesiones A.S., mientras que por conglomerados hay 35 (tabla 21).

Tabla 21. Comparacion entre los dos analisis: Severidad por promedio y Conglomerados por escala binaria de los caracteres incidencia (%) y severidad (moda). Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Esto se debe a que los grupos 5 y 6 presentan ambiguedad en la comparacion. Si observamos las incidencias altas tienen por moda una severidad de 9. Es entonces cuando la incidencia se torna el criterio de separacion de los conjuntos. No obstante, 5 tiene una incidencia alta del 30% y una moda de severidad del 0,600. Asi mismo, 6 tiene una baja incidencia del 18%, pero una moda de severidad de 9. Estos resultados no corresponden ni a una accesion fenotipicamente resistente, ni a una susceptible. Es cuando se hace necesario integrar el termino tolerancia como un punto intermedio de desambiguacion (tabla 22).

Tabla 22. Grupos de acuerdo a los datos de conformacion y su equivalencia con la escala de severidad con la introduccion del termino tolerante. A.S: altamente susceptible; S: susceptible; P.S: pocos susceptible; R: resistente. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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El termino de tolerancia no es completamente equivalents a la poca susceptibilidad, puesto que esta ultima requiere un porcentaje de dano (tanto en la planta: severidad-, como en la accesion: incidencia-.) menor de 20, y una severidad igual o menor de 3; siendo ilogico que para este porcentaje la moda de severidad sea de 9 o muertas. Asi mismo el termino moderadamente susceptible no admite una frecuencia de severidad de 9, aunque a diferencia de la poca susceptibilidad si puede haber plantas muertas, por lo general tan solo una o dos, ademas, el porcentaje de dano debe ser menor de 40, pareciendose de esta forma a la tolerancia.

La tolerancia fue entendida como la presencia de sintomas en plantas sobrevivientes, cuya afectacion no fue mayor al 20% en general, llegando a tener la accesion incluso plantas muertas.

Asi mismo se incremento el numero de accesiones resistentes, las cuales corresponden a aquellas de poca susceptibilidad en el analisis de severidad. La resolucion de este problema radica en el grado de rigurosidad al momento de definir la resistencia, si bien como la falta de sintomas o como el soporte de una sintomatologia poco aguda en plantas lozanas. En este estudio la resistencia fue entendida como la falta de sintomas o la presencia de menos del 5% de dano general.

De lo anterior podria entenderse al grupo 5 como poco susceptible, por su cercania con la resistencia, obviando los 10 puntos porcentuales por encima del criterio de la categoria y optando por priorizar la severidad como el caracter diagnostico; a la vez el grupo 6 se entiende como un posible tolerante, por su baja incidencia acompanada de plantas muertas en la accesion (Figura 76), es decir, por su severidad de 9. No obstante es imperativo revisar los criterios de la categoria poco susceptible y moderadamente susceptible, para con ello descartar o incluir el termino tolerancia o para fusionar en una sola categoria la poca y moderada susceptibilidad.

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Figura 76. Dendograma donde los clusteres son identificados de acuerdo a la escala de severidad con la adicion del termino tolerancia. Fuente: Victor Pulido, 2010.

Hay que tener en cuenta que de las 6 accesiones que hacen parte de los dos grupos con problemas en la correspondencia con la escala, 3 son clones; estando dos de ellos en el grupo 6: 09u005 y 09u217, y el tercero en el grupo 5: 09u216 (Figura 76). El cuarto clon usado en este estudio es el 09u215, el cual es cercano al grupo 6. La homogeneidad genetica de las plantas de estas accesiones puede ser el factor que provoco el inconveniente al momento de asignar estos dos cluster a una categoria de la escala de severidad. Para corroborar esta consideration es necesario hacer futuros trabajos contrastando la respuesta al patogeno de la accesion con clones y con individuos provenientes de un mismo parental.

Regresion logistica: este analisis incluyo como accesiones resistentes la 09u178, 09u279, 09u176, 09u139, 09u071 y 09u063. Estas accesiones incluyen en su definition el termino de poca susceptibilidad, pues la escala binaria de la cual se calculo el estimado de probabilidad de todos los estadisticos contiene las categorias 0 y 1 de la escala de severidad, esto es, los grados 0, 1, 2, y 3, siendo el 2 y 3 pocos susceptibles. De alli que se estimen un numero mayor de accesiones resistentes que en otros analisis. Este analisis no estimo a la accesion 09u047 como resistente.

Las accesiones de la tabla 19 que no reportaron estadisticos y probabilidad para el dia 45, presentaron todas sus plantas muertas desde el inicio de la evaluation, es decir, el dia uno todas las plantas estaban muertas. Esto provoco que S.A.S. no pudiera estimar una probabilidad en factor de la variable dia, pues todos los datos eran iguales y, por ende, la varianza fue cero. Las accesiones que presentaron una probabilidad de 1,0000, es decir, altamente susceptibles, tambien presentaron los mas altos porcentajes de concordancia entre el valor estimado y el observado. Esto se debe a que el evento-sintoma 1 tiene mas grados en su definition (4, 5, 6, 7, 8 y 9 de la escala de severidad), por lo que es mas probable encontrar un numero que corresponda con este evento 1 que con el evento 0.

Al comparar las 4 metodologias usadas para estimar la resistencia a partir de los datos netos se observa que las accesiones estimadas para resistentes y poco susceptibles son las mismas, con algunas inclusiones de metodo a metodo (Tabla 23)

Tabla 23. Comparacion de los resultados de las metodologias empleadas para evaluar la resistencia/susceptibilidad de las accesiones elite de germoplasma de uchuva. Se incluye la resistencia y poca susceptibilidad; no se incluye la comparacion de las categorias 2, 3 y 4 de la escala de severidad. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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En azul las accesiones poco susceptibles; en rojo las accesiones resistentes.

De los analisis anteriores se concluye que las accesiones resistentes son, en orden descendente de resistencia, la 09u178, 09u139 y 09u279. Las accesiones susceptibles son la 09u047, 09u173, 09u071, 09u063, 09u176 y 09u216, tambien en orden descendente de resistencia. La accesion 09u047 fue reconocida como resistente en base a su gran vigor y muy poca susceptibilidad.

1. Las accesiones resistentes son, en orden descendente de resistencia, la 09u178 (Solanum auriculatum), 09u139 (Physalis floridana) y 09u279 (Physalis peruviana). Las accesiones poco susceptibles son, en orden ascendente de susceptibilidad, la 09u047 (Physalis peruviana), 09u173 (Physalis angulata), 09u071 (Physalis philadelphica), 09u063 (Physalis philadelphica), 09u176 (Physalis ixocarpa) y 09u216 (Physalis peruviana, clon Ecotipo Colombia). Estas accesiones y las plantas resistentes son el insumo para futuras investigaciones en resistencia, especial mente a la resistencia asociada a genes y sus productos. La accesion 09u047 fue reconocida como resistente en base a su gran vigor y muy poca susceptibilidad.

2. La escala de severidad creada en este estudio sirvio para estimar satisfactoriamente los sintomas de la marchitez vascular causada por F. oxysporum sobre plantas y plantulas de uchuva y taxas afines. Esta escala fue congruente con la literatura sobre escalas en uchuva y en especies afines.

3. Los sintomas caracteristicos de la marchitez vascular producida por F. oxysporum sobre plantas y plantulas de Physalis peruviana son:

a. Clorosis progresiva del borde al centro y de las nervaciones al centro de la hoja hasta alcanzar un necrosamiento que sigue el mismo patron. La clorosis se efectua desde las hojas mas basales o viejas al apice.
b. Perdida de turgencia durante la clorosis. Esta puede tener un comportamiento intermitente entre las horas de la manana y la tarde.
c. Atrofia y postracion progresiva del tallo. En estados avanzados de la enfermedad se observan elongacion, pudricion y desprendimiento de la corteza de la base.
d. Epinastia. En la gran mayoria de casos la defoliation en plantulas es severa, hasta la perdida total de las hojas. En plantas la epinastia es moderada y las hojas pueden quedar adosadas o no, enrolladas o extendidas.
e. Obliteration de raices, bien sea la principal, las laterales o ambas. La obliteration ocasiona una muy baja densidad de raices. Ahi atrofiamiento de raices laterales, perdida de fibrosidad y emergencia de raices adventicias, sobre todo por encima de la base el tallo o, incluso, de las ramas. La obliteracion esta acompanada de oclusion de los vasos del xilema.
f. Enanismo de toda la planta o plantula.

4. 10.000 ufc/mL es una concentration ideal para evaluar resistencia/susceptibilidad de plantas de uchuva al hongo F. oxysporum; representando una medida mas cercana a la realidad de propagulos presentes en la naturaleza al momento de infection, que ordenes de magnitud superiores.

5. La resistencia presentada en este estudio estuvo asociada a la especificidad del patogeno, pues las plantas de las accesiones estrictamente resistentes que manifestaron ningun sintoma son de especies diferentes de uchuva, mientras que las plantas de las accesiones resistentes de uchuva manifestaron sintomas escasos.

1. La escala de severidad estimada a partir de la sintomatologia tipica de una enfermedad depende directamente de la cepa y el hospedero especifico que conforman el pato sistema. No es posible exportar datos de etiologias de enfermedades parecidas, porque todos los patosistemas tienen caracteristicas unicas. Este problema se acentua en especies tan cosmopolitas y diversas como F oxysporum. La arbitrariedad de las escalas de severidad mellan el rigor cientifico. La busqueda de etiologias parecidas es un punto de partida pero no el fin en si; esta herramienta es util como modelo de estructuracion, pero solo la construccion precisa de una escala asegura resultados confiables.
2. Revisar los limites entre la poca susceptibilidad y la moderada susceptibilidad, pues ambos terminos pueden, en algunas accesiones, llegar a sobreponerse, siendo dificil su determination.
3. Realizar los bioensayos que conlleven mas de 15 tratamientos con un diseno de bloques completos al azar, bloqueando el efecto de la position de los tratamientos en las camas del invernadero. Se recomienda no menos de 3 unidades de muestreo por tratamiento, con controles negativos y positivos, con 3 repeticiones por unidad experimental.
4. Priorizar la evaluation de las accesiones poco susceptibles: 09u173, 09u071, 09u063, 09u176y09u216.
5. Fijar la hora de muestreo y evaluacion de las accesiones, pues la temperatura y la humedad relativa afectan tanto la capacidad patogenica del parasito como la ecofisiologia de la planta, alterando la respuesta del patosistema.
6. Los postulados de Koch son una herramienta util para discernir la causa de una enfermedad, sometiendo los posibles candidatos a una prueba sencilla pero muy confiable. No obstante, se debe ser muy cuidadoso al momento de querer re aislar al posible patogeno causal de la enfermedad, pues tejidos en avanzados estados de descomposicion presentaran tanto al patogeno de interes como a patogenos oportunistas de, inclusive, dominios distintos. Es por ello que se recomienda realizar los re aislamientos de individuos que presenten los primeros sintomas de la enfermedad y/o de tejidos en apariencia sanos. Tambien se recomienda hacerlo de plantas reclutadas, es decir, de plantas que hayan superado la etapa juvenil.
7. La resistencia y la tolerancia son terminos ambiguos, cuyas definiciones segun el autor pueden solaparse, contradecirse o complementarse. Es por ello que se debe fijar desde el comienzo si se desea evaluar resistencia, susceptibilidad y/o tolerancia, todo teniendo en cuenta una definition objetiva. En este estudio la resistencia fue entendida como la falta de sintomas o la presencia de menos del 5% de dano general. La tolerancia fue entendida como la presencia de sintomas en plantas sobrevivientes, cuya afectacion no fue mayor al 20% en general.
8. Es necesario investigar la resistencia, la tolerancia y la susceptibilidad de los clones de las accesiones, especialmente las resistentes. La respuesta del patosistema depende directamente del genotipo del hospedero, por ello trabajar con clones elimina un factor de variation, homogeniza las plantas y reduce la dispersion de los resultados. El tratamiento estadistico y la interpretation de los datos se torna sencillo. En contraposition se pierde variabilidad genotipica, lo cual restringe aun mas los posibles candidatos de resistencia y, por ende, el alcance de los resultados del estudio.

Extender los resultados de este estudio usando mas cepas de F. oxysporum de distinto origen geografico sobre las accesiones y plantas reportadas como resistentes. En este estudio fue usada solo una cepa de las 3 reconocidas taxonomica y molecularmente como Fusarium oxysporum, del total de 25 aislamientos de campos del sector productivo de los principales centros productores del mundo: los departamentos de Cundinamarca y Boyaca. A pesar de ello, los resultados son mas que alentadores, pues se probo que existe resistencia al patogeno en varias especies y ecotipos. Por ello se debe ampliar la base de patogenos probados, empezando por los 25 aislamientos de los centros productores y extendiendolos a cepas aisladas de otras regiones, otros estudios y otras especies. Ello permitira corroborar la resistencia de las accesiones, a la vez que prueba el nivel de diversidad entre aislamientos dentro de la misma planta, campo o region geografica (Sandoval, 2010), y la especificidad de la resistencia, si bien es horizontal o vertical (Agrios, 2008).

Ampliar el numero de accesiones evaluadas para asi ampliar el numero de accesiones y plantas resistentes, pues se evaluo tan solo el 25% de la coleccion de uchuva y taxas afines de Corpoica con tan solo una cepa patogenica. Ello permitira obtener mas datos de resistencia, tolerancia o susceptibilidad de las entradas. Una vez finalizada la evaluation de las entradas con una cepa, es menester iterar el procedimiento con tantas cepas de F. oxysporum como sea posible.

Estudiar eco fisiologicamente las resistencias halladas en este estudio. Es importante saber en que fase del proceso de infection se presenta la inhibition del patogeno, pues la inmunidad y el valor comercial de los cultivares prospecto de resistencia aqui hallados depende de si el patogeno logro ingresar a la planta, si se establecio, si se desarrollo y, si finalmente, produjo los sintomas. Este tipo de estudios son la base para determinar la estrategia de homogenization de la resistencia en los futuros cultivares. Estas estrategias pueden ser de retro cruces, de selection de genes de resistencia asistida por QTLs, de clonaje (cultivos de anteras, esquejes), de injerto, de transgenesis. El tipo de estrategia escogida depende del escenario en que se presento la resistencia y de la capacidad

logistica del fitomejorador, asi como del valor morfo agronomico y, a lo sumo comercial, de las plantas resistentes.

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ANEXOS

Anexo 1. Coleccion base de uchuva y taxas relacionados

Ver DVD adjunto, archivo: TESIS/RESULTADOS/Excel/

Base_de_datos_con_la_coleccion_de_accesiones-Fin_del_proyecto (1)

Anexo 2. Preparacion de los medios de cultivo Agar papa Dextrosa (PDA) y

Agar Hoja de Clavel (CLA)

Preparacion de medios de cultivo usados para la caracterizacion del patogeno y la produccion de inoculo:

> Medio Potato Dextrose Agar (PDA).

Agar: 20 g.

Papa: 200 g Dextrosa: 20g.

A un litro de agua destilada se adicionan 200 g de papa picada en trozos, la mezcla se calienta durante 30 minutos, posteriormente la infusion se filtra a traves de gasa, al filtrado se adicionan 20 g de dextrosa y 20 g de agar y se lleva a 1000 mL con agua destilada, se ajusta el pH a 4,5 y por ultimo el medio es esterilizado en autoclave durante 15 minutos a 20 psi y servido en cajas petri esteriles (25mL/caja).

Cuando el medio se preparo a partir de PDA liofilizado de una casa comercial, se uso el siguiente protocolo:

Papa Dextrosa Agar (PDA) - OXOID.

Siguiendo las recomendaciones del fabricante (Oxoid) se necesitan 39 gramos de agar sintetico (PDA), 250 mg/l de antibiotico (tetraciclina, ampicilina o cloranfenicol) y esto se afora a 1 litro con agua destilada. Se mezcla y se esteriliza a 120 °C y 15 libras de presion por 15 minutos. Una vez esterilizado se dispensa en cajas de petri esteriles o se deja enfriar hasta que solidifique. Se ajusta a pH 5,3.

> Medio Carnation - Leaf Agar (CLA)

Agar: 15 g

Cloruro de Potasio (KCl): 4g.

Esquejes de Clavel.

Los esquejes deben ser lavados con agua esteril, cortados en trozos de un centimetre cuadrado y esterilizados 48 horas bajo luz U.V. luego de tener los trozaos de hojas de clavel esteriles, a 1000 ml de agua destilada se adicionan 4 g de KCl y 15g de Agar, el medio se esteriliza durante 20 minutos a 20 psi y posteriormente se sirve en cajas petri esteriles, por ultimo se ponen 4 trozos de hoja de clavel por caja petri de 10 cm, el hongo se inocula sobre los trozos de clavel.

Nota: Cuando se usan cajas petri de 5 cm de diametro solo se coloca un trozo de hoja de clavel en el centro de la caja.

> Medio Potato Dextrose Broth (CPD 6 PDB, por sus siglas en ingles).

Papa: 500 g Dextrosa: 20 g.

A un litro de agua se adicionan 500 g de papa, la mezcla se calienta durante 20 minutos, la infusion se filtra a traves de gasa y se centrifuga a 2.000 gravedades durante 10 min., con el fin de eliminar los sedimentos restantes. Al filtrado se adicionan 20 g de dextrosa,

el medio se agita, se sirve en erlenmeyers de 250 ml con un tapon de gasa y se esteriliza a 20 psi durante 20 minutos. El uso de cloranfenicol es opcional.

Agar agua (WA o AA)

Agar: 20 g.

Para preparar este medio se necesitan 20 gramos de agar y 250 mg/l de antibiotico (tetraciclina, ampicilina o cloranfenicol), los cuales se aforan a 1 litro con agua destilada, se mezclan y se esterilizan a 120 °C y 15 libras de presion por 15 minutos. Una vez esterilizado se dispensa en cajas de petri esteriles o se deja enfriar hasta que solidifique. A este agar no se le determina el pH, dado que al incorporarle otro elemento o compuesto (tratamientos) el pH inicial se pierde y la nueva toma y ajuste de pH provocaria la contaminacion del medio (Ruiz, 2008).

Anexo 3. Protocolo para obtener un cultivo Monosporico

En condiciones asepticas, se hace un raspado del micelio aereo de una colonia previamente crecida a 28°C durante ±8 dias en caja de petri. El raspado se suspende en 10 mL de agua y se homogeniza por vortex. Se toman 10 uL de la suspension y se hace un conteo en camara de Neubauer a 10x. Se ajusta la concentration a 1 conidia/uL. Se toma la alicuota calculada y se ajusta la nueva solution. Se toma un uL y se deposita en cada poso dibujado en el anverso de una caja de petri con Agar agua. Al cabo de 6 horas se verifica la germination de los conidios con microscopio a 10X. Se rescata cada conidio germinado, con el agar circundante, depositando solo un conidio cada nueva caja de petri con medio PDA.

Anexo 4. Protocolo para la preparacion del inoculo en el laboratorio

Preparation del inoculo de F. oxysporum a 104 ufc/mL.

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Procedimiento:

1. Esterilice toda la zona y materiales de trabajo. Si desea trabaje en camara de flujo laminar. Trabaje todo el tiempo junto al mechero. Esterilice el asa cada vez que la use.
2. Tome un trozo de micelio aereo del aislamiento deseado y depositelo en el medio C.D.P. Tape con gasa y algodon, recubre con aluminio y presionelo con un tira elastica. Rotule. Nota: es posible tomar un fragmento de medio agar junto con el micelio, ello no representa problema alguno y si asegura la consecucion de suficiente talo.
3. Lleve a incubacion en Shaker durante 168 horas ± 48 horas (7 dias ± 2 dias). El dictamen de la culminacion del tiempo en Shaker es la presencia de un color purpura- con sus tonalidades- en el medio, acompanado del hongo con aspecto algodonoso y forma discoidal en la superficie y sumergido hasta el fondo con una prolongation a modo de pie. Si el medio esta muy turbio es muy probable la contaminacion bacterial.
4. Despues de 7 dias, tome 100 uL (o hasta 1 mL) de la fase acuosa de cada medio inoculado con el hongo, coloquelo en el portaobjetos, ponga el cubreobjetos y observe a 10x y 40x. En caso de observar contamination repita todo el procedimiento hasta el cuarto punto; en caso contrario continue en cinco.
5. Realice el conteo de macro y microconidios en la camara de Neubauer. Para ello, tome 10 uL de la fase acuosa del C.P.D. (previamente homogenizado por agitation) y coloquelo en el portaobjetos recubierto con la laminilla. Cuente las macro y microconidias ubicadas en los 4 cuadrantes grandes. Promedie la suma de los 64 cuadros que conforman los 4 cuadrantes grandes. Multiplique por 160 (Constante de Neubauer) para obtener el numero de conidias por uL. Calcule el volumen en mililitros de solution necesario para preparar la concentration deseada - en este caso 104 - afore hasta 500 mL.
6. Rotule, selle con aluminio presionado por una tira elastica. Use con la mayor brevedad posible.

Anexo 5. Datos de calibracion del inoculo

Ver DVD adjunto, archivo: TESIS/RESULTADOS/Excel/ Datos de la Calibracion del inoculo

Anexo 6. Protocolo para la inoculacion en invernadero

Se desinfectan las camas y superficies en general del invernadero con hipoclorito de Sodio al 15%.

Inoculacion: Requisitos:

1. Plantulas de mes y medio de vida
2. Sustrato suelo cascarilla de arroz 3:1.
3. Camas de invernadero desinfectadas.
4. Inoculo a 10.000 ufc/mL.

Tabla 25. Materiales para la inoculacion en invernadero. Fuente: Victor Pulido, 2010.

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Procedimiento:

1. Seleccione las plantas mas parecidas en tamano, porte y estado fenologico (muchas veces los individuos sometidos a estres hidrico florecen siendo plantulas). Recuerde que solo se usan las plantas que tengan, como minimo, un par de nomofilos. Sustraiga las plantas del vaso plastico con todo y sustrato
2. Separe la planta del sustrato moliendo este entre los dedos, CUIDANDO NO DANAR LAS RAICES. Vierta el sustrato en un balde plastico.
3. Lave la raiz de la planta con el fin de retirar toda macula o residuo de sustrato
4. Sumerja la raiz en el inoculo por espacio de 3 min. Es recomendable homogenizar el inoculo por batido.
5. Retire del inoculo y recubra con el sustrato. Asperje por 1 min.
6. Repita el procedimiento con todas las plantas a tratar. Es conveniente inocular todas las plantas de una accesion, entrada o variedad a la vez.
7. Las condiciones del invernadero son 70 a 80 % de humedad relativa y 18 a 25 “Celsius.

Anexo 7. Datos de las accesiones

Ver DVD adjunto, archivo: TESIS/RESULTADOS/Excel/ Datos de las accesiones; Y: TESIS/RESULTADOS/Excel/ Promedios y dictamen de resistencia o susceptibilidad.

Esta tesis se hizo bajo las normas ICONTEC: cuerpo del trabajo: NTC 1487 y NTC 1075; Complementos: NTC 1160, NTC 1307, NTC 1308 y NTC 4490, de la sexta version del 2008, ultima revision. (www.icontec.gov.co).

Tunja, 2010.

En mi afan de saberlo todo; en mi afan de conocer mas, me volvi el mas ignorante de los hombres y me cerre al conocimiento.

V.P.

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Detalles

Páginas
173
Año
2010
ISBN (Libro)
9783656747925
Tamaño de fichero
7.6 MB
Idioma
Español
No. de catálogo
v280811
Calificación
5.0
Etiqueta
evaluación physalis fusarium schltdl

Autor

Anterior

Título: Evaluación de la resistencia y susceptibilidad de accesiones élite de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana L.) al hongo "Fusarium oxysporum" Schltdl.