Lade Inhalt...

Proteineblock. Lernzusammenfassung für die Klausur

Prüfungsvorbereitung 2012 5 Seiten

Chemie - Biochemie

Leseprobe

Lernstoff für die Klausur des Proteineblocks

1. Aminosäureanalyse

Techniken:

Reverse-phase-Chromatographie (RPC)

Probenvorbereitung:

Saure Hydrolyse: 6 N HCl, 24h, 110°C

Abwandlungen: Einsatz von scavangern (Antioxidantien) und Inertgasen, Gasphasenhydrolyse im Vakuum, Verwendung organischer Säuren

Alkalische Hydrolyse: selten angewandt, da Verluste durch Barium-Ionen- Ausfällung, spezielle Reaktionsgefäße notwendig

Enzymatische Hydrolyse: selten angewandt, schonend, Gemisch von Proteasen

2. Freie Aminosäuren

Nachsäulederivatisierung:

Ninhydrin:

- bildet mit AS eine Schiffsche Base, AS wird decarboxyliert und hydrolysiert, Aminstickstoff verbleibt am Ninhydrin, Bildung von Ruhemanns Violett mit einem weiteren Ninhydrin (Probleme bei Pro)
- Keine störenden Nebenprodukte!, UV-Absorption des Säuleneluats bei 570 nm (primäre Amine) bzw. 440 nm (sek. Amine), Elution mit Stufengradient
- Quantitativer Nachweis, Rückschluss auf Aminesäure nur durch Eluationszeitpunkt möglich

Fluorescamin:

- pH-Optimum zu hoch und in wässrigen Lösungen instabil ortho-Phthaldialdehyd (OPA):
- reagiert nur mit primären Aminen, Oxidation von sek. Aminen nötig
- Identifizierung der Aminosäure möglich
- UV-Absorption oder Fluoreszensemission (Reagens selbst fluoresziert nicht, stört also nicht)

Vorsäulenderivatisierung:

HPLC und RPC ermöglichen Vorsäulenderivatisierung mit geringen Trennungszeiten und hoher Nachweisempfindlichkeit ortho-Phthaldialdehyd (OPA): s.o.

Phenylisothiocyanat (PITC): s. Edman-Abbau

- Reagiert schnell mit primären und sek. Aminen zum stabilen Phenylthiocarbamoyl- (PTC)-Derivat
- Keine störenden Nebenprodukte für RPC Fluorenylmethoxycarbonyl-(FMOC)-chlorid
- Reagiert sehr schnell mit primären und sek. Aminen zu stabilen Derivaten
- FMOC-Cl hydrolysiert jedoch schnell und muss daher extrahiert werden  AS-Verluste

Dabsyl-Chlorid:

- Reagiert schnell mit primären und sek. Aminen zu wochenlang stabilen Derivaten!
- Absorbiert im Sichtbaren  stabile Basislinie, da Lösem. nicht absorbiert
- Nachteile: Noch keine Automatisierung, relativ genaue Abschätzung der AS-Menge nötig

Dansyl-Chlorid:

- Reagiert mit prim. und sek. Aminen, fluoresziert stark
- Reaktion langsam und unvollständig, Nebenprodukte  kaum angewandt

ACQ:

- Reagiert mit prim. und sek. Aminen, Derivate 1 Woche stabil, RPC, UV

3. Proteinsequenzanalyse

Edman-Abbau: N-terminaler zyklischer Abbau

- PITC reagiert bei pH 9 mit Peptid zu PTC, Spaltung zu ATZ-AS + Peptid
- nach Abdampfen Extraktion durch hydrophobes LM
- Konvertierung der ATZ-AS zur stabileren PTH-AS
- Neuer Reaktionszyklus des verkürzten Peptids
- Nebenprodukte: PITC + H2O = Anilin, Anilin + PITC = DPTU
- Entfernung von NP mit unpolarem LM
- Ausschluss von O2 durch Inertgas  kein Austausch von S durch O, sonst kein PTH
- Empfindlich gegen Salze, Detergienzen, freie AS, unreine Proteine Carboxypeptidasen: C-terminaler enzymatischer Verdau mit Exopeptidasen
- Serinproteasen spalten C-terminale AS ab

4. Massenspektrometrie

a) Ionenquellen

EI (Elektronenstoß-Ionisation) FAB (Fast Atom Bombardment)

ESI (Elektronenspray-Ionisation)

Kapillare (Anode, +) ist mit Massenspektrometer (Kathode, -) verbunden, es entsteht ein elektr. Feld, welches den Flüssigkeitsstrom in der Kapillare durchdringt. Positive Ionen werden an die Oberfläche gezogen, bis das elektr. Feld aufgrund der Umverteilung aufgehoben ist. Positive Ionen der Oberfläche werden weiter zur Kathode gezogen, bilden aufgrund der Oberflächenspannung einen Taylor-Konus aus, von dessen Spitze aus ein feiner Flüssigkeitsstrom Richtung Kathode emittiert wird. Dieser wird in einiger Entfernung zur Anode instabil und zerfällt in Tröpfchen mit positiver Ladung. Das Lösemittel in den Tröpfchen verdampft, die Ladungsdichte nimmt zu bis zur Stabilitätsgrenze (Rayleigh-Limit). Spontaner Zerfall in Mikrotröpfchen (Coulomb-Explosion).

MALDI (Matrix-assitierte Laserdesorption/-ionisation)

Probe wird mit Matrixsubstanz kristallisiert (dried droplet). Matrixsubstanz absorbiert gut bei der verwendeten Laserwellenlänge und schützt Analyten. Bei Laserpuls explosive Freisetzung der positiv geladenen Matrix- und Probenmoleküle in die Gasphase.

b) Analysatoren

TOF (Time of flight)

Messung der Zeit vom Laserimpuls bis zum Eintreffen am Detektor. Ionen werden mit MALDI desorbiert, dann durch Elektrode beschleunigt. Sie durchlaufen dann eine feldfreie Driftstrecke zum Detektor. Leichte Ionen fliegen schneller als schwere Ionen. Auftrennung nach m/z- Verhältnis, welches zum Quadrat der Flugzeit proportional ist.

Ion Trap

Mit Helium gefüllt, um Ionen abzubremsen. Ringelektrode erzeugt Potenzialmulde. Ejition mit Multipolfelder.

c) N-terminale Leiter-Sequenzierung von Peptiden mit MALDI

Kombination aus Edman-Abbau und MALDI-MS. 95% PITC (normaler Abbau) und 5% PIC (PCPeptid, wird nicht mehr abgebaut). Im MS ist der Massenabstand zwischen zwei PC-Peaks gleich der gesuchten AS.

http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biochemie/3559

d) Tandem-MS (MS/MS)

Q1: nur Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhältnis können trasferiert werden Q2: Ionen treffen auf Gasmoleküle und werden fragmentiert Q3: Fragmente werden analysiert

5. Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und Quartärstrukturanalyse

Übersicht der Methoden zur Untersuchung der Quartärstruktur

- Analyse von Protein-Netzwerken
- In vitro
- Hydrodynamische Verfahren (z.B. Gelfiltration)
- Spektroskopische Verfahren (z.B. FRET)
- Kreuzvernetzung („Crosslinking“)
- Immunologische Verfahren (Far-Western Blot)
- „Pulldown“-Verfahren („Tagging“, Immunpräzipitation)
- In vivo
- „Tagging“-Verfahren
- Hefe 2-Hybrid Verfahren (Y2H)
- SILAC
- QUICK

Gelfiltration/Größenausschlusschromatographie

Kleine Moleküle durchlaufen das Gel langsamer als große, weil sie in den Poren zurückgehalten werden.

Quervernetzung/cross-linking

Untereinheiten werden mit cross-linker inkubiert. Es entstehen verschiedene

Vernetzungsprodukte, die Aufschluss über die Interaktionen der Untereinheiten geben. Crosslinker sind mono- (selbe reaktive Gruppe) oder hetero- (verschiedene reaktive Gruppe) bifunktional und besitzen einen unreaktiven Spacer.

Far Western Blot

Protein auf Blot-Membran wird zunächst mit einem getaggten vermuteten Interaktionspartner inkubiert. Der Immunoblot wird dann gegen den Interaktionspartner durchgeführt, sodass nur dort Banden entstehen, wo eine Protein-Protein-Interaktion stattgefunden hat.

Ko-Immunpräzipitation

Sepharosekügelchen werden mit Protein A beschichtet, welches an konstante Ketten von IgG bindet. Antikörper mit Köderprotein („bait“) kann dann mit bestimmten Target-Proteinen („prey“) in der Lösung interagieren und diese binden. Waschen, dann Ablösen durch Kochen in Probenpuffer oder Inkubation mit Peptid-Epitop (Verdrängung des Targetproteins) und Gelelektrophorese. Proteine können getaggt werden, damit ein Antikörper für verschiedene Versuche verwendet werden kann.

Tag-Pulldown

GST-Pulldown

Untersuchung von Interaktion in vitro, da vielleicht vermittelnde Proteine eine Rolle spielen. Zu untersuchende Proteine werden heterolog (in einem anderen Organismus) exprimiert, damit man nicht das vermittelnde Protein C mit isoliert. Herstellung der GST-Fusionproteine: Mit Glutathion beschichtete Sepharosekügelchen werden mit Zellextrakt inkubiert.

Pulldown: Matrix wird mit Protein, welches mit GST interagieren soll, inkubiert. Waschen, kochen in Probenpuffer, SDS-PAGE, Western-Blot

Mögliche Tags:

GST (Glutathion-S-Transferase),35 S-Methionin (radioaktiv), STREP-Tag, TAP-Tag, His6- Tag, Flag-Tag (für in vivo, pulldown mit spezifischem AK)

Two-hybrid-Sytem, Yeast 2-Hybrid (Y2H)

Transkriptionsfaktor: DNA-Bindungsdomäne bindet an upstream-Aktivatorsequenz (UAS) auf

DNA, Aktivierungsdomäne (mit Bindungsdomäne verbunden) löst Transkription aus. Wenn nicht verbunden, keine Transkription.

Bindungs- und Aktivierungsdomänen können in allen möglichen Kombinationen

zusammengesetzt werden, da sie nicht kovalent, sondern nur via Wechselwirkungen verbunden sein müssen. Jetzt wird noch ein Reportergen mit der passenden UAS gefunden werden, dessen Transkription leicht messbar ist, z.B. durch die Menge von translatierten Proteinen. Die Bindungs- und Aktivierungsdomänen binden aber nicht einfach so aneinander, sondern werden mit einem bait- und einem prey-Protein fusioniert. Deren Interaktion bringt beide Transkriptionsfaktordomänen zusammen und bewirkt die Transkription des Reportergens, welche dann nachgewiesen werden kann.

Vor- und Nachteile Y2H

+ Einfache in vivo Methode

+ Für Hochdurchsatz geeignet

+ Analyse der interagierenden Domänen möglich

+ Unbekannte Interaktionspartner durch Zufallsauswahl identifizierbar

- Es kann sich um eine indirekte Interaktion handeln (z.B. weiteres Brückenprotein) 

Überprüfung mit GST-Pulldown o.Ä.

- Die Proteine müssen in den Kern gelangen

- Falsch-Negative:z.B.Membranproteine

- Falsch-Positive: z.B. Transkriptionsfaktoren

SILAC („stable isotope labeling with amino acids in cell culture")

Zwei Zellproben werden parallel kultiviert, eine mit normalen Aminosäuren, die andere mit ein oder zwei isotopensubstituierten Aminosäuren, häufig13 C-Arginin oder -Lysin bzw.2 H-Lysin. Mischen im 1:1 Verhältnis. Bei Proteolyse mit Trypsin sind die isotopensubstituierten AS stets am C-terminalen Ende der Spaltprodukte. Massenverschiebung im Spektrum um 6 bzw. 3 Da  sequenzspezifische Infos

6. Notizen

Zusammensetzung des SDS-Probenpuffers
- Tris/HCl pH 6.8: Puffer
- Saccharose 10 %: beschwert die Probe für den Probenauftrag
- Bromphenolblau: macht den Verlauf der Elektrophorese sichtbar
- SDS 2 %: lagert sich an Proteine an und verleiht negative Ladung
- β-Mercaptoethanol 5 %: reduziert Disulfidbrücken
- Denaturierung durch aufkochen!!

Faktoren für Protein-Kristallisation

- Protein-Reinheit
- Protein-Konzentration
- Präzipitant-Konzentration und dessen Art
- Konzentration, pH und Art des Puffers
- Additive und Effektoren
- Temperatur

Methoden zur Proteinreinigung

- Affinitätschromatographie
- Ionenaustauschchromatographie
- Größenausschlusschromatographie
- Präzipitation
- Elektrophorese

Methoden zur Proteinkonzentration

- Ultrafiltration
- Ammoniumsulfatpräzipitation (Aussalzen)

Proteinkristallisation durch Dampfdiffusion

- Hanging or sitting drop
- Sitting drop: Präzipitanzlösung in Reservoir, einen Tropfen mit einem einem Tropfen Proteinlösung auf dem Stempel mischen
- Wasser aus dem Kristallisationsansatz geht in Gasphase über  erhöhte Konzentrationen von Protein und Präzipitant im Tropfen  Kristall

Warum Multiproteinkomplexe?

- Bildung von großen Funktionseinheiten (z.B. Proteasom - molekulare Kompartimentierung)
- Bei Synthesefehlern ist die Neusynthese eines Riesenproteins aufwändiger als die Neusynthese einer Untereinheit
- Erlaubt fakultative Kooperation zwischen den Untereinheiten
- Spezielle regulative Untereinheiten
- Vermittlung dynamischer Prozesse (z.B. Zellmotilität durch Aktin-Polymerisation)

[...]

Details

Seiten
5
Jahr
2012
ISBN (eBook)
9783656720775
Dateigröße
512 KB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v278389
Institution / Hochschule
Freie Universität Berlin – Institut für Chemie und Biochemie
Note
1,3
Schlagworte
proteineblock lernzusammenfassung klausur

Teilen

Zurück

Titel: Proteineblock. Lernzusammenfassung für die Klausur