Praktikumsbericht Zytogenetik

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Notwendiges theoretisches Vorwissen.
2.1 Die Zytogenetik.
2.2 Der Zellzyklus.
2.3 Chromosomenaberrationen.
2.4 Der Schwesterchromaitdaustausch (SCE)
2.5 Mikrokerne

3. Methoden
3.1 Ansatz einer Blutkultur (Suspensionskultur)
3.2 Präparation von Chromosomen.
3.3 Präparation von CHO (Adhäsionskultur)
3.4 Giemsa-Färbung
3.5 Fluoreszenz-plus Giemsa (FPG) Färbung
3.6 UV-Bestrahlung
3.7 Eindeckeln von Präparaten

4. Experimente und Ergebnisse
4.1 Röntgenstrahlung-Experiment
4.1.1 Auswertung der Chromosomenaberrationen
4.1.2 Auswertung der SCE´s
4.1.3 Auswertung der Mikrokerne
4.1.4 Diskussion der Ergebnisse
4.2 Trenimon-Experiment
4.2.1 Behandlung der Zellkultur mit Trenimon
4.2.2 Auswertung der Chromosomenaberrationen
4.2.3 Auswertung der SCE´s
4.2.4 Auswertung der Mikrokerne
4.2.5 Diskussion der Ergebnisse
4.3 UV-Strahlen-Experiment
4.3.1 Auswertung der Chromosomenaberrationen
4.3.2 Diskussion der Ergebnisse
4.4 Eigenblutansatz

5. Quellen- und Abbildungsverzeichnis

1. Einleitung

Die vorliegende Arbeit dient der Protokollierung des Großpraktikums Zytogenetik, welches im Rahmen des Studiums der Biologie an der Universität Duisburg-Essen vom 18.07.2011 bis zum 29.07.2011 abgeleistet wurde.

Sie beschäftigt sich, wie aus dem Titel bereits zu erkennen ist, mit dem Thema Zytogenetik und ist in drei inhaltliche Kapitel gegliedert.

Das erste, einleitende Kapitel befasst sich mit der Frage, was unter Zytogenetik zu verstehen ist und beschreibt dem Leser in diesem Zusammenhang die wichtigsten, ablaufenden Prozesse und Phänomene, welche für das Verständnis der im dritten Kapitel erläuterten Experimente von zentraler Bedeutung sind. Hierbei ist besonders auf das Unterkapitel zum Zellzyklus hinzuweisen, da dieser für die Zytogenetik von besonderer Relevanz ist.

Im sich anschließenden Kapitel werden die einzelnen Methoden, welche im Praktikum Anwendung fanden, kleinschrittig erläutert. Die jeweiligen Beschreibungen der Methoden sind dabei so ausgelegt, dass sie auch als praktische Arbeitsanleitungen nutzbar sind. Aus diesem Grund enthält jedes Methodenkapitel neben der Beschreibung des Vorgehens auch noch eine Material-/Geräteaufstellung sowie eine detaillierte, tabellarische Aufstellung der Arbeitsschritte.

Das letzte inhaltliche Kapitel gibt dann die im Praktikum durchgeführten Versuche sowie deren Ergebnisse wieder. An dieser Stelle werden dann auch eine ausführliche Diskussion der Ergebnisse zu jedem Experiment sowie ein übergreifender Vergleich der Ergebnisse aus den Experimenten durchgeführt.

2. Notwendiges theoretisches Vorwissen

2.1 Die Zytogenetik

Der Begriff „Zytogenetik“ setzt sich aus dem Präfix „Zyto-“ und dem Nomen „Genetik“ zusammen. Das Präfix „Zyto-“ stammt vom griechischen Wort „kytos“ ab, welches mit Hohlraum bzw. Zelle übersetzt wird.^[1] In Kombination mit dem Wort „Genetik“ bedeutet es dann sinngemäß „Genetik der Zelle“.

Es wäre durch diese ursprüngliche Namensgebung zu vermuten, dass sich die Zytogenetik ausschließlich mit der Abstammung der Zelle und ihrer Vermehrung befasst. Jedoch leistet die Zytogenetik viel mehr als dieses. Die Zytogenetik beschäftigt sich nicht nur mit den Chromosomen, deren Organisation und der Sichtbarmachung dieser Strukturen durch Anfärbung, sondern auch mit der Wirkung von Mutagenen auf die Chromosomenstruktur und den damit verbundenen, möglicherweise auftretenden Beeinträchtigungen des Individuums. So ist die Beteiligung der Zytogenetik an der Aufklärung von strukturellen sowie numerischen Chromosomenveränderungen, letztere werden auch als Genommutationen bezeichnet, von großer Bedeutung. Forschungen auf dem Gebiet der Genommutationen führten beispielsweise zur Entdeckung der Ursachen für Trisomie 21 (Down-Syndrom), für die Monosomie X (Turner-Syndrom) bei Frauen sowie für das Klinefelter-Syndrom bei Männern. Des Weiteren ist die Forschung im Bereich der Zytogenetik daran interessiert, wie sich beispielsweise Röntgen- und UV-Strahlung sowie chemische Substanzen (z.B.: Trenimon), welche zur Therapie von Krebspatienten eingesetzt werden, auf die Chromosomen und somit auf das Individuum selbst auswirken. Das aus diesen Forschungen gewonnene Wissen kann dann für die Herstellung und Verbesserung der Therapiemöglichkeiten sowie der zu verabreichenden Medikamente genutzt werden.

Somit lässt sich feststellen, dass die Zytogenetik eine für den Menschen wichtige Disziplin im Bereich der biologischen Forschung darstellt.

2.2 Der Zellzyklus

Der Zellzyklus ist ein periodischer Prozess von Geschehnissen, welcher zur Reproduktion der jeweiligen Zelle und somit zum Überleben eines Organismus führt. Er wird grob in zwei zentrale Phasen eingeteilt: die Interphase und die Mitose (Zellkernteilung).

Die Interphase lässt sich noch einmal in drei Abschnitte (G₁-, S- und G₂-Phase) unterteilen.

Für G₁-Phase (engl. „gap“ = Lücke) sind ein langes Zellwachstum sowie die Synthese von Proteinen und RNA charakteristisch,^[2] weshalb man zusammenfassend sagen kann, dass in dieser Phase Aufgaben des Stoffwechsels wahrgenommen werden. Am Ende der G₁-Phase befindet sich ein Restriktionspunkt (R), welcher als Kontrollpunkt dient. Er kontrolliert die Zelle darauf, ob die letzte Mitose ordnungsgemäß abgeschlossen wurde, ob die Zelle anschließend in ausreichendem Maße gewachsen konnte und ob die DNA keine Brüche aufweist.^[3] Bei der folgenden Kontrolle spielen spezifische Enzyme, beispielsweise Proteinkinasen, eine wichtige Rolle. Die Proteinkinasen sind in der Lage Proteine zu phosphorylieren, so dass sie eine andere Funktion erhalten. Durch diesen Mechanismus ist es Kinasen möglich Proteine zu steuern. Im Fall des Kontrollpunktes bilden Cyclin-abhängige Proteinkinasen (engl. „cvclin-dependent kinase“, Cdk) zusammen mit dem Protein Cyclin, welches im ganzen Zyklus in unterschiedlichen Konzentrationen synthetisiert wird, einen Komplex.^[4] Der nun entstandene Komplex wird als Mitose-Promotor-Faktor (MPF) bezeichnet. Durch die Entstehung einer bestimmten Konzentration an MPF wird das positive Signal zum Eintritt in die auf die G₁-Phase folgende Synthese-Phase (S-Phase) gegeben. Zellen, welche den Restriktionspunkt aufgrund von Mängeln nicht überschreiten können, verlassen den Zellzyklus und gehen in einen Zustand ohne Zellteilung über. Diesen Zustand nennt man G₀-Phase.^[5]

In der S-Phase angelangt, wird die DNA der Zelle repliziert, sodass jedes Chromosom, welches zuvor aus einer Chromatide bestand, nach der S-Phase aus zwei Chromatiden besteht.^[6]

Anschließend an die S-Phase folgt die G₂-Phase, bei der, genau wie bei der G₁-Phase, Stoffwechselvorgänge und das Wachsen der Zelle im Vordergrund stehen. In der G₂-Phase werden nun jedoch diese auf die Zellteilung vorbereitenden Vorgänge abgeschlossen. Am Ende dieser Phase befindet sich ein weiterer Kontrollpunkt (siehe Abb. 1). Die Zelle wird hier darauf kontrolliert, ob die DNA vollständig repliziert und ob Fehler gegebenenfalls repariert wurden. Besteht die Zelle diese Kontrolle nicht, wird die Apoptose der Zelle eingeleitet. Diese Reaktion ist von besonderer Bedeutung, da sich sonst Zellen mit fehlerhafter DNA ungehindert weiter teilen könnten, so dass die es wahrscheinlicher wird, dass die Zelle entartet. Anders ausgedrückt verhindert die Apoptose die unkontrollierte Proliferation karzinogener Zellen und ist daher ein sehr bedeutender Mechanismus. An der Kontrolle ist, wie bereits oben beschrieben, auch wieder der MPF-Komplex beteiligt. Die Anhäufung der MPF-Faktoren führt hier jedoch zum Verlassen der G₂-Phase und damit zum Eintritt in die Mitose (M-Phase). Während der M-Phase inaktiviert sich der MPF-Komplex selbst, indem ein Prozess in Gang gesetzt wird, der zur Zerstörung des Cyclins führt. Hierbei bleibt jedoch die ebenfalls zum MPF-Komplex gehörende Cyclin-abhängige Kinase unbeschädigt in inaktiver Form in der Zelle erhalten, um im nächsten Zyklus wieder benutzt werden zu können.^[7] Es handelt sich dabei also um eine relativ ökonomische Verwendung von körpereigenen Ressourcen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Kontrollpunkte des Zellzyklus

In der in mehrere Schritte gegliederten Mitose (M-Phase) kommt es nun zur Zell- und Kernteilung. Hierbei werden während der Prophase zuerst die Chromosomen durch Verdichtung und Spiralisierung lichtmikroskopisch sichtbar. Während dieses Vorgangs wird der Spindelapparat, welcher die Verteilung der Schwesterchromatiden im Verlauf der Mitose gewährleistet, außerhalb des Zellkerns gebildet. Die Schwesterchromatiden sowie die Zentromere sind am Ende der Prophase gut zu erkennen.

Damit der ausgebildete Spindelapparat und die kondensierten Chromosomen miteinander in Kontakt treten können, wird nun in der frühen Metaphase die Kernhülle aufgelöst, indem die Lamine der Kernhülle phosphoryliert werden.^[8] Die Chromosomen, welchen nun den stärksten Kondensationsgrad besitzen und somit im Lichtmikroskop am besten sichtbar sind, wandern in die Äquatorialebene und werden dort so angeordnet, dass sich die Spindelfasern des Spindelapparates an den Kinetochoren der Chromosomen anheften können.

In der folgenden Anaphase werden die Schwesterchromatiden durch den Abbau der Spindelfasern, welche an den Kinetochoren angeheftet sind, und durch die Verlängerung polarer Mikrotubuli zu den beiden Polen des Spindelapparats gezogen und somit voneinander getrennt. Außerdem wird das MPF inaktiviert, wodurch Cyclin nicht mehr benötigt und somit abgebaut wird.

Der letzte Schritt der Mitose, die Telophase, zeichnet sich dadurch aus, dass die beiden entstandenen Tochterchromosomen, so werden die Chromatiden nun genannt, entspiralisiert werden, die Nukleolii wieder erscheinen und die Kernhülle wieder aufgebaut wird.^[9]

Am Ende der Mitose befindet sich ein weiterer Kontrollpunkt. An diesem werden die Chromosomen auf die ordnungsgemäße Trennung voneinander geprüft.

Anschließend an die Mitose findet die Zytokinese statt, bei welcher die zwei voneinander getrennten Zellen mit jeweils einem Kern entstehen. Dies geschied bei tierischen Zellen durch kontraktile Ringe aus Aktin- und Myosinfilmenten, welche sich um die Kerne zusammenziehen bis der Zytoplasmaleib abgeschnürt wurde. Nun können die Zellen wieder in die Interphase eintreten und den Zellzyklus ein weiteres Mal durchschreiten.

Abschließend ist zum Zellzyklus noch zu erwähnen, dass die Dauer des Zyklus von mehreren Faktoren, wie beispielsweise dem Zelltypus und dem Organismus, abhängig ist. Hierbei ist jedoch generell festzustellen, dass die Interphase einen längeren Zeitabschnitt benötigt als die Mitose.

2.3 Chromosomenaberrationen

Chromosomenaberrationen oder Chromosomenmutation sind Veränderungen der Chromosomenstruktur oder anders ausgedrückt sind sie „dauerhafte Veränderungen der linearen Kontinuität von Chromosomen“.^[10] Je nach Art der Aberration kann können diese Konsequenzen für den Mutationsträger oder aber für seine Nachkommen haben. Handelt es sich bei den durch Aberrationen geschädigten Zellen um somatische Zellen (Körperzellen), so wird ersteres zutreffend sein.

Im Bezug auf die nachfolgenden Auswertungen der durchgeführten Experimente ist davon auszugehen, dass die Schäden meist (abgesehen vom UV-Strahlen-Experiment) die Mutationsträger selbst betreffen. Des Weiteren werden die sechs auszuwertenden Aberrationen, welche im weiteren Verlauf immer wieder genannt werden, im Folgenden kurz erläutert:

Einfache Brüche (Bʹ):

Unter Bʹ versteht man die abgebrochenen Stücke eines Schwesterchromatiden, wobei der andere Chromatid unversehrt bleibt (siehe Abb. 2). Meist bleiben die die abgebrochenen Stücke in der Nähe des anderen Chromatiden, da die vorhandenen Proteinverbindung zwischen den Schwesterchromatiden nicht gelöst wurde.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Chromatidbrüche (Einfache)

Doppelstrangbrüche (Bʺ):

Bei dieser Aberration handelt es sich um einen Doppelstrangbruch, auch Isochromatidbruch genannt.^[11] Er unterscheidet sich von einem Einfachen Bruch in der Tatsache, dass die Chromatiden an einer homologen Stelle gebrochen sind. Jedoch müssen Bʺ nicht immer sofort als solche erkennbar sein, da die Möglichkeit besteht, dass sich die beiden Bruchstücke kombinieren.^[12] Diese Kombination sieht dann nicht mehr nach einem typischen Bʺ aus (siehe Abb. 3 r,s).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Doppelstrangbrüche

Dizentrisches Chromosom (Diz):

Ein dizentrisches Chromosom ist ein Chromosom, welches zwei Zentromere besitzt. Es entsteht immer dann, wenn durch eine Translokation in der S-Phase zwei Chromatinfäden miteinander verbunden werden.^[13]

Trizentrisches Chromosom (Triz):

Im Prinzip ist ein trizentisches Chromosom das gleiche wie ein dizentrisches Chromosom. Der einzige Unterschied besteht darin, dass ein trizentisches Chromosom drei Zentromere aufweist anstatt nur zwei. Die Entstehung verläuft jedoch identisch.

Double minute (DM):

Double minutes sind „kleine Chromatinkugeln ohne Zentromere“^[14] (siehe Abb. 4) und sind Produkte des Replikationsprozesses. Ihr Fortbestand als Anteil des Chromosomensatzes kommt aufgrund der nicht korrekten Verteilung auf die Tochterzellen während der Mitose zustande, indem sie als Doppelstruktur, welche an den normal entwickelten Chromosomen haftet, zu den Polen gezogen werden.^[15]

Ringchromosom (Ring):

Ringchromosomen sind Chromosomen, welche, wie der Name bereits aussagt, aussehen wie ein Ring (siehe Abb. 5). Sie entstehen „durch zwei Brüche mit Ringschluß im selben Chromosom“^[16] und sind sehr instabil, sodass sie während der Mitose häufig verloren gehen.^[17] Dementsprechend selten ist das auffinden eines Ringchromosoms, welche im Folgenden kurz als Ring betitelt werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Double minute

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Ringchromosom

2.4 Der Schwesterchromaitdaustausch (SCE)

Unter Schwesterchromatidaustauschen (SCE,sister chromatid exchange) versteht man reziproke, symmetrische Austausche homologer Segmente zweier genetisch identischer Schwesternchromatiden eines Chromosoms.^[18]

SCE´s können in normalen Zellen in einer sehr geringen Anzahl vorkommen und treten spontan auf. Der genau molekulare Mechanismus, welcher zur Entstehung dieser SCE`s führt, ist bis heute leider noch ungeklärt. Jedoch wurden verschiedene Theorien aufgestellt. Diese besagen, dass sich SCE´s als Reparaturereignisse (nach Kato 1977), als Mechanismus, der Replikation unter Umgehung eines DNA-Schadens (nach Shafer 1977) oder als Ereignis, welches nicht mit einer Reparatur in Verbindung steht (nach Painter 1980), bilden.^[19]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: SCE´s nach BrdU-Behandlung & FPG- Färbung (gesunde vs. geschädigte Zelle)

Im Gegensatz zu dem Wissen über die genaue Entstehung von SCE`s, ist das Wissen, wie man SCE´s sichtbar macht und somit nachweist, bereits vorhanden. Die gängigste Methode dazu ist der Einbau von BrdU (Bromdesoxyuridin) anstelle des Stoffes Desoxythymidintriphosphat (dTTP), welches in der DNA normalerweise vorkommt. Anschließend werden die Zellen präpariert und mit der FPG-Färbung, welche noch in Kapitel 3.5 ausführlich behandelt wird, angefärbt. Die Stellen, an welche BrdU eingebaut wurde, erscheinen nun schwächer gefärbt als die Stellen mit dTTP (siehe Abb. 6).

Heute weiß man des Weiteren, dass SCE´s erst ab der M2-Phase trotz vorherigem BrdU-Einbaus sichtbar werden, da das BrdU eine komplette S-Phase benötigt um sich korrekt einzubauen. Somit sind in der M1-Phase 0% helle und 100% dunkle Chromatiden auffindbar, obwohl BrdU bereits anwesend ist. Ab der M2-Phase werden dann 50% helle sowie 505 dunkle Chromatiden sichtbar. Das Verhältnis zwischen hellen und dunklen Chromatiden verschiebt sich nun während jedes weiteren Zellzyklus immer weiter in Richtung heller Chromatiden. Dies geschied indem sich der prozentuale Anteil der dunklen Chromatiden bei jedem Durchgang des Zellzyklus um die Hälfte verringert (siehe Abb. 7), d.h. in der M3-Phase sind nur noch 25% der Chromatiden dunkel und in der M4-Phase trifft dies nur noch auf 12,5% zu. Anhand dieses wissen lassen sich nun auch die verschiedenen M-Phasen eindeutig erkennen und ordnen.

Um jedoch mutagene Wirkungen detektieren zu können, muss ein Verfahren entwickelt worden sein, welches sich die SCE´s vorteilhaft zu Nutze macht. Dieses Verfahren nennt sich, in Anlehnung an die SCE´s, SCE-Test. Bei diesem Test werden die verschiedenen Farbwechsel innerhalb eines Chromosomensatzes gezählt und für jede aufgefundene M2-Phase Zelle protokolliert, sodass am Ende eine konkrete Einschätzung über den Zusammenhang eines Mutagens und den aufgefundenen SCE´s gegeben werden kann.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Färbung der Schwesterchromatiden nach BrdU-Behandlung

2.5 Mikrokerne

Als Mikrokerne werden ehemalige Bestandteile des Zellkerns bezeichnet, welche bei der Zellteilung nicht in die beiden Tochterzellkerne verteilt werden konnten. Die bei dieser fehlerhaften Zellteilung zurückgebliebenen Chromatinstrukturen kondensieren zu Mikrokernen, welche dann als zellkernähnliche Struktur im Cytoplasma erscheinen.

Mikrokerne unterscheiden sich von normalen Zellkernen hauptsächlich durch ihre geringe Größe (siehe Abb. 8), da sie ansonsten alle Eigenschaften des Zellkerns ebenfalls besitzen.

Mikrokerne können immer dann entstehen, wenn eine Schädigung des Spindelapparates vorhanden ist. Ist beispielsweise bei Chromosomen der Kinetochor in der Zentromerregion nicht ausgebildet oder ist dieser Defekt, kommt es zur Bildung eines Mikrokerns, da die Mikrotubuli nicht am Zentromer andocken und somit die Schwesterchromatiden nicht auseinandergezogen werden können. Die Schwesterchromatiden verbleiben dann in der Äquatorialebene, sodass sich letztendlich eine Kernhülle um diese bildet. Ähnlich verläuft der Prozess bei aufgetretenen Brüchen und Doppelstrangbrüchen, welche aufgrund des Verlustes des Zentromers nicht mehr auf die Tochterzellen verteilt werden können. Diese Brüche verbleiben ebenfalls in der Äquatorialebene und es bildet sich eine Kernhülle aus. Je nach örtlicher Lage der Brüche und Chromosomen, entstehen unterschiedlich viele Mikrokerne aus Brüchen, kompletten Chromosomen oder Gruppen von Chromosomen.

Wichtig zu erwähnen ist das die Zellteilung am Ende des Zellzyklus als Voraussetzung für die Bildung von Mikrokernen gilt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8: Mikrokern

Da Mikrokerne also das Resultat von Defekten der Zelle darstellen, können sie zur Erkennung von DNA-Schäden auf chromosomaler Ebene in der sich teilenden Zelle genutzt werden. Das Verfahren, welches mit diese Erkenntnis nutzt, wird als Mikrokern-Test bezeichnet.

Mit dem Mikrokern-Test lassen sich also alle Zellen identifizieren, welche nicht mehr in der Lage sind das Erbmaterial gleichmäßig auf die Tochterzellen zu verteilen.^[20] Es werden zwei verschiedene Effekte unterschieden. Zum Einen kann festgestellt werden, ob Brüche der DNA aufgetreten sind (klastogener Effekt), und zum Anderen können Veränderungen in der Anzahl der Chromosomen (aneugener Effekt) beobachtet werden.^[21]

Der Test zeichnet sich besonders durch seine einfache und schnelle Durchführung aus, sodass mit ihm große Testgruppen auf Mutagenität^[22] getestet werden können. Häufige Einsatzgebiete sind die biologische Dosimetrie nach Strahlenunfällen und die Überwachung von beruflich strahlenexponierten Personen. Des Weiteren wird der Test zur Ermittlung von Stoffen, die Chromosomenschäden verursachen, und zur Bestimmung des Strahlenrisikos bei Embryonen genutzt.

[...]

---

^[1] JANNING, Wilfried/ KNUST, Elisabeth (2008): Genetik. Allgemeine Genetik- Molekulare Genetik- Entwicklungsgenetik. 2. Vollständig überarbeitete und erweiterte Auflage. Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag S. 497

^[2] JANNING/KNUST (2008), S. 14

^[3] CAMPBELL, Neil A./ REECE, Jane B. (2006): Biologie. 6., aktualisierte Auflage. München [u.a.]: Pearson Studium. S. 264

^[4] Ebd., S. 265

^[5] Ebd., S. 265

^[6] TRAUT, Walther (1991): Chromosomen. Klassische und molekulare Genetik. 1.Auflage. Heidelberg [u.a.]: Springer-Verlag. S. 10

^[7] CAMPELL/REECE (2006), S. 264

^[8] JANNING/KNUST (2008), S. 21

^[9] Ebd., S. 22

^[10] JANNING/KNUST (2008). S.109

^[11] SPERLING, Karl (1968): Untersuchungen zum Einfluss von Trenimon auf die Chromosomen und den Generationszyklus menschlicher Lymphozyten in vitro. Dissertation. Freie Universität Berlin. S. 20

^[12] Ebd., S.21

^[13] TRAUT (1991), S. 52

^[14] TRAUT (1991), S. 54

^[15] TRAUT (1991), S. 55

^[16] TRAUT (1991), S. 50

^[17] TRAUT (1991), S. 50

^[18] SCHUNK, Christian (1997). Zur Entstehung von Schwesterchromatidenaustauschen und Chromosomenaberrationen. Experimente mit verschiedenen DNS-Doppelstrangbruch-induzierenden Agenzien. 1. Auflage. Berlin: Logos Verlag.

^[19] JÜTTE, Sarah (2011): Präsentation SCE´s

^[20] WELGE, Peter: Mikrokerntest. <http://www.ipa.ruhr-uni-bochum.de/pdf/06_02_bgfa_info_mikrokern.pdf > (Zugriff 12.12.2011)

^[21] Ebd.

^[22] TRAUT (1991), S. 178