Flavonoide in Zitronensaft. Stabilität und antioxidative Wirkung

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung

2. Theoretischer Hintergrund
2.1 Die Zitrone
2.1.1 Allgemeines
2.1.2 Zusammensetzung
2.1.3 Industrielle Verwendung
2.2 Flavonoide
2.2.1 Struktur und Vorkommen
2.2.2 Metabolismus
2.2.3 Antioxidative Aktivität und gesundheitsfördernde Effekte
2.3 Aminosäuren
2.4 Problemstellung

3. Material und Methoden
3.1 Chemikalien
3.2 Geräte
3.2.1 Chromatographische Anlagen
3.2.2 Sonstige Geräte
3.3 Methoden
3.3.1 Herstellung des Zitronensaftes
3.3.2 Untersuchungen zur Stabilität der Flavonoide
3.3.2.1 Stabilität bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen
3.3.2.2 Stabilität bei Erhitzung
3.3.2.3 Stabilität bei Bestrahlung mit UV-Licht
3.3.2.4 Stabilität bei Veränderung des pH-Wertes
3.3.2.5 Qualifizierung der Flavonoide im Zitronensaft
3.3.2.6 Herstellung der Flavonoid-Kalibrierlösungen
3.3.2.7 Quantifizierung der Flavonoide
3.3.2.8 Identifizierung der Flavonoide mittels HPLC-MS
3.3.3 Herstellung und Fraktionierung eines aufkonzentrierten Flavonoidextraktes
3.3.4 Bestimmung der antioxidativen Aktivität der Flavonoide im Zitronensaft
3.3.4.1 Messung der antioxidativen Kapazität mittels TEAC-Assay
3.3.4.2 Messung der antioxidativen Kapazität mittels HPLC-online TEAC
3.3.5 Reaktionen der Flavonoide mit Aminosäuren
3.3.5.1 Prinzip der Derivatisierung von Aminosäuren mittels OPA/3-MPA
3.3.5.2 Herstellung der Reagenzien
3.3.5.3 Optimierung einer HPLC-Methode mit Vorsäulenderivatisierung zur Aminosäureanalytik
3.3.5.4 Probenvorbereitung
3.3.5.5 Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft
3.3.5.6 Herstellung der Aminosäure-Kalibrierlösungen
3.3.5.7 Quantifizierung der Aminosäuren und Flavonoide
3.3.5.8 Identifizierung möglicher Addukte mittels HPLC-MS
3.4 Statistik

4. Ergebnisse und Diskussion
4.1 Vorversuche
4.1.1 Qualifizierung der Flavonoide im Zitronensaft
4.1.2 Methodenentwicklung zur Extraktion der Flavonoide aus dem Rückstand nach Zentrifugation des Zitronensaftes
4.1.3 Bestimmung der Flavonoid-Gesamtkonzentrationen im Zitronensaft
4.2 Stabilität der Flavonoide
4.2.1 Stabilität bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen
4.2.2 Stabilität bei Erhitzung
4.2.3 Stabilität bei Bestrahlung mit UV-Licht
4.2.4 Stabilität bei Veränderung des pH-Wertes
4.3 Flavonoid-Fraktionierung aus einem aufkonzentrierten Flavonoidextrakt
4.4 Antioxidative Aktivität der Flavonoide im Zitronensaft
4.4.1 Bestimmung der antioxidativen Aktivität mittels TEAC-Assay
4.4.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität mittels HPLC-online TEAC
4.5 Reaktionen der Flavonoide mit Aminosäuren
4.5.1 Optimierung einer HPLC-Methode mit Vorsäulenderivatisierung zur Aminosäureanalytik
4.5.2 Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft
4.5.3 Quantifizierung der Flavonoide und Aminosäuren bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen sowie Identifizierung möglicher Addukte

5. Zusammenfassung und Fazit

Literaturverzeichnis

Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Strukturformel des Flavan-Grundgerüsts

Abbildung 2: Molekulare Strukturen der einzelnen Flavonoidklassen

Abbildung 3: Molekulare Strukturen der Zitrusflavonoide

Abbildung 4: Fischer-Projektionsformel von L-α-Aminosäuren

Abbildung 5: Beispielhafter Aufbau des HPLC-online TEAC

Abbildung 6: Reaktionsschema von primären Aminosäuren mit OPA und 3-MPA

Abbildung 7: Chromatogramme dreier Flavonoidextrakte von SPE-Nullproben

Abbildung 8: Ermittelte Konzentrationen durch sechsmalige Extraktion der Flavonoide aus dem Zentrifugationsrückstand

Abbildung 9: Chromatogramme der sechs Extrakte aus dem Rückstand der Saftproben nach Zentrifugation

Abbildung 10: Ermittelte Flavonoidkonzentrationen in einer Zitronensaft-Nullprobe

Abbildung 11: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Lagerung des Zitronensaftes bei Raumtemperatur

Abbildung 12: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Lagerung des Zitronensaftes bei 4 °C

Abbildung 13: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen im Saft durch Lagerung des Zitronensaftes bei Raumtemperatur

Abbildung 14: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen im Saft durch Lagerung des Zitronensaftes bei 4 °C

Abbildung 15: Veränderung der Konzentrationen von Flavonoid-Standardsubstanzen durch Erhitzung

Abbildung 16: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen im Zitronensaft durch Pasteurisierung

Abbildung 17: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen im Zitronensaft nach Langzeiterhitzung

Abbildung 18: Vergleich der Flavonoidextraktion über SPE und durch Direktextraktion mittels Ethylacetat

Abbildung 19: Veränderung der Konzentrationen von Flavonoid-Standardsubstanzen bei einer Bestrahlung mit UV-Licht

Abbildung 20: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch UV-Bestrahlung des Zitronensaftes

Abbildung 21: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Neutralisation des Zitronensaftes

Abbildung 22: Chromatogramm zur Flavonoid-Fraktionierung aus dem aufkonzentrierten SPE-Flavonoidextrakt

Abbildung 23: Chromatogramm zur Flavonoid-Fraktionierung aus dem aufkonzentrierten Rückstands-Flavonoidextrakt

Abbildung 24: Vergleich der antioxidativen Aktivität des Gesamt-Zitronensaftes und der Flavonoidextrakte

Abbildung 25: Antioxidative Kapazitäten der untersuchten Zitrusflavonoide

Abbildung 26: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Lagerung des Zitronensaftes

Abbildung 27: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Pasteurisierung des Zitronensaftes

Abbildung 28: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Langzeiterhitzung des Zitronensaftes

Abbildung 29: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch UV-Bestrahlung des Zitronensaftes

Abbildung 30: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Neutralisation des Zitronensaftes

Abbildung 31: Chromatogramm des HPLC-online TEAC eines Flavonoid-Standards (Eriocitrin, Hesperidin, Rutin)

Abbildung 32: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines Flavonoid-Standards (Diosmin)

Abbildung 33: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines SPE-Flavonoidextraktes

Abbildung 34: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines Rückstands-Flavonoidextraktes

Abbildung 35: Durch HPLC-online TEAC ermittelte antioxidative Aktivität von Eriocitrin

Abbildung 36: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE-Flavonoidextrakten bei Lagerung des Zitronensaftes

Abbildung 37: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE-Flavonoidextrakten Pasteurisierung des Zitronensaftes

Abbildung 38: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE-Flavonoidextrakten bei Langzeiterhitzung des Zitronensaftes

Abbildung 39: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE-Flavonoidextrakten bei UV-Bestrahlung des Zitronensaftes

Abbildung 40: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE-Flavonoidextrakten bei Neutralisation des Zitronensaftes

Abbildung 41: Chromatogramm des Aminosäurestandard-Mixes unter den HPLC-Methodenbedingungen der Originalmethode an der Shimadzu-Anlage

Abbildung 42: Chromatogramm des Aminosäurestandard-Mixes unter den optimierten HPLC-Methodenbedingungen an der Shimadzu-Anlage

Abbildung 43: Chromatogramm aller detektierbaren Aminosäuren unter den optimierten HPLC-Methodenbedingungen an der Jasco-Anlage

Abbildung 44: Chromatogramm der 1. Fraktion einer SPE-Nullprobe zur Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft

Abbildung 45: Beeinflussung der Flavonoid- und Alaninkonzentrationen der Einzel-Modellproben durch Erhitzung und pH-Wert-Änderung

Abbildung 46: Chromatogramm der HPLC-Analyse der Eriocitrin-Modellprobe

Abbildung 47: Veränderung der Eriocitrin- bzw. Hesperidin- und Alaninkonzentration durch Reaktion bei unterschiedlichen Bedingungen

Abbildung 48: Veränderung der Rutin- bzw. Diosmin- und Alaninkonzentration durch Reaktion bei unterschiedlichen Bedingungen

Abbildung 49: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen bei Erhitzung und pH-Wert-Änderung des Zitronensaftes

Abbildung 50: Veränderung der Aminosäurekonzentrationen im Zitronensaft durch Erhitzung und pH-Wert-Änderung

Abbildung 51: Chromatogramm-Ausschnitt der 1. Fraktion einer SPE-Nullprobe (Dreifachbestimmung)

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Hauptbestandteile von frischgepresstem Zitronenmuttersaft

Tabelle 2: Antioxidative Strukturmerkmale der Zitrusflavonoide Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin

Tabelle 3: Aminosäuregehalte in Citrus medica L

Tabelle 4: Verwendete Chemikalien mit Angabe des Reinheitsgrades und Hersteller

Tabelle 5: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäure- und Flavonoidanalytik)

Tabelle 6: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäureanalytik)

Tabelle 7: HPLC-Anlage mit Diodenarray-Detektor (DAD) und Massenspektrometer (MS)

Tabelle 8: HPLC-Anlage mit UV/VIS-Detektor und online TEAC-Messung

Tabelle 9: Verwendete Geräte mit Angabe des Herstellers

Tabelle 10: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoidanalytik

Tabelle 11: Pipettierschema für Herstellung der Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik

Tabelle 12: Pipettierschema für Herstellung der Diosmin-Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik

Tabelle 13: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoididentifizierung

Tabelle 14: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoid-Fraktionierung

Tabelle 15: Pipettierschema für Herstellung der Trolox-Kalibrierlösungen

Tabelle 16: Methodenbedingungen für HPLC-online TEAC

Tabelle 17: HPLC-Methodenbedingungen für Aminosäureanalytik (Originalmethode) an Shimadzu-Anlage

Tabelle 18: Optimierte HPLC-Methodenbedingungen für Aminosäureanalytik an Jasco-Anlage

Tabelle 19: Pipettierschema für Herstellung der Stammlösung (Standard 4) für Kalibrierung zur Aminosäureanalytik

Tabelle 20: Pipettierschema für Herstellung der Kalibrierlösungen 1-3 zur Aminosäureanalytik

Tabelle 21: HPLC-Methodenbedingungen zur Identifizierung möglicher Aminosäure-Flavonoid-Addukte

Tabelle 22: Ermittelte Konzentrationen durch sechsmalige Extraktion der Flavonoide aus den Zentrifugationsrückstand einer Nullprobe

Tabelle 23: Vergleich der Hesperidinkonzentrationen in den Rückständen zweier Nullproben durch sechsmalige Extraktion

Tabelle 24: Vergleich der in verschiedenen Studien ermittelten Flavonoidgehalte in handgepresstem Zitronensaft

Tabelle 25: Flavonoidgehalte nach Lagerung des Zitronensaftes bei verschiedenen Lagerungsbedingungen

Tabelle 26: Flavonoidgehalte nach Pasteurisierung des Zitronensaftes

Tabelle 27: Flavonoidgehalte nach Erhitzung des Zitronensaftes im Trockenschrank

Tabelle 28: Flavonoidgehalte nach UV-Bestrahlung des Zitronensaftes

Tabelle 29: Flavonoidgehalte nach Neutralisation des Zitronensaftes

Tabelle 30: In den gesammelten Peak-Fraktionen ermittelte Flavonoidkonzentrationen

Tabelle 31: Optimierte HPLC-Methodenbedingungen zur Aminosäureanalytik an Shimadzu-Anlage

Tabelle 32: Veränderung der Flavonoid- und Alaninkonzentrationen der Einzel-Modellproben durch Erhitzung und pH-Wert-Änderung

Tabelle 33: Flavonoidgehalte bei Erhitzung und pH-Wert-Erhöhung des Zitronensaftes

Tabelle 34: Aminosäurekonzentrationen bei Erhitzung und pH-Wert-Erhöhung des Zitronensaftes

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

Ernährungswissenschaftliche Studien empfehlen die regelmäßige Aufnahme von Obst und Gemüse, um eine gesunde Lebensqualität zu erlangen und aufrechtzuerhalten. Die gesundheitsfördernden Effekte von Obst und Gemüse gehören zu den am intensivsten untersuchten Themen der Ernährungswissenschaft. Eine Erhöhung der Obst- und Gemüsezufuhr korreliert u. a. mit einer Verminderung des Risikos für kardiovaskuläre und degenerative Erkrankungen, Krebs und Funktionsverluste in Zusammenhang mit Alterungsprozessen. Auch wenn Obst und Gemüse reich an Vitaminen und Mineralstoffen sind, liegt der derzeitige Forschungsschwerpunkt auf der Untersuchung der Wirkungen von sekundären Pflanzenstoffen. Zu diesen - für die Pflanze nicht essentiellen - Inhaltsstoffen zählen unter anderem Flavonoide, Phytoöstrogene, Stilbene, Glucosinolate, nicht-nutritive Carotinoide und andere Terpene. Zitrusfrüchte und daraus hergestellte Produkte stellen gute Quellen für diese gesundheitsfördernden Komponenten dar und werden weltweit konsumiert. Flavonoide gehören zu den wichtigsten sekundären Pflanzenstoffen in Zitrusfrüchten und ihre positiven Wirkungen sind vermehrt Gegenstand der aktuellen Forschung. Ursachen für die gesundheitsfördernden Effekte der Flavonoide sind vermutlich ihre antioxidative Wirkung, die Interaktion mit Proteinen und das Eingreifen in Signalwege des Stoffwechsels. Die genauen Mechanismen der Flavonoidwirkung konnten jedoch noch nicht aufgeklärt werden. Abgesehen von der physiologischen Bedeutung der Zitrusflavonoide spielen sie auch in kommerzieller Hinsicht eine wichtige Rolle, da sie in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie als natürliche funktionelle Rohstoffe eingesetzt werden [1, 2].

Die Zitrone stellt die am meisten verarbeitete Zitrusfrucht dar, ihr Saft dient als Basis für viele Getränke. Der heutige Getränkemarkt unterliegt einer Veränderung, bei der traditionelle Getränke immer mehr von funktionellen Getränken abgelöst werden. Letztere sind Kombinationen aus traditionellen Getränken, Fruchtsäften und bioaktiven Bestandteilen mit potentiellen gesundheitsfördernden Effekten. Aufgrund des hohen Gehaltes an sekundären Pflanzenstoffen steht Zitronensaft als Komponente funktioneller Getränke zunehmend im Fokus der Lebensmittelindustrie. Weiterhin ist Zitronensaft erforderlich für die Zubereitung zahlreicher Lebensmittel, z. B. für Salatsoßen, Gemüse- und Fleischgerichte, Backwaren oder Speiseeis [3, 4, 5].

Vor diesem Hintergrund ist von Interesse, ob gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe im Zitronensaft durch Verarbeitungsprozesse beeinflusst werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung der Stabilität von Zitrusflavonoiden. Dabei sollen die Auswirkungen unterschiedlicher Behandlungsmethoden des Zitronensaftes auf den Gehalt an Flavonoiden, deren antioxidative Kapazität sowie die Reaktionen von Flavonoiden mit anderen Inhaltstoffen untersucht werden.

2. Theoretischer Hintergrund

2.1 Die Zitrone

2.1.1 Allgemeines

Die Zitrone (Citrus limon (L.) Burm. f.) stellt mit einer Jahresproduktion von ca. 6 Millionen Tonnen (2010) nach Orange und Mandarine die drittwichtigste Citrus Art dar. Kultiviert werden die Früchte hauptsächlich in Mexiko, Argentinien und den Mittelmeerländern der Europäische Union[6]. Ihren Ursprung hat die Zitrone in Asien, vermutlich in der Punjabregion in Pakistan und Indien. Bereits vor Jahrhunderten wurde sie in Südostasien und Europa verbreitet, Amerika erreichte sie erst im Mittelalter. Botanisch gesehen ist die ovale, ca. 7-12 cm lange Frucht mit einer charakteristischen warzenartigen Erhebung am Ende eine Beere. Die äußere Fruchtwand, das Flavedo, ist durch Carotinoide gelb oder orange gefärbt, das innere, zur Reife eher trockene und schwammige weiße Gewebe wird als Albedo bezeichnet. Das sehr saftige und saure Fruchtfleisch weist eine blassgelbe Farbe auf. Zitronenbäume sind kleine, immergrüne Bäume, die gleichzeitig blühen und fruchten. Die Hauptblütezeit ist im Frühling, sie blühen jedoch das ganze Jahr immer wieder. Je nach Erntezeitpunkt werden unterschiedliche Typen von Exportzitronen unterschieden, die sich in Fruchtform, Schalendicke und Saftgehalt unterscheiden. Limoni werden von Dezember bis Juni geerntet, Verdelli von Juni bis September und Primofiori von Oktober bis April [3, 4, 7].

2.1.2 Zusammensetzung

Frisch gepresster Zitronenmuttersaft besitzt einen Energiegehalt von 114 kJ/100 g. Hauptbestandteil des Zitronensaftes ist Wasser, außerdem sind verwertbare Kohlenhydrate sowie Fruchtsäuren in nennenswerten Mengen vorhanden[8]. Die genauen Mengenangaben der Inhaltsstoffe in 100 g essbarem Anteil sind in folgender Tabelle aufgeführt.

Tabelle 1: Hauptbestandteile von frischgepresstem Zitronenmuttersaft (in g/100 g essbarem Anteil) [8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Des Weiteren sind Zitronen reich an wichtigen natürlichen bioaktiven Komponenten, darunter phenolische Verbindungen, Vitamine, Mineralstoffe, Ballaststoffe, organische Säuren, ätherische Öle und Carotinoide. Durch die gesundheitsfördernden Effekte dieser Inhaltsstoffe stellen Zitronen einen wichtigen Bestandteil einer ausgewogenen Ernährung dar[5].

2.1.3 Industrielle Verwendung

Die Zitrone zählt zu den nützlichsten und vielseitig verwendbaren Früchten. Ihr Saft wird u. a. für Salatsoßen, Marinaden, Mayonnaise, Getränke, Speiseeis und Sorbet verwendet. Durch dünnes Abschälen oder Abreiben der Schale wird die sogenannte Zeste erhalten, die zum Aromatisieren von Süßigkeiten, Torten, Schaumspeisen und Cremes verwendet wird. Die kandierte Zitronenschale, das Zitronat, ist eine beliebte Backzutat. Das in der Fruchtschale vorhandene ätherische Öl findet Einsatz in der Parfümerie bzw. in Kosmetika. Weiterhin werden industriell gewonnene chemische Extrakte von bioaktiven Inhaltsstoffen der Zitrone Lebensmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika zugesetzt. Viele Nebenprodukte der Zitronensaftherstellung werden als funktionelle Inhaltsstoffe für die Entwicklung funktioneller Lebensmittel genutzt. Hierzu zählen beispielsweise Ballaststoffe, Flavonoide und Ascorbinsäure. Insbesondere die Getränkeindustrie ist heutzutage an den bioaktiven Inhaltsstoffen des Zitronensaftes interessiert. Die Entwicklung funktioneller Getränke mit einem potentiellen gesundheitlichen Zusatznutzen liegt zunehmend im Trend und Zitronensaft bietet mit seiner Vielfalt an gesundheitsfördernden Komponenten die ideale Zutat für diese Getränke. Durch den Zusatz von Zitronensaft zu traditionellen Getränken erhöht sich der Gehalt an Antioxidantien, wodurch „antioxidantienreiche“ funktionelle Getränke entstehen. Aus dem Albedo der Zitrone lassen sich Ballaststoffe gewinnen, die u. a. bei der Produktion von Pharmazeutika zur Verbesserung der Konsistenz eingesetzt werden können. Eine weitere wichtige Rolle in der Lebensmittelindustrie kommt dem aus der Zitronenschale gewonnenen Pektin zu. Dieses wird in einer Vielzahl von Lebensmitteln als Geliermittel, Verdickungsmittel oder Stabilisator eingesetzt [3, 4, 5].

2.2 Flavonoide

2.2.1 Struktur und Vorkommen

Flavonoide zählen zu den niedermolekularen sekundären Pflanzenmetaboliten, die im Vergleich zu primären Metaboliten nicht essentiell für das Überleben der Pflanze sind. Sie sind die am weitesten verbreitete und vielfältigste Gruppe innerhalb der phenolischen Verbindungen, eine der Hauptgruppen der sekundären Pflanzenstoffe. Phenolische Verbindungen besitzen sehr vielfältige Strukturen, bestehen jedoch im Allgemeinen aus einem (mono- oder poly-)aromatischen Ringsystem mit einem oder mehreren Hydroxyl-Substituenten. Nach ihrem metabolischen Ursprung werden Pflanzenphenole als aus dem Shikimisäure-Weg und Phenylpropanoid-Metabolismus abgeleitete Verbindungen definiert. Die Unterteilung der phenolischen Verbindungen erfolgt anhand der Anzahl an Kohlenstoffatomen, die mit dem phenolischen Grundgerüst verbunden sind. Flavonoide besitzen ein C6-C3-C6-Grundgerüst (siehe Abbildung 1) aus zwei aromatischen Ringen (A und B) und einem sauerstoffhaltigem Heterozyklus (C) [9, 10, 11].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Strukturformel des Flavan-Grundgerüsts

Zu den sechs Hauptflavonoidklassen zählen Flavone, Flavanone, Flavonole, Isoflavone, Anthocyanidine und Flavanole. Strukturelle Unterschiede zwischen diesen Klassen beruhen hauptsächlich auf dem Oxidationsgrad des zentralen Pyranrings, dem Vorhandensein einer C2-C3-Doppelbindung sowie dem Grad der Hydroxylierung. Innerhalb der einzelnen Flavonoidklassen existieren zahlreiche strukturelle Varianten, die z. B. auf unterschiedliche Ringsubstituenten oder Glykosylierungen zurückzuführen sind [10, 12]. Die molekularen Grundstrukturen der verschiedenen Flavonoidklassen sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Molekulare Strukturen der einzelnen Flavonoidklassen

Flavonoide sind in einer Vielzahl an Früchten und Gemüse enthalten. Schätzungen zur täglichen Flavonoidaufnahme variieren zwischen 23 und 250 mg/d. Flavanone kommen überwiegend in Zitrusfrüchten vor, Flavone in Gewürzkräutern, Isoflavonoide in Hülsenfrüchten, Anthocyanidine und Flavanole nur in Früchten, Flavonole in allen Frucht- und Gemüsearten. Hierbei können die Flavonoide als Glykoside oder Aglykone vorliegen[12]. In Zitrusfrüchten sind Flavonoide überwiegend als Glykosylderivate vorhanden, während Aglykone aufgrund ihrer lipophilen Natur und dadurch geringen Wasserlöslichkeit eher selten zu finden sind. Bei den Glykosiden handelt es sich überwiegend um O-Glykoside, bei denen der Zuckerrest im Allgemeinen an die Hydroxylgruppe am C7 oder in manchen Fällen auch am C3 gebunden ist. Weiterhin wurden auch C-Glykoside in verschiedenen Zitrusfrüchten nachgewiesen[11]. Gattuso et al. [11] verglichen die in verschiedenen Studien ermittelten Flavonoidgehalte in handgepresstem sowie kommerziellem Zitronensaft. Der Gesamtgehalt an Flavonoiden (Eriocitrin, Hesperidin, Diosmin, Diosmetin-6,8-di-\1-Glucosid, Apigenin-6,8-di-\1-Glucosid, 7- O -Rut-Luteolin und Luteolin) im handgepressten Zitronensaft beträgt danach ca. 50,5 mg/100 mL. Im Vergleich dazu fällt der Flavonoidgehalt (Eriocitrin, Hesperidin, Naringin, Neohesperidin und Diosmin) im kommerziellen Zitronensaft mit etwa 26 mg/100 mL deutlich geringer aus. Angaben zu Vorkommen und Gehalt der einzelnen Flavonoide im Zitronensaft variieren abhängig von den zur Analyse angewendeten Methoden sowie von der Art des untersuchten Zitronensaftes (handelsüblicher Saft, handgepresster Saft, Zitronensorte). In allen Fällen machen Flavanone den größten Anteil der Zitrusflavonoide aus. Die Hauptflavanone im Zitronensaft sind Eriocitrin und Hesperidin, außerdem wurden Naringin und Neohesperidin nachgewiesen. Weiterhin enthält Zitronensaft Flavone wie Diosmin, Diosmetin-6,8-di-\1-Glucosid, Diosmetin-6-\1-d-Glucosid, Apigenin-6,8-di-\1-Glucosid, Vicenin-2, Chrysoeriol-6,8-di-\1-Glucosid und 7- O -Rut-Luteolin [5, 11, 13]. Zu den im Zitronensaft vorhandenen Flavonolen zählen Rutin, Myrelcetin, Quercetin und Kämpferol. Ein Großteil dieser Flavonoide wurde nur in sehr geringen Mengen im Zitronensaft identifiziert [5, 14, 15]. Zudem wurden in einer Vielzahl an Untersuchungen weitere Flavonoide im Zitronensaft nachgewiesen. Die folgende Abbildung verdeutlicht die Strukturen der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Zitrusflavonoide Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Molekulare Strukturen der Zitrusflavonoide Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin

2.2.2 Metabolismus

Mit der Nahrung aufgenommene Flavonoide werden über einen verbreiteten Stoffwechselweg metabolisiert, über den beispielsweise auch Xenobiotika verstoffwechselt werden. Zunächst müssen glykosylierte Flavonoide durch intestinale Enzyme oder durch die Mikroflora hydrolysiert werden, da sie im Gegensatz zu Flavonoid-Aglykonen nicht in ihrer nativen Form absorbiert werden können. Während der Absorption werden die Flavonoide im Dünndarm und später in der Leber konjugiert. Dieser Prozess beinhaltet Methylierung, Sulfatierung und Glucuronidierung. Diese Konjugationsmechanismen sind sehr effizient, weshalb Aglykone im Blut nicht oder nur in sehr geringen Konzentrationen zu finden sind. Im Blut zirkulieren Flavonoide als an Albumin gebundene, konjugierte Derivate. Flavonoide sind in der Lage in Gewebe einzudringen, ihre Anreicherung in spezifischen Zielgeweben bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Die Ausscheidung der Flavonoide und ihrer Derivate erfolgt hauptsächlich über Urin und Galle. Das Einschleusen der Flavonoide in den enterohepatischen Kreislauf ermöglicht ein längeres Vorhandensein im Körper. Hierbei gelangen Flavonoide nach der Gallensekretion ins Duodenum, wo sie von bakteriellen Enzymen (v.a. β-Glucuronidasen) hydrolysiert werden und anschließend reabsorbiert werden können[16]. Die Bioverfügbarkeit der einzelnen Flavonoide hängt von ihrer molekularen Struktur ab. Dabei spielt der Zuckerrest vermutlich eine große Rolle, da bereits gezeigt werden konnte, dass Rhamnoglykoside eine geringere Absorptionsrate aufweisen als die entsprechenden Aglykone und Glukoside [17, 18, 19]. Des Weiteren ist erwähnenswert, dass sich die Metabolisierung der Flavonoide von Mensch zu Mensch unterscheidet, da die Bioverfügbarkeit vom jeweiligen Gesundheitszustand des Individuums beeinflusst werden kann [5, 20].

2.2.3 Antioxidative Aktivität und gesundheitsfördernde Effekte

Zitrusflavonoide weisen eine Vielzahl gesundheitsfördernder Effekte auf, die überwiegend auf ihrer antioxidativen Aktivität beruhen. Daneben werden auch Interaktionen mit Proteinen sowie die Fähigkeit regulatorische Schlüsselenzyme zu modulieren als Wirkungsmechanismen diskutiert. Bisher konnten in Zellkultur- und Tierversuchen u. a. antikanzerogene, antiinflammatorische, antimikrobielle, antithrombotische, antiallergische, antiatherogene und kardioprotektive Effekte von Zitrusflavonoiden gezeigt werden [2, 21, 22]. In der vorliegenden Arbeit wurde die antioxidative Aktivität der Flavonoide untersucht, weshalb nur diese im Folgenden näher erläutert wird.

Die Bildung freier Radikale ist ein natürlicher Prozess im Metabolismus aerober Zellen. Der Sauerstoffverbrauch wachsender Zellen führt zur Bildung freier Sauerstoffradikale, die die häufigsten Radikalspezies beim Phänomen des oxidativen Stresses darstellen. Die Interaktion dieser Radikale mit Lipidmolekülen induziert die Entstehung neuer Radikale, z. B. Peroxylradikale. Singulett-Sauerstoff (1O2), Superoxid-Anion-Radikale (O2•-), Hydroxylradikale (•OH) und Peroxylradikale (R-OO•) können mit biologischen Systemen auf cytotoxische Weise reagieren, indem sie mit essentiellen Molekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen reagieren. Dadurch werden oxidative Reaktionen angestoßen, die Proteinumbau und Proteinaustausch bedingen. Letztere sind fundamentale Prozesse, deren Effizienz unabdingbar für die funktionelle Aktivität potentieller Reparatursysteme ist. Die Forschung nach Mechanismen, die die Blockierung oder das Abfangen der freien Radikale ermöglichen, ist deshalb von sehr großem Interesse[22].

In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass Flavonoide eine wichtige antioxidative Aktivität gegenüber o. g. Radikalen besitzen, da sie als Wasserstoffdonatoren fungieren können. Sie besitzen die Fähigkeit die Lipidperoxidation zu inhibieren, indem sie als starke Radikalfänger und als Quencher von Singulett-Sauerstoff agieren. Weiterhin sind Flavonoide möglicherweise in der Lage, mit Peroxylradikalen zu reagieren und dadurch radikalische Kettenreaktionen zu beenden. Die antioxidative Wirkung der Flavonoide ist durch ihre strukturellen Eigenschaften begründet. Es gibt drei strukturelle Gruppen, die die antioxidative Kapazität ausmachen. Hierzu zählt die O-Dihydroxy-Struktur am B-Ring, die den entstehenden Aroxylradikalen größere Stabilität verleiht und an der Elektronendelokalisation beteiligt ist. Weiterhin ist die C2-C3-Doppelbindung in Konjugation mit einer C4-Oxo-Funktion von großer Wichtigkeit, die für die Elektronendelokalisation verantwortlich ist. Letztes bedeutendes Charakteristikum ist das Vorhandensein von beiden Hydroxylgruppen an C3 und an C5. Dieses Strukturmerkmal ermöglicht eine maximale radikalfangende Kapazität sowie eine starke Radikalabsorption. Eine Kombination dieser Strukturelemente bedingt die antioxidative Kapazität jedes Flavonoids. Diese Kapazität ist jedoch nicht gegenüber jeder Radikalspezies gleich und mit derselben Effektivität ausgeprägt, sondern hängt von verschiedenen Einflussmechanismen in den jeweiligen Einzelfällen ab. So wirken sich zum Beispiel strukturelle Faktoren wie das Vorhandensein von Glykosidresten, die Glykosylierungsposition oder die Anzahl und die Position der freien Hydroxylgruppen ebenfalls auf die antioxidative Aktivität aus[22]. Folgende Tabelle bietet eine Übersicht der die antioxidative Aktivität beeinflussenden Strukturmerkmale der in dieser Arbeit untersuchten Flavonoide.

Tabelle 2: Antioxidative Strukturmerkmale der Zitrusflavonoide Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin[22]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

* glykosyliert an C3

Bei Betrachtung der obigen Tabelle fällt auf, dass Rutin alle drei Strukturmerkmale aufweist. Diosmin besitzt dagegen nur die C2-C3-Doppelbindung in Kombination mit der C4-Oxo-Funktion, während Eriocitrin lediglich über die O-Dihydroxy-Struktur verfügt. Bei Hesperidin findet sich keines der oben aufgeführten Strukturmerkmale. Da die antioxidative Kapazität jedoch auch durch die Glykosidreste und die freien Hydroxylgruppen beeinflusst wird (siehe oben), kann die Betrachtung nicht auf die drei o. g. Strukturmerkmale reduziert werden. Bislang existieren noch keine Studien, die die antioxidative Aktivität aller vier Flavonoide vergleichen. Vergleiche von zwei oder drei der vier in dieser Arbeit betrachteten Flavonoide bzw. Vergleiche mit anderen Flavonoiden sind demgegenüber bereits vorhanden. Einige Ergebnisse dieser Studien sind im Folgenden aufgeführt. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Rutin der Lipidperoxidation (Hamstermodell) stärker entgegenwirkt als Kämpferol und Scutellarein, aber eine mit Neoeriocitrin vergleichbare Kapazität aufweist[23]. Weiterhin wurde festgestellt, dass Rutin eine höhere antioxidative Aktivität beim Abfangen von Radikalen als Quercetin, Luteolin und Kämpferol besitzt (DPPH-Assay)[24]. Bei der Überprüfung des Einflusses von Hesperidin und Rutin auf die Lipidperoxidation in der Mausleber zeigte Rutin eine sehr starke, Hesperidin jedoch keine Inhibierung[25]. Für Eriocitrin konnte im DDPH-Assay eine höhere antioxidative Aktivität als für Hesperidin nachgewiesen werden[26]. Des Weiteren hemmte Eriocitrin verglichen mit Diosmin und Hesperidin die Lipidperoxidation (Linolsäure-Modell) am stärksten, Hesperidin am zweitstärksten [27, 28].

2.3 Aminosäuren

Aminosäuren stellen wichtige Lebensmittelbestandteile dar, da sie zum einen die Bausteine für die Proteinbiosynthese liefern und zum anderen direkt für den Geschmack der Lebensmittel mitverantwortlich sind. Außerdem können durch thermische oder enzymatische Reaktionen von Aminosäuren, z. B. mit anderen Lebensmittelinhaltsstoffen, während der Lebensmittelgewinnung, -verarbeitung und -lagerung Aromastoffe und Farbstoffe entstehen. Es gibt zwanzig proteinogene Aminosäuren, die in essentielle, semi-essentielle und nicht-essentielle Aminosäuren eingeteilt werden. Die essentiellen Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin können vom menschlichen Organismus nicht synthetisiert werden und müssen deshalb mit der Nahrung aufgenommen werden. Histidin ist nur für den Säugling essentiell. Arginin zählt zu den semi-essentiellen Aminosäuren, da es zwar im Körper gebildet werden kann, bei bestimmten Stoffwechsellagen aber zusätzlich mit der Nahrung zugeführt werden muss. Asparagin, Asparaginsäure, Alanin, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Prolin, Tyrosin und Serin sind nicht-essentielle Aminosäuren, die der menschliche Organismus aus Kohlenstoff- und Stickstoffvorstufen selbst bilden kann. Aminosäuren werden durch das Vorhandensein einer –COOH und einer –NH2-Gruppe am gleichen α-C-Atom des Moleküls charakterisiert und unterscheiden sich durch den Rest (R) des Moleküls. Das α-C-Atom bildet bei allen Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin ein chirales Zentrum, weshalb zwei zueinander spiegelbildliche Enantiomere, ein D- und ein L-Isomer, existieren. Alle proteinogenen Aminosäuren liegen in L-Konfiguration vor [29, 30]. Die Grundstruktur von L-α-Aminosäuren in der Fischer-Projektion ist in Abbildung 4 dargestellt.

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Abbildung 4: Fischer-Projektionsformel von L-α-Aminosäuren. R und COOH liegen unterhalb, H2N und H oberhalb der Papierebene

Zitronen enthalten nahezu alle proteinogenen Aminosäuren. Die Gehalte an den einzelnen Aminosäuren liegen zwischen 4 mg/100 g und 96 mg/100 g (siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: Aminosäuregehalte in Citrus medica L.; Angaben in mg/100 g essbarem Anteil[8]

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Wie bereits unter 2.2.3 erwähnt, steht die Interaktion mit Proteinen als weitere Ursache für die biologischen Aktivitäten der Flavonoide in der Diskussion. Hierzu wurden bislang nur wenige Studien durchgeführt. Für Quercetin konnte z. B. eine chemopräventive Wirkung gezeigt werden, da es an die MEK 1 (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 1) und an die Raf 1-Kinase (rapidly growing fibrosarcoma or rat fibrosarcoma 1 kinase) bindet und dadurch deren Aktivitäten blockiert[31]. In einer weiteren Studie wurde festgestellt, dass Hesperetin durch Bindung an kardiale HERG (Human Ether-à-go-go Related Gene)-Kaliumkanäle in der Lage ist, deren Aktivität zu modulieren[32].

Studien zu Reaktionen von Zitrusflavonoiden mit einzelnen Aminosäuren sind derzeit noch nicht vorhanden.

2.4 Problemstellung

Die gesundheitsfördernden Effekte der Flavonoide sind verstärkt Gegenstand der aktuellen Forschung. Hauptursache für die Wirkungen der Flavonoide ist vermutlich ihre antioxidative Aktivität. Zitronensaft stellt eine wichtige Quelle für Flavonoide dar [1, 2]. Aufgrund der zunehmenden industriellen Bedeutung von Zitronensaft ist von Interesse, ob darin enthaltene gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe durch industrielle Verarbeitungsprozesse, wie Lagerung und Erhitzung, beeinflusst werden. Wissenschaftliche Studien, die sich mit dieser Fragestellung im Detail beschäftigen, sind derzeit noch nicht vorhanden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Stabilität und der antioxidativen Wirkung von Flavonoiden im Zitronensaft. Hierbei werden die Auswirkungen von Lagerungsdauer und Lagerungstemperatur, Langzeiterhitzung und Kurzzeiterhitzung, pH-Wert-Änderung sowie UV-Bestrahlung auf den Flavonoidgehalt und die antioxidative Kapazität der Flavonoide betrachtet. Des Weiteren wird die antioxidative Aktivität einzelner Flavonoide durch Fraktionierung derselben aus dem Zitronensaft bestimmt. Schließlich sollen die Reaktionen der Flavonoide mit anderen Inhaltsstoffen des Zitronensaftes am Beispiel von Aminosäuren in Abhängigkeit von Temperatur und pH-Wert untersucht werden.

3. Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Tabelle 4: Verwendete Chemikalien mit Angabe des Reinheitsgrades (falls angegeben) und Hersteller

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3.2 Geräte

3.2.1 Chromatographische Anlagen

Tabelle 5: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäure- und Flavonoidanalytik)

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Tabelle 6: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäureanalytik)

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Tabelle 7: HPLC-Anlage mit Diodenarray-Detektor (DAD) und Massenspektrometer (MS)

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Tabelle 8: HPLC-Anlage mit UV/VIS-Detektor und online TEAC-Messung

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3.2.2 Sonstige Geräte

Tabelle 9: Verwendete Geräte mit Angabe des Herstellers

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3.3 Methoden

3.3.1 Herstellung des Zitronensaftes

Zur Gewinnung des für die Analysen benötigten Zitronensaftes werden 2,25 kg Zitronen Primofiori (Pascual Marketing S.L, Ctra.Jimenado Km 1-(30700), Torre Pacheco (Murcia) España) mit einer haushaltsüblichen Zitronenpresse ausgepresst. Mit Hilfe eines Küchensiebs wird im Anschluss das grobe Fruchtfleisch vom Saft abgetrennt. Der Saft wird zur Aufbewahrung für spätere Analysen in 50 mL Falconröhrchen aliquotiert und bis zur Probenvorbereitung bei -18 °C gelagert.

3.3.2 Untersuchungen zur Stabilität der Flavonoide

3.3.2.1 Stabilität bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen

Für die Untersuchung der Flavonoidstabilität im Zitronensaft bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen werden je 1,5 mL Zitronensaft in 27 Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert. Drei dieser Zitronensaftproben dienen als Nullproben und werden sofort analysiert. Je drei der restlichen Proben werden bei Raumtemperatur (20-23 °C) bzw. Kühlschranktemperatur (4 °C) 7, 14, 21 und 28 Tage (d) gelagert und nach Ende der Lagerungsdauer untersucht.

Die Flavonoidextraktion aus dem Zitronensaft erfolgt mittels Festphasenextraktion (SPE). Die SPE ist ein Verfahren zur Trennung polarer und unpolarer Verbindungen in wässrigen Proben. Der Trennprozess mittels SPE kann als ein einfacher flüssig-chromatographischer Trennprozess angesehen werden. Das Sorbens stellt dabei die stationäre, das für die einzelnen Elutionsschritte verwendete Lösungsmittel die mobile Phase dar. Ein typischer SPE-Prozess besteht aus verschiedenen Schritten. Zunächst wird das Sorbens vorkonditioniert und im Anschluss die Probe aufgetragen. Im nächsten Schritt wird zur vollständigen Extraktion der wasserlöslichen Verbindungen mit einem polaren Lösungsmittel nachgespült. Schließlich erfolgt die Desorption der zuvor an das Sorbens gebundenen Stoffe durch ein organisches Lösungsmittel und somit die Elution der unpolaren Verbindungen der Probe[33].

Für die Experimente in dieser Arbeit dient ein C18-Material (Chromabond Sorbent C18) als stationäre Phase. Von diesem Sorbens werden je 0,3 g in eine SPE-Kartusche (Bakerbond spe Disposable Extractrion Columns, J.T. Baker B.V, Deventer (NL)) eingewogen. Die SPE-Kartuschen werden auf eine Vakuumabsaugbox gesteckt, da der Durchlauf durch die Säulen durch Anlegen eines Unterdrucks beschleunigt werden kann. Anschließend wird das Sorbens mit 3 x 1 mL Methanol (MeOH) und 3 x 1 mL destilliertem Wasser (dest. H2O) vorkonditioniert, ohne es zwischen den einzelnen Schritten trockenlaufen zu lassen. Die zu untersuchenden Zitronensaftproben werden vor der SPE 10 Minuten (min) bei 10000 rpm und 20 °C zentrifugiert. Im Anschluss wird 1 mL des Überstandes auf die SPE-Säule aufgetragen, der restliche Überstand wird verworfen und der Rückstand nach Zentrifugation bis zur weiteren Analyse bei Raumtemperatur gelagert. Bei Kontakt des Saftes mit dem unpolaren C18-Säulenmaterial können nun unpolare Substanzen im Zitronensaft, wie beispielsweise Flavonoide binden, polare Substanzen hingegen gehen keine Wechselwirkungen mit dem Sorbens ein. Zur vollständigen Elution der polaren Substanzen (1. Fraktion) wird mit 8 x 1 mL dest. H2O nachgespült. Die Elution der Flavonoide und anderer unpolarer Verbindungen (2. Fraktion) erfolgt mit 3 x 1 mL MeOH. Die 1. Fraktion wird verworfen, die 2. Fraktion jeder Probe wird in einem 15 mL Falconröhrchen aufgefangen. Zur einheitlichen Konzentrationsbestimmung der Analyten wird jede 2. Probenfraktion mit MeOH auf 3,5 mL aufgefüllt. Für die Ermittlung der Flavonoidkonzentrationen wird schließlich 1 mL der 2. Fraktion in ein HPLC-Vial pipettiert und mittels HPLC analysiert.

Mittels Festphasenextraktion können nur die im Saft vorhandenen Flavonoide analysiert werden. Da jedoch auch im Rückstand nach Zentrifugation des Saftes Flavonoide enthalten sein können, soll auch dieser einer Analyse unterzogen werden. Zur Flavonoidextraktion werden die jeweiligen Rückstände in 1 mL MeOH aufgenommen, anschließend 10 min auf dem Rotationsmischer geschüttelt, 10 min im Ultraschallbad inkubiert und 10 min bei 10000 rpm und 20 °C zentrifugiert. Der Überstand (1 mL) nach Zentrifugation wird in ein HPLC-Vial pipettiert, der Rückstand wird nochmals mit 1 mL Methanol versetzt und wie oben beschrieben behandelt. Bei der Analyse der ersten Nullprobe für die Lagerungsversuche wird dieses Vorgehen als Vorversuch in Dreifachbestimmung sechsmal wiederholt um bestimmen zu können, wie viele Schritte zur vollständigen Extraktion der Flavonoide erforderlich sind. Für die danach analysierten Proben werden die Schritte viermal durchgeführt. Die Quantifizierung der Flavonoide in den Rückstandsextrakten erfolgt mittels HPLC-Analyse.

3.3.2.2 Stabilität bei Erhitzung

Kurzzeiterhitzung

Zur Überprüfung der Stabilität der Flavonoide im Zitronensaft bei Kurzzeiterhitzung (Pasteurisierung) werden je 1,5 mL Zitronensaft in 21 Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert. Auch hier dienen drei Proben als Nullproben. Die übrigen Proben werden jeweils in Dreifachbestimmung 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 Sekunden (s) erhitzt. Nach Abkühlung der Proben erfolgt die Flavonoidextraktion aus dem Saft und aus dem Rückstand nach Zentrifugation wie unter 3.3.2.1 für die gelagerten Zitronensaftproben beschrieben. Anschließend erfolgt die Messung der Flavonoidkonzentrationen mittels HPLC.

Zum Vergleich der Stabilität der Flavonoid-Standardsubstanzen mit der Stabilität der im Zitronensaft analysierten Flavonoide werden Modellversuche durchgeführt. Hierfür werden die für die Kalibrierung genutzten Flavonoid-Stammlösungen (siehe 3.3.2.6) mit MeOH 1:20 verdünnt, so dass die Konzentration 50 µg/mL beträgt. Da Standardsubstanzen teilweise sehr teuer sind, werden die Modellversuche nur in Doppelbestimmung durchgeführt. Die Modellproben werden einer Erhitzung (60 s bei 95 °C) unterzogen und im Anschluss mit jeweils zwei dazugehörigen Nullproben mittels HPLC analysiert.

Langzeiterhitzung

Die Stabilitätskontrolle bei Langzeiterhitzung des Zitronensaftes wird durch 30-, 45- oder 60-minütiges Erhitzen der Saftproben bei 120 °C im Trockenschrank durchgeführt. Zuvor werden je 2 mL Zitronensaft in 12 Falconröhrchen à 50 mL abgefüllt, von denen drei als Nullproben herangezogen werden.

Nach dem Erhitzen der Saftproben bei 120 °C im Trockenschrank ist aufgrund der Verdampfung der Flüssigkeit nur noch wenig Saft vorhanden. Diese Proben können demzufolge nicht mittels SPE analysiert werden, weshalb eine andere Methode zur Flavonoidextraktion gewählt wird. MeOH kann wegen der Mischbarkeit mit Wasser nicht zur Extraktion verwendet werden, weshalb Ethylacetat (EtAc) gewählt wird. Die Proben werden nach der Erhitzung mit 2 mL EtAc versetzt und 10 min im Überkopfschüttler geschüttelt. Danach wird die EtAc-Phase abgenommen und in ein 15 mL Falconröhrchen pipettiert. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, anschließend werden alle EtAc-Phasen einer Probe vereinigt und zur einheitlichen Konzentrationsbestimmung mit EtAc auf 6 mL aufgefüllt. Von diesen 6 mL werden 1,5 mL in ein HPLC-Vial pipettiert, unter Stickstoff abgedampft, in 750 µL MeOH aufgenommen und schließlich mittels HPLC analysiert. Die Nullproben werden auf die gleiche Weise behandelt.

3.3.2.3 Stabilität bei Bestrahlung mit UV-Licht

Für die Ermittlung des Einflusses einer UV-Licht-Bestrahlung auf die Flavonoidkonzentrationen im Zitronensaft werden je 1,5 mL Saft in 15 Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und in Dreifachbestimmung 0 (Nullprobe), 1, 2, 5 oder 24 Stunden (h) mit UV-Licht bestrahlt. Die Flavonoide werden wie unter 3.3.2.1 erläutert durch SPE aus dem Saft und durch Direktextraktion mit MeOH aus dem Rückstand gewonnen und anschließend mittels HPLC quantifiziert.

Wie bereits unter 3.3.2.2 für die Kurzzeiterhitzung beschrieben, werden auch bezüglich der Bestrahlung mit UV-Licht Modellversuche durchgeführt. Hierbei werden die 1:20 verdünnten Modellproben einer fünfstündigen UV-Bestrahlung unterzogen und die Flavonoidkonzentrationen im Vergleich zu unbehandelten Standardproben durch HPLC-Analyse ermittelt.

3.3.2.4 Stabilität bei Veränderung des pH-Wertes

Die pH-Wert-Stabilität der Flavonoide im Zitronensaft wird durch Neutralisation des Saftes getestet. Hierzu werden 10 mL des Saftes in ein 50 mL Falconröhrchen pipettiert und der Anfangs-pH-Wert von 2,45 durch Zugabe von 2 mL 5 M Natriumhydroxid (NaOH) und ca. 200 µL 0,8 M NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Von diesem neutralisierten sowie von dem nicht neutralisierten Saft (Nullprobe) werden je 3 x 1,5 mL in Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert, die Flavonoide wie unter 3.3.2.1 beschrieben aus Saft und Zentrifugationsrückstand extrahiert und mittels HPLC quantifiziert.

3.3.2.5 Qualifizierung der Flavonoide im Zitronensaft

Für die Qualifizierung der im Zitronensaft enthaltenen Flavonoide wird in einem Vorversuch die 2. Fraktion der ersten zu untersuchenden SPE-Nullproben (Dreifachbestimmung) (für Lagerungsversuche, siehe 3.3.2.1) mittels HPLC analysiert. Bei chromatographischen Prozessen werden die Komponenten einer Probe durch ihre Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase getrennt. Die HPLC zählt zu den Verfahren der Säulen-Flüssigkeitschromatographie. Hierbei wird die Probe mit Hilfe einer flüssigen Phase (Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase (Trennsäule) transportiert. Für die Analytik in dieser Arbeit wird die Reversed-Phase (RP)-HPLC verwendet, d. h. die stationäre Phase ist unpolarer als die mobile Phase. Durch die - auf ihren physiko-chemischen Eigenschaften beruhenden - unterschiedlichen Wechselwirkungen der Probenbestandteile mit der stationären Phase wird die Probe in ihre Einzelkomponenten aufgetrennt, die von Detektoren registriert werden[34]. Die HPLC-Methode für die Flavonoidanalytik wurde in der Arbeitsgruppe entwickelt. Folgende Tabelle zeigt die Methodenbedingungen. Die Parameter der Anlage sind in Tabelle 5 aufgelistet.

Tabelle 10: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoidanalytik

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Flavonoide besitzen Absorptionsmaxima im Bereich von 270-295 nm und von 320-360 nm[5]. In dieser Arbeit werden die bei 325 nm erhaltenen Chromatogramme zur Auswertung herangezogen. Für die Qualifizierung der im Zitronensaft vorhandenen Flavonoide ist es wichtig, die Retentionszeiten der einzelnen Flavonoide zu kennen, da diese ein qualitatives Merkmal für jede Substanz darstellen[34]. Die Retentionszeiten der Zitrusflavonoide sind bereits aus früheren Analysen bekannt. Anhand der Retentionszeiten können die im Saft vorhandenen Flavonoide identifiziert und auf Basis dieser Erkenntnisse Kalibrierlösungen hergestellt werden.

3.3.2.6 Herstellung der Flavonoid-Kalibrierlösungen

Für die Kalibrierlösungen werden zunächst Stammlösungen der zu untersuchenden Flavonoide mit einer Konzentration von 1 mg/mL hergestellt. Für Eriocitrin und Rutin wird MeOH als Lösungsmittel verwendet. Da Hesperidin in reinem MeOH nicht löslich ist, wird es unter Berücksichtigung der Reinheit von 80 % in einem MeOH-Dimethylsulfoxid (DMSO)-Gemisch (2:1 v/v) gelöst. Durch Verdünnung der einzelnen Stammlösungen mit Methanol werden die Kalibrierlösungen mit Konzentrationen von 5, 10, 25, 50 und 75 µg/mL erhalten (Pipettierschema siehe Tabelle 11).

Tabelle 11: Pipettierschema für Herstellung der Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik

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Diosmin wurde erst durch die massenspektrometrische Analyse als in nennenswerten Mengen im Zitronensaft vorhandenes Flavonoid identifiziert. Da die Probenmessung an der HPLC-MS organisatorisch erst zu einem späteren Zeitpunkt möglich war, wurden im Nachhinein eigene Kalibrierlösungen für Diosmin hergestellt und die erhaltene Kalibriergerade für die Berechnung der Diosminkonzentrationen verwendet.

Wie Hesperidin ist auch Diosmin in reinem MeOH nicht löslich, weshalb die Stammlösung von 1 mg/mL mit einem MeOH-DMSO-Gemisch (1:1 v/v) angesetzt wird. Die Verdünnungsschritte erfolgen wie oben beschrieben (Pipettierschema siehe Tabelle 12).

Tabelle 12: Pipettierschema für Herstellung der Diosmin-Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik

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3.3.2.7 Quantifizierung der Flavonoide

Die Quantifizierung der Flavonoide erfolgt durch HPLC-Analyse (Methodenbedingungen siehe Tabelle 10) der Modellproben bzw. der zu untersuchenden Flavonoidextrakte. Mit Hilfe einer Standard-Eichgeraden können die Flavonoidkonzentrationen in der Probe berechnet werden, indem die Peakflächen der Probenkomponenten zu den Peakflächen der Kalibrierlösungen in Relation gesetzt werden (externe Kalibrierung). Die Auswertung erfolgt mit Hilfe des Programms Class-LC 10 (Shimadzu, Kyoto (J)). Die durch die vier Extraktionsschritte ermittelten Flavonoidkonzentrationen in den Rückständen nach Zentrifugation werden addiert, so dass für jeden analysierten Rückstand eine Gesamtkonzentration des jeweiligen Flavonoids erhalten wird. Zur Bestimmung des Gesamtgehaltes eines Flavonoids im Zitronensaft werden die im Saft ermittelte Konzentration sowie die Gesamtkonzentration im Rückstand einer Zitronensaftprobe addiert. Um sehen zu können, ob die erhaltenen Flavonoidkonzentrationen im gleichen Größenbereich wie vorhandene Literaturwerte liegen, wird in einem Vorversuch beispielhaft die Gesamtkonzentration jedes Flavonoids in einer Zitronensaft-Nullprobe (für Lagerungsversuche, siehe 3.3.2.1) aus den Einzelwerten der Flavonoidextrakte berechnet.

3.3.2.8 Identifizierung der Flavonoide mittels HPLC-MS

Zur Ermittlung bzw. Bestätigung der Flavonoid-Identitäten wird eine HPLC-MS-Analyse durchgeführt. Dazu werden Flavonoidextrakte einer SPE-Nullprobe sowie einer Nullprobe des Rückstands nach Zentrifugation (siehe 3.3.2.1) mittels Massenspektrometrie (MS) überprüft. Das Prinzip der MS beruht darauf, dass die zu analysierenden Probenkomponenten in sich schnell bewegende, ionisierte Gase überführt werden und das Masse-Ladungs-Verhältnis der Ionen bestimmt wird. Die Intensität des in einem Detektor ankommenden Ionenstrahls wird proportional zur Konzentration der Probenkomponente aufgenommen[34]. Durch die Zuordnung der Molmassen zu den entsprechenden Peaks im Chromatogramm können die einzelnen im Zitronensaft vorhandenen Flavonoide identifiziert werden. Tabelle 13 zeigt die HPLC-MS-Methodenbedingungen für die Flavonoididentifizierung.

Tabelle 13: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoididentifizierung

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Die MS-Ergebnisse werden bei 325 nm mit Hilfe des Programms LC Lab Solution (Shimadzu, Kyoto (J)) ausgewertet. Tabelle 7 gibt die Anlagenparameter wieder.

3.3.3 Herstellung und Fraktionierung eines aufkonzentrierten Flavonoidextraktes

Die Aufkonzentrierung und Fraktionierung von Flavonoiden kann z. B. zur Gewinnung von Flavonoid-Standardsubstanzen angewendet werden. Dies ermöglicht finanzielle Einsparungen, da Standard-Substanzen z. T. sehr teuer sind. Des Weiteren können durch Fraktionierung eines aufkonzentrierten Flavonoidextraktes die antioxidativen Aktivitäten einzelner im Zitronensaft erhaltener Flavonoide ermittelt werden. Letzteres wird in der vorliegenden Arbeit untersucht.

Zur Gewinnung eines aufkonzentrierten Flavonoidextraktes werden zunächst 12 mL Zitronensaft 10 min bei 4000 rpm und 20 °C zentrifugiert. Für die Aufkonzentrierung der im Saft enthaltenen Flavonoide wird eine SPE (siehe 3.3.2.1) im größeren Maßstab durchgeführt. Hierzu wird eine Glassäule (BioRad Laboratories GmbH, München (D), Innendurchmesser 1,5 cm, Länge 15 cm) mit 4,5 g Chromabond Sorbent C18 befüllt und auf eine Vakuumabsaugbox gesteckt. Die Säule wird mit 8 mL (2 x 4 mL) MeOH und 12 mL (3 x 4 mL) dest. H2O vorkonditioniert. 10 mL des Saftes nach Zentrifugation werden in 2 mL-Schritten auf die Säule gegeben, der Rest des Überstandes wird verworfen. Die Elution der polaren Substanzen erfolgt mit 7 x 10 mL dest. H2O, die der unpolaren Komponenten mit 3 x 4 mL MeOH. Die 1. Fraktion wird verworfen, die 2. Fraktion wird in einem 50 mL Falconröhrchen aufgefangen und mit MeOH auf 14 mL aufgefüllt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter Luft abgedampft, so dass nur noch eine wässrige Phase (3 mL) übrig bleibt. Diese wird zu Fraktionierung mittels HPLC verwendet. Der Rückstand nach Zentrifugation wird in 4 mL MeOH aufgenommen und wie unter 3.3.2.1 beschrieben geschüttelt, im Ultraschallbad inkubiert, zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Diese Schritte werden dreimal wiederholt, die Überstände werden in einem 15 mL Falcon vereinigt. Das Lösungsmittel wird unter Luft abgedampft, die Restmenge von ca. 1 mL mit DMSO auf 2 mL aufgefüllt und mittels HPLC fraktioniert.

Für die Fraktionierung der aufkonzentrierten Flavonoidextrakte wird eine semi-präparative HPLC-Säule verwendet. Tabelle 14 gibt die Methodenbedingungen für die Peaksammlung wieder, die Anlagenparameter sind in Tabelle 5 vermerkt.

Tabelle 14: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoid-Fraktionierung

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Zur Peaksammlung werden je sechs HPLC-Läufe mit dem SPE-Flavonoidextrakt sowie mit dem Rückstands-Flavonoidextrakt durchgeführt. In jedem HPLC-Lauf werden die einzelnen Probenkomponenten, die einen Peak im Chromatogramm entstehen lassen, nach der Detektion im Detektor manuell in einem 15 mL Falconröhrchen aufgefangen.

Zur Identifizierung der gesammelten Fraktionen werden diese mittels HPLC-MS (siehe 3.3.2.8) analysiert. Hierzu wird 1 mL jeder gesammelten Fraktion in ein HPLC-Vial überführt und im Anschluss vermessen. Die Parameter der HPLC-Anlage sind in Tabelle 7, die Methodenbedingungen für die Flavonoididentifizierung in Tabelle 13 dargestellt.

Für die Messung der antioxidativen Aktivität mittels TEAC-Assay werden die gesammelten Fraktionen von Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin verwendet. Zur Berechnung der antioxidativen Kapazität je Gramm Flavonoid werden die Flavonoidkonzentrationen der einzelnen Fraktionen in Doppelbestimmung mittels HPLC gemessen. Tabelle 5 zeigt die HPLC-Parameter, Tabelle 10 gibt die Methodenbedingungen für die Quantifizierung wieder.

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