Untersuchungen zur enzymatischen Modifizierung von Lignin


Bachelorarbeit, 2011

56 Seiten, Note: 1,7


Leseprobe


Inhaltsverzeichnis

Verzeichnisse

1 Einleitung

2 AllgemeinerTeil
2.1 Lignin
2.2 Technische Lignine
2.3 Biokatalytische Modifizierung mit Enzymen
2.3.1 Laccase und seine biologischen Funktionen
2.3.2 Anwendungen von Laccase und LMS
2.3.3 Mediatoren
2.3.4 Reaktionsmechanismen

3 ExperimentellerTeil
3.1 Materialien
3.1.1 Substrat
3.1.2 Enzyme
3.1.3 Mediatoren
3.1.4 Sonstige Chemikalien
3.2 Methoden
3.2.1 Behandlung mit LMS
3.2.2 Groftenausschlusschromatographie
3.2.3 Elementaranalyse
3.2.4 Kohlenhydratanalyse
3.2.5 31P-NMR-Spektroskopie

4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Veranderung der Molmassen
4.1.1 Zeitreihen
4.1.2 Molmassenverteilung
4.2 Analyse der Kohlenhydrate
4.3 Elementaranalyse
4.4 31 P-NMR-Spektroskopie

5 Zusammenfassung und Ausblick

Literaturverzeichnis

Anhang

Vorwort

Die vorliegende Arbeit wurde am Zentrum Holzwirtschaft der Universitat Hamburg im Institut fur Holztechnologie und Holzbiologie des Johann-Heinrich- von-Thunen Instituts, Hamburg, in der Zeit von September 2010 bis Januar 2011 angefertigt.

Fur Themenstellung, stete Diskussionsbereitschaft und fur viele hilfreiche Ratschlage bedanke ich mich bei Prof. Dr. Bodo Saake und Dr. Jurgen Puls.

Mein besonderer Dank gilt Andreas Schreiber, der mir im praktischen Teil dieser Arbeit stets zur Seite stand und vor allem bei der Durchfuhrung der Versuche eine groRe Hilfe war. Fur die Unterstutzung mochte ich mich auch bei alien Mitarbeitern des Instituts, insbesondere bei Sascha Lebioda, Christiane Riegert, Inge Stichweh, Bernhard Ziegler und Nicole Erasmy bedanken.

Uber allem steht meine liebe Familie, der ich fur die vielen Jahre der Unterstutzung danken mochte. Ihr Ruckhalt und ihre Forderung haben wesentlichen Anteil am Gelingen meines Studiums.

Universitat Hamburg / Department Biologie Zentrum Holzwirtschaft Institutfur Holztechnologie und Holzbiologie Arbeitsbereich Chemische Holztechnologie LeuschnerstraRe 91 21031 Hamburg

Johann-Heinrich-von-Thunen Institut Institutfur Holztechnologie und Holzbiologie Arbeitsbereich Chemische Holztechnologie LeuschnerstraRe 91 21031 Hamburg

Ab gabetag: Seitenzahl:

10.02.2011

Abkurzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabellenverzeichnis

Tab. 1. Anteile an H/G/S Einheiten im Lignin der NH, LH und Graser nach NIMZ [1988]

Tab. 2. Auftreten derverschiedenen Bindungstypen im Fi-, Bi- und Bu-Lignin, nach SCHILD [1994]

Tab. 3. Einige Eigenschaften von techn. Ligninen aus vierAufschlussverfahren nach (1) NITZ [2001] und (2) PULS [2006]

Tab. 4: Ausbeuten aus Oxidationsreaktion von LMS mit 3-Methoxybenzyl-Alkohol, nach FABBRINI et al [2002]

Tab. 5: Parameterder Organosolv-Kochung 137

Tab. 6: Parameteran Substrat und Reaktorperipherie

Tab. 7: Ausbeute (A) der Proben nach der LMS-Behandlung in % bez. auf 500ml eingetragenen Substrates

Tab. 8: Massenmittel (Mw) und deren Veranderung (A) bezogen auf den Blindwert, nach GPC gemessen mit UV- und Rl-Detektor

Tab. 9: Gesamtzuckeranteile, einige Zuckermonomere und Gehalt an saure- unloslichem Lignin nach zweistufiger Hydrolyse ausgewahlter Proben, [%] bez. auf atro Probe

Tab. 10: Elementarzusammensetzung [%] bez. aufatro Probe; %0 als Differenzzu 100

Tab. 11: Polydispersitat (PDI), Zahlenmittel (Mn), Massenmittel (Mw) und deren Veranderung (A) bezogen auf den Blindwert, nach GPC gemessen mit UV und Rl

Tab. 12: Gesamtzuckeranteile, KH-Monomere und Gehalt an saureunloslichem Lignin nach zweistufiger Hydrolyse, [%] bez. auf atro Probe

Tab. 13: Gehalt an OH-Funktionen in mmol/g (atro Lignin)

Tab. 14: Flachenintegrale der31P-NMR, dreifache Bestimmung als Berechnungsgrundlage der Konzentration der Hydroxylgruppen

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Coniferylalkohol und seine mesomeren Phenoxyradikale

Abb. 2: Ausschnitt aus dem Konstitutionsschema eines Buchenlignins nach NIMZ [1974]

Abb. 3: Mogliche Funktionen der verschiedenen Laccasen in Organismen, in Anlehnung an RANOCHA et al [2000]

Abb. 4: Oxidation unublicher Substrate mithilfe von Mediatoren in einer Redoxkaskade (A) und Redoxpotentiale der Mediatorenoxidation durch Laccase (B); geandert nach KUNAMNENI et al [2008]

Abb. 5: Chem. Struktur einiger representatives kunstlicher (ABTS, HBT, TEMPO) und naturlicher Mediatoren (Acetosyringon (A), Acetovanillon (B), Syringaldehyd (C), Vanillin (D)), verandert nach KUNAMNENI et al [2008]

Abb. 6: Mogliche Mechanismen des Entstehens von Phenoxyradikalen durch: (A) Elektronentransfer und (B) Protonenaufnahme [FABBRINI et al, 2002]; Oxidationswege phenolischer Komponente durch Laccase (C) [CRESTINI et al, 2010]

Abb. 7: Flieftschema des Ablauts der Substratbehandlung

Abb. 8: Schematischer Aufbau des Versuchsreaktors

Abb. 9: Entwicklung der Massenmittel der behandelten Substrate nach 3h, 6h und 15h

Abb. 10: Molmassenverteilung der Proben nach 3h Behandlung durch verschiedene LMS und dem Originalsubstrat 137, gemessen mit UV

Abb. 11: Molmassenverteilung der Proben nach 6h Behandlung durch verschiedene LMS und dem Originalsubstrat 137, gemessen mit UV

Abb. 12: Molmassenverteilung der Proben nach 15h Behandlung durch verschiedene LMS und dem Originalsubstrat 137, gemessenen mit UV

Abb. 13: Molmassenverteilung der Proben nach 15h ABTS Behandlung mit Enzym, Blindwert (15h o.E.) und dem Originalsubstrat 137, gemessen mit UV

Abb. 14: Gegenuberstellung der Rl / UV - Elutionskurven (Signal normiert) der Blindwerte (13 u. 14), des ABTS-Versuches mit LM (9) u. ohne LM (12)

Abb. 15: Molmassenmittel, gemessen mit UV [g/mol], und Zucker [%]

Abb. 16: Molmassenmittel, gemessen mit Rl [g/mol], und Zucker [%]

Abb. 17: Fallausbeute [%] und Zucker [%], sortiert nach steigenderAusbeute

Abb. 18: Stickstoffgehalt in Abhangigkeit von der Versuchsdauer [h]

Abb. 19: Zuckergehalt gegen Konzentration der aliphatischen OH der Proben

Abb. 20: Gehalte an aromatischen Hydroxylgruppen, gruppiert nach Versuchsart und deren Vergleichsreferenz

Abb. 21 A: 31P-NMR Spektrogramm von Probe 9-15

Abb. 22: Ausgangssubstrat Probe 137 nach Fallung und Trocknung

Abb. 23: Probe 12 (15h ABTS-LMS) nach Fallung und Trocknung

Abb. 24: Molmassenverteilung der Proben nach 3h, 6h und 15h Behandlung mit HBT- LMS und erhohter Sauerstoffzufuhr; Blindwert (15h o.E.); gemessen mitRI

Abb. 25: Molmassenverteilung der Proben nach 3h, 6h und 15h Behandlung mit HBT- LMS und erhohter Sauerstoffzufuhr; Blindwert (15h o.E.); gemessen mitRI

1 Einleitung

Die Bereitstellung einer nachhaltigen Rohstoffbasis ist Grundvoraussetzung fur das Funktionieren von industriellen Produktionsprozessen. Biogene Materialien sind als Grundlage nachhaltigen Wirtschaftens schon seit Jahrzehnten wichtig. Die Verarbeitung selbiger in Bioraffinerien ist ein junges, aber keineswegs neues Konzept. Die Entwicklung wird angesichts der Verknappung fossiler Rohstoffe intensiv vorangetrieben. In Deutschland hat das, BMELV-geforderte Verbundvorhaben “Lignocellulose- Bioraffinerie II” die Realisierung einer Pilotanlage der dritten Generation zum Ziel. In Projekttragerschaft der Fachagentur "Nachwachsende Rohstoffe" soil eine sca/e-up-fahige, integrierte Anlage fur die chemisch-technische Nutzung von verholzter Biomasse entwickelt werden. Rohstoffe wie Buchen- und Pappelholz, insbesondere Restsortimente aus Forst- und Holzwirtschaft sollen als Rohstoffquelle dienlich sein. Ziel ist es Lignozellulose effektiv komponentenweise zu trennen und anschlieRend v.a. stofflich verwerten zu konnen. Technische Lignine sind aus okonomischen Gesichtspunkten die Produktgruppe mit der starksten Notwendigkeit zur Wertsteigerung. Derzeitige stoffliche Anwendungen decken einerseits Produktnischen (Bsp. Vanillin) oder Massensortimente (Bsp. Fullstoffe, Dispergiermittel) mit vergleichsweise geringer Wertschopfung ab. In Bioraffinerien ist das in groRen Mengen anfallende Nebenprodukt Lignin jedoch der entscheidende Schlussel zu Wirtschaftlichkeit und einer positiven okologischen Bilanz [PULS, 2007; WAGEMANN, 2010]. Aufgrund der guten Aufschlussresultate (Rindenanteil, Verzuckerung, Lignineigenschaften) ist das Organosolv-Verfahren vielversprechend fur groRere MaRstabe. Die marginalen Kenntnisse enzymatischer Modifizierung von Organosolv-Ligninen machen daher weitere Untersuchungen notwendig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeitwird der Effekt eines Laccase-Mediator-Systems auf Ligninsubstrate untersucht. Das Hauptaugenmerk wird Veranderungen, welche in Zusammenhang mit der Molekularmasse stehen konnten, beigemessen.

2 AllgemeinerTeil

2.1 Lignin

Lignin ist neben Zellulose das am meisten produzierte Polymer in der Natur. Der Begriff Lignin (lat. lignum) wird im Zusammenhang mit nativem Lignin und strukturell verandertem, technischem Lignin gleichermaRen benutzt. Ein durch Aufschluss modifiziertes Lignin ist hinsichtlich seiner Eigenschaften und Struktur stark verschieden zum Protolignin verholzender Gewachse. Pflanzenphysiologische Aufgaben ubernehmen sie v.a. in Zellwand, Zwickel und Mittellamelle. Durch seine mechanische Druckfestigkeit sorgt es fur die Stabilitat in den Zellen (ZW), durch seine adhasiven Eigenschaften fur den Zusammenhalt (ML) und besitzt daruber hinaus Bedeutung bei Abwehrmechanismen gegen Pathogene.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 1. Anteile an H/G/S Einheiten im Lignin der NH, LH und Graser nach NIMZ [1988]

Die meisten Pflanzen mit Hohenwachstum sind daher auf Lignin und seine Stutzfunktion angewiesen. Phyllogenetisch jungere Pflanzen (angiosperme LH ~63 Mio. Jahre) konnten andere Lignine entwickeln als ihre alteren Vorreiter (Cycadales, Poales, Ginkgoales, Coniferales >230 Mio. Jahre). LH enthalt i.d.R. mehr Lignin als NH. Die Lignine der verholzenden Pflanzen unterscheiden sich i.A. hinsichtlich der Monomere aus denen sie sich zusammensetzen (Tab. 1). Die drei wichtigsten Phenylpropaneinheiten (H/G/S) sind im NH-, LH- und Monokotylen-Lignin charakteristisch verteilt [FAIX, 2003]. Deren monomeren Vorstufen, die p-Hydroxyzimtalkohole, werden durch den Shikimat-Stoffwechselweg bereitgestellt. Sinapylalkohol, p-Cumarylalkohol und Coniferylalkohol werden anschlieRend enzymatisch oxidiert. Die hier zum Einsatz kommenden Ein-Elektronen-Transferasen sind verantwortlich fur das Radikalisieren der Vorstufen zu mesomeren Phenoxyradikalen (Abb. 1). Die Vielfalt anzutreffender Bindungen (Tab. 2) im Ligninmakromolekul hangt mit dem radikalischen Charakter seiner Polymerisation zusammen. Einerseits fuhrt die Ladungsdelokalisierung im Radikal zu einer groRen Fulle an moglichen Bindungen, jedoch verursacht die starkere Polarisierung am phenolischen Sauerstoff des Radikals die vermehrte Bildung der p-O-4, also Arylether- Bindungen. Die klassische Schule K. Freudenbergs geht vom Einfluss der statistischen Polymerisation von pH-Wert, lonenkonzentration und der Zufuhrgeschwindigkeit der monomeren Vorstufen aus. [FAIX, 2003]. So finden sich auch innerhalb einer Klasse von Ligninen sehr variable H/G/S Verteilungen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 2. Auftreten der verschiedenen Bindungstypen im Fi-, Bi- und Bu-Lignin, nach SCHILD [1994]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das GS-Lignin eines Laubholzes ist u.a. charakterisiert durch die Verteilung der Bindungstypen. Von grower, v.a. technologischer, Bedeutung sind die Arylether-Bindungen. In der Buche machen Sie einen Anteil von bis zu 70 % aus. Durch die kontrollierte Spaltung einer p-O-4 Bindung ist NIMZ [1974] ein schematischer Entwurf(Abb. 2.) des Lignins eines LH (Bu) gelungen. Dieser hat, bis aufkleine Veranderungen, noch bis heute Gultigkeit.

Im Zuge der, zumeist auf die Gewinnung von Zellulose ausgelegten, Delignifizierung sollen (v.a. Aryl-Ether) Bindungen im Lignin (Tab. 2) gespalten und dabei eine Kondensation in Form von C-C Bindungen vermieden werden. Die dabei erzeugten technischen Lignine gelten als Nebenprodukt, schlagen sich jedoch in betrachtlichen Mengen nieder.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Ausschnitt aus dem Konstitutionsschema eines Buchenlignins nach NIMZ [1974]

2.2 Technische Lignine

Jedes Jahr fallen weltweit uber 5*1061 Lignin als Nebenprodukt bei der Zellstoffherstellung an. Der weitaus groRte Teil dieses technischen Lignins wird in Energie umgewandelt, also bei der Chemikalienruckgewinnung verbrannt. Lediglich ca. 2% der Gesamtmenge werden einer nicht-kalorischen Nutzung zugefuhrt. So kommt es, dass der Faktor Energie fur die meisten GroRbetriebe zu einer wichtigen Gewinnquelle geworden ist. Ein Grund dafur ist die nach wie vor mangelhafte Wertschopfung der stofflichen Verwendung.

Kommerzielle Lignine, d.h. heute vorwiegend schwefelhaltige Lignine. Die wichtigsten dieser Gruppe sind die Lignosulfonate, also Ligninderivate aus den verschiedenen Sulfitaufschluss-Verfahren. Ein enormes Marktaufkommen (~1*10[6]. t/a) [PULS, 2007] und der geringe Preis fuhren zum Einsatz in verschiedenen Massensortimenten (Dispergiermittel, Fullstoffe, Phenolharze).

Um aus technischen Ligninen eine Grundlage fur hoherveredelte Produkte zu schaffen sind einige elementaren Aspekte zu berucksichtigen. Konstante chemisch-physikalische Eigenschaften, schiere Verfugbarkeit zu einem gunstigen Preis und Homogenitat der gelieferten Lignine sind wunschenswert. Fur eine Weiterveredelung auf chemischem Weg ist ein hohes MaR an Losbarkeit und Reaktivitat begunstigend. Eine hohe Zahl an aliphatischen Hydroxylgruppen ist gewollt und erleichtert im Modifizierungsprozess die Funktionalisierung von technischen Ligninen. Lignosulfonate haben nur eine geringe Zahl an OH-Funktionen, bieten also wenige Angriffsstellen fur chemische Veredelung. Kraft-Lignine besitzen ebenfalls, bedingt durch den Aufschluss, eine relativ geringe Funktionalitat, werden zudem oftmals sogar nachsulfoniert. Im Gegensatz zu den Lignosulfonaten besitzen Kraflignine allerdings mehr phenolische Gruppen, was sie attraktiver fur den Einsatz in Phenolharzen macht. Gemeinsam haben beide die Schwefelhaltigkeit, was neben okologischen Aspekten auch eine schwierige Reaktionsfuhrung mit sich bringt NITZ [2001].

Eine andere groRe Gruppe bilden Lignine aus den Organosolv- Verfahren. Gro^technische Verfahren mit Organosolv-Delignifizierung sind jedoch zum aktuellen Zeitpunkt nicht realisiert. Technische Lignine die aus Kochungen mit organischen Losungsmitteln stammen, sind laut NITZ [2001] gut geeignet fur weitere Veredelungsschritte (z.B. in Thermoplasten). Dieser empfiehlt, im Widerspruch zu FAIX et al [1984], einen Verzicht auf Laubholzer als Rohstoff, da diese im S-Baustein durch ortho-Methoxyl-Funktionen eine Phenolgruppierung verhindern. Mit Hinblick auf die Zielstellung ein moglichst reines Lignin in hoher Ausbeute zu erhalten, wird NH aber als wirtschaftlich ungeeignet eingeschatzt. Die Grunde dafur sind v.a. die ungunstige Vernetzung durch eben diese zahlreichen Methoxyl-Gruppen im NH-Lignin [FAIX et al, 1984], AuRerdem erschwert das Auftreten zwei verschiedener Hemicellulosen- Fraktionen (Hexosen u. Pentosen) im NH die chemische Verarbeitung. Das ist im LH nicht der Fall (Xylan) [PULS, 2007],

Die Arbeit von KLEINERT [1976] uber die Delignifizierung mit Ethanol/Wasser lieferte Erkenntnisse uber gunstiges C2H50H/H20-Verhaltnis, Flottenzusammensetzung und Temperaturoptimum[1]. Auf dieser Basis fuhrte MENDE [2009] Versuche mit Buchenholzhackschnitzeln m./o.R.durch. Anhand dessen konnten Vorteile des Organosolv-Aufschlusses mithilfe katalytischer Mengen von H2S04 urn die Toleranz gegenuber Rinde erweitert werden. In Tabelle 3 sind wichtige Kenndaten der technischen Lignine aus Sulfit-, Kraft- und dem schwefelfreien Verfahren aufgelistet. Daraus geht hervor, dass Organosolv-Lignine neben ihrer Reinheit (schwefelfrei u. niedriger Aschegehalt) eine hohe Funktionalitat aufweisen, also zahlreiche OH-Gruppen besitzen. Die Molmassen liegen jedoch weit unter denen von Lignosulfonaten.

Tab. 3. Einige Eigenschaften von techn. Ligninen aus vier Aufschlussverfahren nach (1) NITZ [2001] und (2) PULS [2007]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3 Biokatalytische Modifizierung mit Enzymen

Von einer detaillierten Exkursion in die Enzymatik soil hier abgesehen werden, so stehen zahlreiche Lehrwerke aus verschiedenen Disziplinen in groRerZahlzurVerfugung [ROMPP, 1995; MYRBACK, 1953; EULER, 1925], Enzyme sind wichtige funktionelle Proteine und biologisch-chemische Katalysatoren. Sie nehmen an einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen teil (Abb. 3) und besitzen analoge Eigenschaften wie klassische, chemische Katalysatoren: So setzen sie die Aktivierungsenergie fur eine Reaktion herab indem die auftretende freie Enthalpie gesenkt wird. Gleichzeitig werden sie in der eigentlichen Reaktion nicht selber umgesetzt, sondern katalysieren lediglich deren Zustandekommen [ROMPP, 1999].

Seit geraumer Zeit werden Enzyme als nutzliches Werkzeug in biotechnologisch-industriellen Prozessen eingesetzt. Ein Vorteil gegenuber klassischen, chemischen Katalysatoren ist der groRe Reaktionsdurchsatz und die hohe Reaktionsspezialisierung welche durch die sterische Anordnung an ihren aktiven Zentren zu erklaren ist. Auf diesem Wege konnen ungewollte Nebenprodukte groRtenteils ausgeschlossen werden. Ein Aspekt von bedeutender okonomischer Relevanz ist das Ablaufen der katalysierten Reaktionen in relativ sanften Milieus (pH, Temperatur, Druck). Dies bringt in groRtechnischen Prozessen immense energetische und damit wirtschaftliche Einsparungen mit sich [FESTEL et al, 2004],

2.3.1 Laccase und seine biologischen Funktionen

Ein Enzym was in diesem Zusammenhang immer mehr an Bedeutung gewonnen hat ist Laccase. Im Gegensatz zu anderen Phenoloxidasen, ist lediglich Sauerstoff zu ihrem Funktionieren notwendig. Laccase, eine p- diphenol:02-Oxidoreduktase (EC 1.10.3.2), wurde erstmals in Studien uber die ungewohnlich rasche Verhartung des Wundsaftes des asiatischen Lackbaumes (Rhus spp.) durch YOSHIDA [1883] erwahnt. Die spatere Isolierung und Quantifizierung des Enzyms aus dem Splintholz von Rhus spp. [BERTRAND, 1894] ist der Beginn vieler Forschungen zur Laccase. Gemeinsam mit Ascorbatoxidase und Caruloplasmin (ein plasmatisches Protein der Saugetiere) gehort Laccase der Gruppe der sogenannten blauen Kupferproteine an [REINHAMMAR und MALSTROM, 1981].

Laccasen sind in vielen Organismen anzutreffen und nehmen unterschiedliche Rollen in deren biochemischen Prozessen ein (Abb. 3). So findet man sie in Pflanzen und Pilzen (z.B. Trametes spp.) [MAYER, 1987], Bakterien wie Myceliophtora spp. [GIVAUDAN et al, 1993], und sogar in Insekten [SIDIJANSKY, 1997], Trotz der schieren Diversitat innerhalb dieser Gruppe von Enzymen, ist relativ wenig bekannt uber die vielfaltigen biologischen Funktionen. Im Pflanzenreich sind Laccasen an der Ligninbiosynthese beteiligt, bei Insekten an der Chitinbiosynthese. Uber die Funktion der bakteriellen Laccase ist relativ wenig bekannt, vermutlich spielen sie eine Rolle bei der Verkapselung von Frerndkorpern.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Im Stoffwechsel von Pilzen, v.a. Ascomyceten, Deuteromyceten und Basidiomyceten, nehmen sie Funktionen bei Morphogenese und Ligninolyse wahr [RANOCHA et al, 2000]. Verschiedene WeiRfaule-Pilze sind wegen ihrer Fahigkeit Lignin katalytisch abzubauen bekannt. Die direkte Beteiligung extracellularer Laccase an der Lignindegradierung istjedoch nicht abschlieRend geklart. [THURSTON, 1994], Kenntnisse uber eine Korrelation der Ligninzersetzungsrate mit der Enzymproduktion bzw. deren exokrinen Aktivitat deuten aber aufeinen noch nicht verstandenen Zusammenhang hin [YOUNG et al, 2001],

2.3.2 Anwendungen von Laccase und LMS

Neben den vielen, teilweise ungeklarten biologischen Wirkungszusammenhangen treten pilzliche Laccasen in verschiedenen technologischen Anwendungen in Erscheinung. Eine Ubersicht uber biologische und technologische Aufgaben der Laccase geben MAYER & STAPLES [2002], Dabei steht im Vordergrund, dass die substratspezifisch katalysierende Aktivitat der Laccase ausreicht um eine groRe Anzahl an Folgereaktionen nutzen zu konnen. Daher ist das Enzym fur eine groRe Anzahl von biotechnologischen Anwendungen geeignet, wie z.B. dem enzymatischen Klaren von Frucht- und Weinmosten (Phenolkomplexierung) [SERVILI et al., 2000], dem Deinking von Altpapier [HAGER, 2001], fur die Bleiche in der Textilindustrie[2] [CAMPOS et al, 2001] und in sogenannten Bio-Sensoren [GHINDILIS et al., 2000]. Genetisch modifizierte Laccasen (erhohte Inhibierungstoleranz) konnen auRerdem fur die Ethanolproduktion nutzlich sein [MEYER & STAPLES, 2002], In der HWS- Industrie wird die Anwendung von Laccase zur enzymatischen Aktivierung von Holzfasern seit Mitte der 90'er Jahre untersucht. Ergebnisse zeigten, dass nach Festbett-Fermentation von Hackschnitzeln, die mechanischen Festigkeiten von daraus produzierten MDF-Platten erhoht werden konnten. Dafurwurde Material mit Laccase aus WeiR-/Braunfaulekulturen inkubiert und anschlieRend mit geringen Mengen UF, PF und PDI ausgepresst. Problematisch in diesem Zusammenhang sind die ungunstigen hygroskopischen Eigenschaften (Quellen/Schwinden) derWerkstoffe [HUTTERMANN et al, 2001],

Ein fur die Papierwirtschaft wichtiges Anwendungsfeld ist die Zellstoffbleiche. THURSTON [1994] gibt als typische Substrate der Laccase Polyphenole, methoxysubstituierte Phenole, Diamine und eine Reihe anderer an. Er vermutet jedoch das Substratspektrum sei, untypischerweise fur ein Enzym, breiter als bekannt. Da die Wirkung von Laccasen im Zusammenhang mit Delignifizierung von Zellstoffen anfangs nurwenig befriedigende Ergebnisse zeigte wurde versucht das Substratspektrum des Enzyms zu erweitern. Erkenntnisse von BOURBONNAIS et al [1990], zur mediativen Funktion von niedermolekularen Substanzen wie ABTS, zogen eine Reihe von weiterfuhrenden Experimenten nach sich [BOURBONNAIS, 1995]. Demnach konnte die Kombination aus Mediator und Laccase auch an nicht-phenolischen (Etherbindung) Bindungen, also dem weitaus groReren Teil im Lignin (vgl. 2.1 Tab. 2), oxidativ wirken. Das technologische Laccase-Mediator-System (LMS) war entdeckt worden.

Das LMS ist eine funktionelle Redoxeinheit, in der niedermolekulare Verbindungen die Rolle eines Mediators, also eines Elektronen"sfruff/es", einnehmen. Eine vereinfachte Darstellung dieser Redoxkaskade zeigt Abb. 4. Eine umfangreiche Arbeit von MUCKE & CALL [1997] beschreibt umfangreicher welche lignolytischen Prozesse im LMS ablaufen konnten. BOURBONNAIS et al [1997], POTTHAST et al [2001], HUI-LING et al [2009] und ARESKOGH et al [2010] zeigten dass Laccase aus Trametes-Stammen verschiedene Lignin- Modell-Substanzen[3] erfolgreich oxidieren und verknupfen kann. Ahnliche Experimente haben UCHIDA et al [2001] mit Bisphenol(A) als Substrat, jedoch ohne Mediator, erfolgreich durchgefuhrt. Die T. versicolor-Laccase wirkte polymerisierend und spaltend zur gleichen Zeit, was sich in Erhohung und Verkleinerung des Molekulargewichtes niederschlug. Auch POTTHAST et al [2001] konnten nachweisen, dass polymerisierende und depolymerisierende Effekte im LMS gleichermaRen auftreten konnen. Die Wahl des richtigen Mediators und der entsprechenden Reaktionsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Zeit, Substratkonzentration, etc.) sind entscheidend fur das Erzielen des gewunschten Effektes.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Oxidation unublicher Substrate mithilfe von Mediatoren in einer Redoxkaskade (A) und Redoxpotentiale der Mediatorenoxidation durch Laccase (B); geandert nach KUNAMNENI et al [2008]

2.3.3 Mediatoren

Mediatoren (lat. mediator: Mittler) konnen kleine Molekule sein die als Elektronen-Vermittler zwischen Substrat und oxidativem Enzym wirken. So konnen Substrate die sterisch nicht mit den aktiven Zentren des Enzyms kompatibel sind, Oder aufgrund des Reaktionsmechanismus von der Enzymaktivitat ausgeschlossen bleiben, oxidiert werden [FABBRINI et al, 2002], lm folgenden wird knapp auf die experimentell relevanten Mediatoren eingegangen. Abbildung 5 zeigt neben ABTS und HBT weitere, teils aus Lignin isolierte, naturliche Mediatoren.

HBT (1-Hydroxy-Benzotriazol) ist ein weiRes Pulver das in Wasser schwer loslich ist, aber mit organischen LM gelost werden kann. In aerober Umgebung wird mithilfe des LMS das Benzotriazolyloxid-Radikal gebildet [HAGER, 2001]. Dieses soil im Rahmen der Redoxkaskade die Rolle der aktiven Agens gegenuber dem Substrat einnehmen [BOURBONNAIS, 1990].

Die inhibierende Wirkung von HBT auf Trametes-Laccasen sind von BOURBONNAIS et al [1997] untersucht worden. Sie kommen zu dem Ergebnis, dass HBT das Enzym teilweise deaktiviert und eventuell eine erhohte Laccase- Dosis dies kompensieren kann.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: Chem. Struktur einiger reprasentativer, kunstlicher (ABTS, HBT, TEMPO) und naturlicher Mediatoren (Acetosyringon (A), Acetovanillon (B), Syringaldehyd (C), Vanillin (D)), verandert nach KUNAMNENI et al [2008]

[...]


[1] C2H50H./H20-Verhaltnis 50/50; Flotte1:4; Topt=185°C

[2] Durch Behandlung mit Cellulasen ("stonewash-Jeans") und Laccasen (Indigo-Entfarbung) konnen Textilien umweltfreundlicher produziert werden.

[3] phenolische Mono-/Di-/Oligomere werden in der Lit. als lignin model compounds bezeichnet

Ende der Leseprobe aus 56 Seiten

Details

Titel
Untersuchungen zur enzymatischen Modifizierung von Lignin
Hochschule
Universität Hamburg
Veranstaltung
Holzwirtschaft
Note
1,7
Autor
Jahr
2011
Seiten
56
Katalognummer
V208233
ISBN (eBook)
9783656372714
ISBN (Buch)
9783656372943
Dateigröße
1870 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
untersuchungen, modifizierung, lignin
Arbeit zitieren
Goran Schmidt (Autor:in), 2011, Untersuchungen zur enzymatischen Modifizierung von Lignin, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/208233

Kommentare

  • Noch keine Kommentare.
Blick ins Buch
Titel: Untersuchungen zur enzymatischen Modifizierung von Lignin



Ihre Arbeit hochladen

Ihre Hausarbeit / Abschlussarbeit:

- Publikation als eBook und Buch
- Hohes Honorar auf die Verkäufe
- Für Sie komplett kostenlos – mit ISBN
- Es dauert nur 5 Minuten
- Jede Arbeit findet Leser

Kostenlos Autor werden