Lade Inhalt...

Saccharosetransporter in Solanacae, Solanum tuberosum und Nicotiana tabacum

Lokalisation und Interaktion

Masterarbeit 2012 57 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Saccharose, das Substrat der Saccharosetransporter
1.2 Saccharosetransporter höherer Pflanzen
1.3 Die verschiedenen Saccharosetransportertypen
1.4 Saccharosetransporter in Solanaceae
1.4.1 SUT1
1.4.2 SUT2
1.4.3 SUT4
1.5 Interaktionspartner der Saccharosetransporter

2. Material/Methoden
2.1 Material
2.1.1 Stämme
2.1.2 Pflanzen
2.1.1 Kulturmedien und -platten
2.1.2 Verwendete Oligonukleotide
2.1.3 Antikörper
2.1.4 Chemikalien, Enzyme, Kits und Geräte
2.1.5 Plasmide
2.2 Methoden
2.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.2.1 Restriktion
2.2.2 Konstruktion von Plasmiden mittels GATEWAY-Technologie
2.2.1 Ligation
2.2.2 DNA-Gelektrophorese
2.2.3 Sequenzierungsreaktion
2.2.4 Samensterilisation
2.2.5 Pflanzenanzucht
2.2.6 Transformation
2.2.7 RNA-Extraktion
2.2.8 RNA-Gelelektrophorese
2.2.9 Reverse Transkription
2.2.10 Real time PCR (qPCR).
2.2.11 Einbettung in LRWhite
2.2.12 Western Blot
2.2.13 Fluoreszenzmikroskopie
2.2.14 Konfokale Laserscanningmikroskopie

3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Lokalisation
3.1.1 SUT2
3.1.2 SUT4
3.2 Interaktionspartner
3.2.1 Diverse Reagenzien
3.2.2 SUT2 vs. v-SNARE..
3.2.3 SUT2 vs. BAK1
3.2.4 SUT2 vs. MSBP1
3.2.5 Funktion von MSBP1

4. Zusammenfassung

5. Literaturverzeichnis

6. Anhang

1. Einleitung

1.1 Saccharose, das Substrat der Saccharosetransporter

Saccharose ist die inerte Transportform von Glukose und Fruktose, zwei energiereichen Verbindungen, die aus Triosephosphaten des Calvinzyklus hergestellt werden und Voraussetzung für die heterotrophe Ernährung der Pflanze sind. Saccharose wird nach der Bildung im Cytoplasma entweder in der Vakuole gespeichert oder für den Transport in photosynthetisch weniger oder gar nicht aktive Organe („sinks“) durch Saccharosetransporter, sogenannte SUTs (Sucrose Transporter), ins Phloem transportiert (Abb.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Lage und Funktion von Saccharosetransportern (rote Punkte mit schwarzem Pfeilen) bei der Verteilung der Saccharose in Pflanzen, Bild oben links: Leitbündel eines Arabidopsis thaliana source-Blattes, grün – fluoreszenzmarkierter PmSUC1, rot Antikörper gegen SE – Siebelemente (blau), CC – Begleitzellen (orange), XY – Xylem (rot), PD – Plasmodesmen, SC – Sink-Zelle, MC – Mesophyllzelle, ULD – Abladedomäne, Vac – Vakuole, aus Sauer et al. 2007.

Der Transporter baut durch den ATP-verbrauchenden Prozess im „source“-Gewebe eine Konzentration auf, die über ein Gefälle zu den sink-Organen einen energielosen Transport ermöglicht. In sink-Organen wie heranwachsenden Blätter oder Wurzeln wird die Saccharose wiederrum durch Saccharosetransporter entweder apoplastisch, d.h. durch Diffusion der Assimilate in den freien Diffusionsraum der Zellwände nach aktiver Abgabe durch die Plasmamembran, oder symplastisch im Zytoplasma der durch Plasmodesmen miteinander verbundenen Zellen in die bedürftigen Gewebe weitertransportiert.

1.2 Saccharosetransporter höherer Pflanzen

Saccharosetransporter wurden zuerst in Spinacia oleracea (Spinat) und Solanum tuberosum (Kartoffel) entdeckt[1]. Die Transportfunktion entdeckte man, indem man in einen Hefestamm, der selber keine Saccharose aufnehmen konnte, cDNA-Banken aus Spinat und Kartoffel integrierte und dieser fortan auf saccharosehaltigem Medium wachsen konnte. In der Folge konnten weitere Saccharosetransporter identifiziert werden. Der überwiegende Teil wurde im Phloemgewebe reifer Blätter lokalisiert. Es konnten aber auch Exemplare in Wurzeln[2], Samen[3] und Blütenorganen[4] nachgewiesen werden.

Alle bisher gefundenen Transporter sind stark hydrophobe Proteine, bestehen aus ca. 500 Aminosäuren und haben ein Molekulargewicht von ca. 55 kDa. Die zwölf Transmembrandomänen formen ein integrales Membranprotein, das in der Mitte eine hydrophile Schleife besitzt, die zusammen mit n- und c-Terminus ins Zytoplasma ragt (Abb. 2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Tertiärstruktur der Saccharosetransporter mit transmembranen Helices (I-XII), aus Sauer et al. 2007.

Aufgrund dieser 6-Schleife-6-Struktur werden die Saccharosetransporter zur „Major Facilitator Superfamily“ gezählt. Zusammen mit tierischen Zuckertransportern, dem Glukosecotransporter der Hefe und Pflanzen sowie dem Zucker/-H+-Transporter aus Bakterien bilden sie eine Untergruppe dieser Familie.

Der Transport erfolgt mittels eines H⁺-gekoppelten Symports[5]. Reguliert werden die Transporter nicht nur auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf posttranslationaler Ebene durch die Aktivität der H⁺-ATPase sowie durch Phosphorylierung[6].

1.3 Die verschiedenen Saccharosetransportertypen

Durch phylogenetische Untersuchungen ist eine Einteilung der Saccharosetransporter in drei Gruppen möglich.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Unterfamilien der Saccharosetransporter, aus Kühn 2003.

Der Einteilung wurden Funktion, Sequenzhomologie und Substrataffinität der jeweiligen Transporter zugrunde gelegt (Abb. 3).

Auffällig ist dabei, dass SUT1 in einigen Spezies mit mehreren Homologen vertreten ist, während SUT2 und SUT4 fast immer nur einzeln vorhanden sind. Daran erkennt man die möglicherweise evolutionär wichtigere Bedeutung von SUT1[7]. Tatsächlich hat SUT1 mit der Phloembeladung der Saccharose die wichtigste Aufgabe der Saccharosetransporter zugewiesen bekommen. Er hat mit einem Km von 0,3 bis 2 mM eine hohen Affinität zu Saccharose.

SUT2 werden eher sensorische bzw. regulatorische Aufgaben (Km= 5-6 mM) zugeschrieben[8]. Er unterscheidet sich von den anderen Transportern durch weit ins Zytoplasma ragende Domänen (Abb. 4).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Vergleich der Tertiärstrukturaller Saccharosetransporter, aus Sauer et al. 2007.

SUT4 könnte die Aufgabe des Saccharosetransports aus der Vakuole auferlegt sein[9]. Allerdings ist SUT4 nur zu 47% mit SUT1 identisch[10].

1.4 Saccharosetransporter in Solanaceae

Die Familie der Nachtschattengewächse (Solanaceae) umfasst 1700 Arten von dikotylen Pflanzen. Ihnen wird unter anderen neben Tabak und Tomate auch die Kartoffel zugeordnet.

1.4.1 SUT1

SUT1 wurde zuerst entdeckt und als wichtigster Saccharosetransporter in Solanaceae ausgemacht[11]. Er ist vor allem im source-Gewebe lokalisiert (Abb. 5).

Abbildung 5: Northern Blot von LeSUT1 in verschiedenen Organen, aus Barker et al. 2000.

Diese Lokalisierung ist nachvollziehbar, da viel SUT1 in dem am stärksten Saccharose produzierenden Gewebe notwendig ist, um einen ausreichenden Konzentrationsgradienten aufzubauen und somit die Saccharose effektiv in der Pflanze zu verteilen.SUT1 aus Solanum tuberosum wurde durch Immunolokalisation nicht nur im Phloem kleinerer Blattadern, im Transportphloem größerer Adern und der Mittelrippe von source-Blättern, Stängel und Blattstielen, sondern auch im Entladungsphloem von sink-Blättern, Wurzeln und Knollen nachgewiesen[12]. Damit hat SUT1 außer einer Beladungs- und Gradientenaufbaufunktion, womöglich auch eine Entladungsfunktion in den Zielorganen. Er ist Mitglied der high-affinity-Transporterunterfamilie und hat einen Km-Wert[13] von 1 mM.

1.4.2 SUT2

SUT2 wurden in der Plasmamembran von Siebelementen der Tomate[14], des Breitwegerichs[15] und Arabidopsis[16] festgestellt. Eine Transportfunktion für SUT2 konnte bisher nicht nachgewiesen werden. Man geht derzeitig von einer sensorischen bzw. regulatorischen Rolle hinsichtlich SUT1 und SUT4 aus[17]. Sobald SUT2 in Hefe mit SUT1 koexprimiert wird, nimmt SUT1 bis zu zehnfach weniger Saccharose auf[18].

1.4.3 SUT4

SUT4 wird in Solanacaea in geringem Maße in sink-Organen, in größeren Blattadern von source-Geweben, in der Mittelrippe, Stängeln und Blattstielen exprimiert[19]. Er hat mit einem Km-Wert von 6 ± 1,2 mM eine geringere Affinität zu Saccharose als SUT1. Jedoch weist er eine sehr hohe Substratspezifität auf. Die Analyse von SUT4-mRNA in reifen Blüten lässt vermuten, dass SUT4 einem diurnalen Rhythmus unterliegt[20]. Es wurde zudem eine Interaktion mit SUT1 gezeigt. Welche Rolle diese Wechselwirkung hat, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden. Es wird vermutet, dass SUT4 der Inhibitor von SUT1 ist, da StSUT4-RNAi-Pflanzen denselben Phänotyp inklusive verfrühtem Blühen wie SUT1 überexprimierende Pflanzen zeigen[21].

Die genaue Lokalisation von SUT4 in Solanaceae ist nicht zweifelsohne bekannt. Es deutet aber viel auf eine Lokalisation in der Vakuole hin. HvSUT2 aus Gerste, der AtSUT4, LeSUT4 und StSUT4 sehr ähnlich ist, wurde als vakuoläres Protein identifiziert und eine Funktion bei der Saccharoseentladung der Vakuole postuliert[22]. GFP-Fusionsexpressionen von AtSUT4 zeigten ebenfalls eine Lokalisation in der Vakuolenmembran. Andererseits wurde er bei heterologer Expression in S. cerevisae oder Xenopus laevis in der Plasmamembran gefunden und konnte den Wachstumsdefekt auf saccharosehaltigem Medium aufheben[23]. Die Aufnahme von Saccharose ist topologisch dem Import über die Plasmamembran äquivalent, so dass man von einer Entladungsfunktion der Vakuole ausgehen kann.

SlSUT4 der Tomate und StSUT4 der Kartoffel wurden wiederholt in der Plasmamembran gefunden[24]. Dem entgegen wurde kürzlich publiziert, dass NtSUT4 im Tonoplasten verortet ist[25]. Darüber hinaus wurden AtSUC4 und SlSUT4 im Tonoplasten nachgewiesen. Ein Saccharosetransport aus der Vakuole ins Cytoplasma durch H+-Symport konnte ebenfalls gezeigt werden[26].

1.5 Interaktionspartner der Saccharosetransporter

In einem Split-Ubiquitin-Screen mit SUT2 wurden unter anderem die Interaktionspartner v-SNARE, BAK1 (BRI1 Associated receptor Kinase 1) und MSBP1 (Membran Steroid bindendes Protein 1) gefunden[27].

V-SNARE (vesicle synaptosome-associated protein receptor) ist ein Protein, das die Vesikelfusion und -zielsteuerung vermittelt[28].

MSBP1 ist ein zellulärer Inhibitor im Brassinosteroidsignalweg in Arabidopsis thaliana[29].

Abbildung 6: Funktion von MSBP1, aus Li et al. 2009.

Er verhindert dort die Verbindung von BRI1 (brassinosteroid-insensitive1, Rezeptor) und BAK1 (Corezeptor), welche zusammen für die Brassinosteroidrezeption der Zelle zuständig sind[30], indem er die Endozytose von BAK1 herbeiführt[31] (Abb. 6).

MSBP1 stellt somit einen zelleigenen membranständigen Hemmstoff für Brassinosteroide (BR) dar. BR fördern unabhängig von anderen Phytohormonen Wachstum von Pflanzen, vegetative und reproduktive Entwicklung, Keimung, Seneszenz und Antworten auf verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren[32]. Ein wichtiges Gen bei der Synthese ist unter anderem Diminuto. Es wandelt 24-Methylenecholesterol in Campesterol, einen Vorläufer der Brassinosteroide, um[33]. Mutanten, deren BR Synthese oder Perzeption durch Ausschaltung bestimmter Gene manipuliert ist, zeigen schwere Wachstumsdefekte wie kurze Hypokotyle, Zwergwuchs von Keimlingen und reifen Pflanzen, kurze Blattstiele, dunkelgrüne Blätter, verzögerte Blütenbildung und reduzierte männliche Fruchtbarkeit[34].

Pflanzen mit erhöhter BR Synthese oder Perzeption müssten daher eine verfrühte Blütenbildung zeigen. Der Blühvorgang wird jedoch durch ein verzweigtes Netz von Signalwegen reguliert, auf die BR einwirken (Abb. 7).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Blühinduktionsnetzwerk von Arabidopsis thaliana, aus Li et al. 2010.

Der Brassinosteroidsignalweg setzt wie der autonome und der Vernalisationsweg bei FLC (Flowering Locus C), einem Blühinhibitor, ein (Abb. 8).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8: Einfluss von Brassinosteroiden und MSBP1 auf das Blühverhalten von Arabidopsis thaliana, modifiziert aus Li et al. 2010.

Ankommendes Brassinosteroid wird über BRI1 und BAK1 erkannt. In der Folge wird durch Unterdrückung des Repressors von FT (Flowering Locus T) der Blühvorgang eingeleitet.

Weitere beim Blühen wichtige Regulatoren sind SOC1 (Suppressor of Constans 1), ein Rückkopplungsprotein für CO (Constans), einem Signalportein im photoperiodischen Blühinduktionsweg, welches wiederrum durch GI (Gigantea) aktiviert wird (Abb. 7).

2. Material/Methoden

2.1 Material

2.1.1 Stämme

Tabelle 1:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2 Pflanzen

Tabelle 2:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.1 Kulturmedien und -platten

E. coli – Wachstums/LB-Medium:

NaCl 10g/l

Hefeextrakt 5g/l

Bacto-Trypton 10g/l

pH = 7,0

für Agarplatten: 15g/l Agar

A. tumefaciens – Wachstumsmedium (YEB):

Hefe-Extrakt 10g/l

Bacto-Pepton 10g/l

NaCl 5 g/l

Antibiotika: Ampicillin 100 mg/l, Rifamycin 100 mg/l, Kanamycin 50 mg/l

für Agarplatten: 15g/l Agar

MS-Medium:

Murashige und Skoog-Medium 4,4 g/l

MES (2-Morpholinoethanesulfonsäure) 0,5g/l

pH 6,0

für Agargefäße: 6 g/l Agar

Keimungsmedium:

Murashige & Skoog + minimal organics (MSMO, Sigma M 6899) 4.4 g/l

Saccharose 30 g/l

pH 5,8 (KOH)

Konditionierungsmedium:

MSMO 4.4 g/l

NAA 1 mg/l

BAP 0,1 mg/l

Saccharose 30 g/l

Agar 0,6 %

pH 5,8

Selektionsmedium:

MSMO 4,4 g/l

Thiamin 9,6 mg/l

Nikotinsäure 1 mg/l

Pyridoxine 1 mg/l

trans-Zeatin 1 mg/l

Kanamycin 35 (50, 100) mg/l

Cefotaxim 250 mg/l

Agar 0,6 %

Saccharose 30 g/l

pH 5,8

Wurzelmedium:

MSMO 4,4 g/l

Thiamin 9,6 mg/l

Nikotinsäure 1 mg/l

Pyridoxine 1mg/l

IAA 0,1 mg/l

Kanamycin 20 mg/l

Cefotaxim 250 mg/l

Agar 0,6 %

Saccharose 30 g/l

pH 5,8

[...]


[1] Riesmeier et al. 1992, 1993.

[2] Shakya et al. 1998.

[3] Weber et al. 1997.

[4] Lemoine 2000.

[5] Kühn et al. 2010.

[6] Kühn et al. 2010.

[7] Außer z.B. in Hevea brasiliensis.

[8] Özcan et al. 1998

[9] Schneider et al. 2012.

[10] Blastanalyse.

[11] Barker et al. 2005.

[12] Kühn et al. 2003.

[13] Riesmeier et al. 1993.

[14] Barker et al. 2000.

[15] Barth et al. 2003.

[16] Meyer et al. 2004.

[17] Özcan et al. 1998.

[18] Reinders et al. 2002.

[19] Weise et al. 2000.

[20] Chincinska et al. 2008.

[21] Chincinska et al. 2008.

[22] Endler et al. 2006.

[23] Weise et al. 2000, Payyavula et al. 2011, Reinders et al. 2008.

[24] Weise et al. 2000, Chincinska et al. 2008, Kühn et al. 2010.

[25] Okubo-Kurihara et al. 2011.

[26] Schneider et al. 2012.

[27] Doktorarbeit Undine Krügel, HUB.

[28] Schiavo et al. 1997.

[29] Yang et al. 2005.

[30] Li et al. 2002.

[31] Li et al. 2009.

[32] Szekeres et al. 1996.

[33] Choe et al. 1999.

[34] Szekeres et al. 1996.

Details

Seiten
57
Jahr
2012
ISBN (eBook)
9783656346128
ISBN (Buch)
9783656421429
Dateigröße
4.3 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v207176
Institution / Hochschule
Humboldt-Universität zu Berlin
Note
2,9
Schlagworte
Biologie Sucrose Saccharose Transporter Lokalisation Lokalisierung YFP GFP Fluoreszenz MSBP1 membran steroid binding protein

Autor

Teilen

Zurück

Titel: Saccharosetransporter in Solanacae, Solanum tuberosum und Nicotiana tabacum