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Immunmonitoring bei Patienten mit Multipler Sklerose unter Therapie mit ß-Interferonen - Aufdecken von Wirkmechanismen und Suche nach prognostischen Markern

von Benedikte Sabina Kühne (Autor)

Doktorarbeit / Dissertation 2003 195 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Leseprobe

INHALTSVERZEICHNIS

Abkürzungen

I. ZUSAMMENFASSUNG

II. EINLEITUNG
Teil A: Multiple Sklerose als Erkrankung
1. Autoimmunität: Reaktionen gegen körpereigene Antigene
2. Morphologische Veränderungen und daraus resultierende Symptome
3. Wesentliche Klinische Verlaufsformen
4. Ätiologische Faktoren
5. Molekulare Pathogenese
6. Therapie mit rekombinantem Beta-Interferon (rIFN-ß)
6.1. Wirkhypothese des rIFN-ß
7. Heterogenität
8. Prognostische Surrogat-Marker
Teil B: Labor-Methoden für das Screening immunologischer Surrogat-Marker
1. Die Polymerase-Ketten-Reaktion
2. „Real-Time” und „On-Line“ PCR
3. Prinzip der „real-time“ PCR zur Bestimmung einer Startkopienzahl
3.1. Unterschied zur konventionellen PCR
3.2. Der CP-Wert
4. Das LightCycler®-System
5. Fluoreszenz-basierte Detektionsformate
5.1. Unspezifische Detektion mittels SYBRÒ- Green I
5.2. Hybridisierungssonden für eine Sequenz-spezifische Detektion
6. Schmelzkurvenanalyse
7. Reverse Transkription - Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
8. RT-PCR Quantifizierungsprinzipien
Teil C: Ziele der Arbeit

III. MATERIAL UND METHODEN
Teil A: Der klinische Bereich
1. Allgemeines Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
2. Untersuchte Patientenkollektive
2.1. Untherapiertes Kollektiv (Kontrollgruppe)
2.2. ß-Interferon Therapierte Kollektive (Therapiegruppen)
2.2.1. rIFN-ß1a (RebifÒ) Therapiertes Kollektiv
2.2.2. rIFN-ß1b (BetaferonÒ) Therapierte Kollektive
2.3. Gesundenkollektiv
2.4. Verwandtschaftsbeziehungen von Patienten der untersuchten Kollektive
3. Dokumentation von Patientendaten aus dem klinischen und wissenschaftlichen
Bereich: Entwicklung eines EDV-gestützten Dokumentationssystems zur
Erfassung von Patientendaten (Access-Datenbank)
4. Klinische Methoden
4.1. Klinische Untersuchungen
4.2. Schübe
4.3. EDSS
Teil B: Der labormethodische Bereich
1. Material
1.1. Chemikalien
1.2. Materialien
1.3. Humanes Probenmaterial
2. Molekularbiologische Arbeiten
2.1. Von der RNA-Isolation zur Reversen Transkription
2.1.1. Vorbereitung der Proben während der MS-Sprechstunde
2.1.2. RNA-Isolation mit Durchführung eines DNase-Verdaus
2.1.3. Konzentrationsbestimmung der RNA im Photometer
2.1.4. cDNA-Synthese
2.2. Messung der Genexpression mittels quantitativer „Real-Time“ RT-PCR
2.2.1. Strategie für die RT-PCR Optimierungen
2.2.2. Oligonukleotide
2.2.3. Plasmid-Standards
2.2.4. Externe Standardkurven für den Import in verschiedene PCR-Läufe
2.2.5. „Real-Time“ PCR unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelz- kurvenanalyse
2.2.6. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender
Schmelzkurvenanalyse
2.2.7. Quantitative „Real-Time“ PCR unter Verwendung von „Hybridization Probes“
2.2.8. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von „Hybridization Probes“
2.2.9. Gel-Elektrophorese
3. Immunologische Arbeiten
3.1. Prinzip
3.2. sIL-4R
3.3. „ModuleSets®“ (TNF-beta; sICAM-1; sVCAM-1) und „CytoSets®“ (sTNF-R1, sTNF-R2)
4. Statistische Analysen

IV. ERGEBNISSE
Teil A: Quantitative „Real-Time“ und „On-Line“ RT-PCR
1. Etablierung und Validierung der quantitativen 2-step „Real-Time“ RT-PCR
1.1. RNA-Isolation und Reproduzierbarkeit der cDNA-Synthese
1.2. Linearitätsbestimmung der cDNA-Synthese
1.3. Allgemeine Optimierungen der PCR-Reaktionen
1.4. Reproduzierbarkeit der „Real-Time“ PCR: Intra- und Inter-Assay Variationen
1.5. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven
1.6. Reproduzierbarkeit der importierten Plasmid-Standardkurven
1.7. Dynamischer Bereich der Quantifizierung mittels kinetischer Analyse
1.8. PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmid-Standard im Vergleich zu Patienten-cDNA
1.9. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung von Zytokin-mRNAs
1.9.1. Einfluss einer ß-Interferon Therapie auf die Expression von PBGD
Teil B: Ergebnisse aus der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
1. Ausgangssituation: Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline)
1.1. Homogenitätsprüfungen der demographischen Daten und der gemessenen immunologischen Parameter
1.1.1. Strukturvergleich aller MS-Patienten mit den gesunden Probanden
1.1.2. Strukturvergleich der Kollektive mit unterschiedlicher Verlaufsform: Schubförmig- remittierend (RR-MS) mit sekundär chronisch-progredient (SP-MS)
1.1.3. Strukturvergleich der drei RR-MS Kollektive: Untherapiert mit Rebif mit Betaferon
1.1.3.1. Strukturvergleich der untherapierten Patienten mit den Patienten des Rebif- bzw. Betaferon-Kollektivs
1.1.3.2. Strukturvergleich der Rebif-Gruppe mit der Betaferon-Gruppe
1.2. Überprüfung auf Einflussfaktoren genereller und MS-spezifischer Art auf die Expression immunologischer Parameter
2. Prospektiver Bereich: Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS- Patienten
2.1. Natürlicher MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten
2.1.1. Aufteilung der untherapierten RR-MS Patienten in die Untergruppe A (Completers) und Untergruppe B (Wechsler)
2.1.2. Weitere Charakterisierung der Untergruppen A (Completers) und B (Wechsler)
2.2. MS-Verlauf bei ß-Interferon therapierten MS-Patienten
2.2.1. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [Rebif]; rIFN-ß1b [Betaferon])
2.2.2. Verlauf der immunologischen Parameter unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär chronisch-progredient [SP-MS])
2.2.3. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich des ersten und zweiten Behandlungsjahres
2.3. Vergleich der klinischen Krankheitsaktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe) in den untersuchten MS-Patientenkollektiven
2.4. Korrelationen der Expression immunologischer Parameter mit der klinischen Krankheits- aktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe)
2.5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse
2.5.1. Definition von Therapierespondern
2.5.2. Immunologische Profile nach Einteilung der MS-Patienten in Responder und Nonresponder
2.6. Expression immunologischer Parameter als prognostische Marker bei der MS
2.6.1. Prognostischer Marker bezüglich des klinischen Verlaufs im Zusammenhang mit dem Auftreten von Schüben
2.6.2. Prognostischer Marker bezüglich einer Therapieresponse

V. DISKUSSION
Teil A: Bewertung der quantitativen 2-step „Real-Time“ RT-PCR als Methode zur Untersuchung differentieller mRNA-Expression
1. RNA-Isolation und cDNA-Synthese
2. „Real-Time“ PCR
2.1. Allgemeine Optimierungen der PCR
2.2. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven
2.3. Reproduzierbarkeit beim Import von externen Standardkurven in verschiedene PCR-Läufe
2.4. Reproduzierbarkeit der „Real-Time“ PCR
2.5. Vergleich der PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmidstandards und Patienten-cDNA
2.6. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung der Zytokin mRNA-Expression
Teil B: Wissenschaftliche MS-Patientenstudie
1. Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
2. Bewertung der Ausgangssituation: Homogenitätsprüfungen zur Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline)
3. Prospektive Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS-Patienten
3.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im natürlichen MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten und bei deren Aufteilung in die Untergruppen der Completers und Wechsler
3.1.1. Unterschiede zwischen Completers und Wechslern
3.1.2. Zusammenhänge mit der klinischen Situation
3.2. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei ß-Interferon therapierten MS- Patienten
3.2.1. Situation bei RR-MS Patienten im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [RebifÒ]; rIFN-ß1b [BetaferonÒ]) unter Einbeziehung der Langzeitwirkungen von rIFN-ß1b über 24 Monate
3.2.2. Situation bei Betaferon-therapierten Patienten im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär-chronisch progredient [SP-MS])
3.3. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im Vergleich untherapierter und therapierter MS-Patienten
3.3.1. Potentielle allgemeine Erkrankungsmechanismen
3.3.2. Potentielle Wirkmechanismen einer MS-Therapie mit ß-Interferonen
4. Immunologische Parameter als Aktivitätsmarker der MS
4.1. Korrelationen der immunologischen Situation mit dem EDSS
4.2. Korrelationen der immunologischen Situation mit der Schubrate und dem Progressionsindex
5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse
5.1. Immunologische Profile im Vergleich der Responder und Nonresponder
6. Besonderheiten beim IL-4 Rezeptor (IL-4R) / löslichen IL-4R (sIL-4R)
6.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei MS-Patienten im Zusammenhang mit dem IL-4R / sIL-4R
6.2. sIL-4R als prognostischer Marker bei der MS
6.2.1. Prognose bezüglich des weiteren klinischen Verlaufs (Auftreten von Schüben)
6.2.2. Prognose bezüglich einer Therapieresponse
7. Kritische Betrachtungen der erhobenen Daten

VI. AUSBLICK

LITERATURVERZEICHNIS

ANHANG

ABKÜRZUNGEN

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

I. ZUSAMMENFASSUNG

Für das durchgeführte anwendungsbezogene „Screening“ (Immunmonitoring) wesentlicher, an der Pathogenese der Multiplen Sklerose beteiligter immunologischer Parameter (Zytokine, -rezeptoren, Adhäsionsmoleküle) wurde ein geeignetes System der quantitativen „real-time“ RT-PCR entwickelt und mit ELISA-Testsystemen kombiniert. Damit wurde die immunologische Situation im Vergleich verschiedener Patientenkollektive auf Gen- und Proteinebene unter Einfluss einer rekombinanten ß-Interferontherapie (rIFN-ß) mit den Zielen verfolgt, Wirkmechanismen der rIFN-ß aufzudecken und prognostische Marker bezüglich der Aktivität der Erkrankung und eines Therapieeffektes zu finden.

Die entwickelte RT-PCR Methodik ist gekennzeichnet durch eine hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit, zeichnet sich sowohl in der cDNA-Synthese als auch in der PCR-Amplifikation durch eine über weite Konzentrationsbereiche bestehende Linearität aus, und ist durch die Verwendung von importierten Standardkurven für die Quantifizierung von mRNA-Targets aus verschiedenen PCR-Läufen besonders für das „Screening“ eines Parameters in einer Vielzahl von Proben geeignet.

Der Vergleich der Expressionsprofile der immunologischen Parameter über den Zeitverlauf von 12/24 Monaten in allen MS-Patientenkollektiven zeigte im Hinblick auf potentielle Wirkmechanismen der rIFN-ß Therapie immunologisch betrachtet eine Zunahme von sICAM-1, sVCAM-1 und sTNF-R2, klinisch betrachtet eine ca. 30%ige Reduktion der Schubrate in den therapierten Kollektiven. Des weiteren wurden potentielle für die MS-Erkrankung typische immunologische Parameter-konstellationen in der Form einer Abnahme von IL-4, sIL-4R, IFN-ß und sTNF-R1 in allen Kollektiven unabhängig von der Therapie erkennbar. Bezüglich der Aktivität der Erkrankung ergaben sich für die RR-MS Patienten deutliche positive Korrelationen zwischen sICAM-1, sVCAM-1 sowie sTNF-R2 und dem Grad der Behinderung (EDSS) bei Untersuchungsbeginn, so dass diese als prognostische Marker des weiteren MS-Verlaufs herangezogen werden könnten. Des weiteren hat sich ein deutlicher Zusammenhang der Konzentration von sIL-4R, dessen Rolle in der MS hier zum ersten Mal überhaupt betrachtet wurde, mit dem Risiko eines Patienten einen Schub zu erleiden gefunden, womit sich, ebenfalls für den sIL-4R eine deutliche konzentrationsabhängige Reduktion der Responderwahrscheinlichkeit auf die rIFN-ß Therapie nachweisen ließ.

II. EINLEITUNG

Teil A: Multiple Sklerose als Erkrankung

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische entzündliche demyelinisierende (entmarkende) Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS: Gehirn und Rückenmark). Sie ist mit die häufigste Ursache neurologischer Behinderungen junger Erwachsener, denn sie bricht in den meisten Fällen zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr (Mitrovic et al., 1999; Offenhäusser et al., 1997) aus, wobei wiederum 50% dieser Patienten mit Symptomen noch vor dem 30. Lebensjahr konfrontiert werden. Weltweit sind ca. 1,2 Millionen Menschen von der MS betroffen. Die Gesamtzahl der Erkrankten in Deutschland wird auf ca. 80.000-120.000, die Inzidenzrate auf jährlich ca. 3000-5000 neuerkrankte MS-Patienten geschätzt (Bitsch, 2001). Aus bis heute unbekannten Gründen erkranken Frauen häufiger als Männer, wobei die Zahlen zwischen einem Verhältnis von 1,4:1 bis 3:1 (Mitrovic et al., 1999) schwanken. Beginnt die MS im Lebensabschnitt jenseits des 40. Lebensjahr, tritt sie bei Frauen und Männern gleich häufig auf, was die Vermutung nahe legt, dass hormonelle Einflüsse dafür verantwortlich sein könnten. Die Ursache der Erkrankung ist bis heute nicht gänzlich aufgeklärt. Es wird von einer Autoimmunerkrankung ausgegangen, bei deren Entwicklung aber auch erbliche Komponenten (Prädisposition) und Umweltfaktoren eine Rolle spielen (s. Ätiologische Faktoren für nähere Diskussion).

1. Autoimmunität: Reaktionen gegen körpereigene Antigene

Der menschliche Körper verfügt mit dem Immunsystem über Abwehrmechanismen, die ihn vor Krankheitserregern und Toxinen schützen (Janeway et al., 1997). Während die angeborene Immunität auf Abwehrzellen (Phagozyten) und humoralen Faktoren (z.B. Komplementsystem) beruht, die den Organismus in den ersten Tagen unspezifisch vor eingedrungenen Erregern schützt, funktioniert die sog. adaptive Immunität mittels spezifischer zellulärer und humoraler Abwehrmechanismen, die sich ständig dem Bedarf spezifischer Bedrohungen von außen anpassen. Die Basis der spezifischen Immunabwehr stellen zwei Hauptklassen von Lymphozyten dar:

die B-Lymphozyten, welche im Zentrum der humoralen Immunantwort stehen und für die Produktion von Antikörpern verantwortlich sind, und die T-Lymphozyten, die vor allem bei der zellvermittelten Immunantwort eine Rolle spielen. Viele unreife Lymphozyten reagieren auf körpereigene Produkte und stellen damit eine Gefahr für den Organismus dar. Während der Reifung der B-Lymphozyten im Knochenmark bzw. der T-Lymphozyten im Thymus werden autoreaktive Immunzellen gewöhnlich vernichtet (Apoptose) oder dauerhaft inaktiviert (Anergie), sodass gegenüber körpereigenem Gewebe eine natürliche Selbst-Toleranz entsteht. Obwohl diese Selbst-Toleranz die Regel ist, kommt es doch in einigen Fällen zu anhaltenden Immunantworten gegen körpereigenes Gewebe. Die daraus resultierenden Autoimmunerkrankungen sind also gewissermaßen „Irrtümer des Immunsystems“. Statt Bakterien oder Viren zu bekämpfen, richtet sich eine spezifische adaptive Immunreaktion gegen körpereigene Substanzen, sog. Autoantigene, was zu schweren Gewebeschädigungen führt. Autoimmunerkrankungen können prinzipiell jedes Organsystem treffen und sowohl von autoreaktiven T-Lymphozyten als auch von Autoantikörpern hervorgerufen werden. Beispiele für eine T-Zell vermittelte Autoimmunität sind neben der Multiplen Sklerose das „Guillain-Barré Syndrom“, welches man als Spiegelbild der MS bezeichnen könnte, da bei dieser Erkrankung das Myelin der Markscheiden um die peripheren Nerven vom Immunsystem attackiert wird. In beiden Fällen sind Strukturproteine des Myelins als potentielle Autoantigene identifiziert worden. Bei der „Insulin-abhängigen Diabetes mellitus“ werden die Insulin-produzierenden ß-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse selektiv durch autoreaktive T-Zellen zerstört. Die „Myasthenia Gravis“ ist ein Beispiel der durch Autoantikörper vermittelten Autoimmunität. Das Autoantigen ist hierbei der Acetylcholinrezeptor der postsynaptischen Muskelmembran. Die Bindung der Antikörper führt zu einer Verminderung der Anzahl funktionierender Rezeptoren, was zur Blockierung der Signalübertragung an der neuromuskulären Endplatte führt.

2. Morphologische Veränderungen und daraus resultierende Symptome

Die Pathologie der MS ist morphologisch gekennzeichnet durch das Auftreten von zahlreichen (multiplen) entzündlichen und öfters narbig abheilenden, verhärteten (sklerosierten) Herden. Diese Entzündungsherde, auch Läsionen oder Plaques genannt, treten in der weißen Substanz (Axone) von Gehirn und Rückenmark auf. Aus histologischer Sicht finden sich an diesen Stellen vorwiegend T-Lymphozyten und Makrophagen, in geringerem Ausmaß auch B-Lymphozyten. Schreitet die Erkrankung fort, kommt es zum Untergang der Myelin-produzierenden Oligodendrozyten und zur Proliferation von Astrozyten, was zur Ausbildung einer gliösen Narbe (Sklerose) führt. Die vielen klinischen Erscheinungsformen der MS beruhen auf einer Zerstörung der Myelinscheiden, aber auch auf einer irreversiblen Schädigung der Axone selbst, was zum Verlust von Nervengewebe führt. Dadurch kommt es zu einer Beeinträchtigung oder zu einer völligen Unterbindung der Erregungsleitung. Da die Entmarkungsherde in jedem Teil des ZNS auftreten können, können die Patienten eine Vielzahl von neurologischen Symptomen aufweisen. Häufig auftretende Symptome rühren von einem Befall des Sehnervs (Nervus opticus) sowie der motorischen und der sensorischen Nervenbahnen her. So gehören u.a. die Entzündung des Nervus opticus, die sog. Opticus-Neuritis sowie auch Lähmungen (Paresen) und Steifigkeit (Spastik) vor allem in den Beinen, aber auch sensorische Merkmale wie Missempfindungen (Parästhesien), ausgeprägt in Form von Kribbeln und Taubheitsgefühle zu den typischen Symptomen einer MS.

3. Wesentliche Klinische Verlaufsformen

Der natürliche klinische Krankheitsverlauf der MS (Abb. 1) bei jedem einzelnen Patienten ist äußerst heterogen und daher nur schwer vorhersagbar. Grundsätzlich unter-scheidet man einen schubförmigen Verlauf von der chronisch-progredienten Verschlechterung (Lublin et al., 1996). Bei der Mehrzahl der Patienten beginnt die MS zumindest anfänglich mit der schubförmig-remittierenden oder „relapsing remitting“ Verlaufsform (RR-MS). Sie ist die häufigste Form bei Personen unter 40 Jahren und macht ca. 80-90% aller Erkrankungsfälle aus. Sie zeichnet sich durch ein schubförmiges Auftreten von Symptomen mit einer anschließenden Phase der voll-ständigen oder teilweisen Remission (Rückbildung der Symptome) aus. Innerhalb von 10 Jahren nach der Diagnose einer RR-MS ändert sich bei ca. 50% der Patienten der Krankheitsverlauf (Dressel, 2000). Diese zweite Phase wird als sekundär chronisch-progrediente MS (SP-MS) bezeichnet. Dabei wird die Phase der Remission immer unvollständiger, was zu einer kontinuierlichen Zunahme der Behinderung führt, obwohl die Häufigkeit der Schübe deutlich abnimmt und schließlich gar keine schubförmigen Krankheitsphasen mehr abgrenzbar sind. Bei der primär chronisch-progredienten MS (PP-MS) lässt sich kein Schub abgrenzen, vielmehr tritt ein Symptom langsam auf und nimmt an Intensität zu. Im Verlauf kommen weitere Ausfälle hinzu, ohne dass zwischenzeitlich die Rückbildung von Symptomen eintritt. Diese Verlaufsform tritt bei ca. 10-20% der Patienten auf und betrifft in der Regel Patienten mit späterem Erkrankungsbeginn.

Abb. 1: MS-Verlaufsformen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Serono GmbH, 2002

4. Ätiologische Faktoren

Die genaue Ursache der MS ist trotz intensiver Forschung in den letzten Jahren nicht bekannt. Nach heutigem Wissenstand geht man davon aus, dass es sich um eine Autoimmunerkrankung handelt, die primär durch eine T-Lymphozyten Antwort gegen Myelinantigene hervorgerufen wird, bei der zusätzlich aber auch genetische und Umweltfaktoren eine Rolle spielen (Hohlfeld et al., 1995; Martin et al., 1992). Schlussendlich resultiert der Angriff in der Zerstörung der Myelinscheiden, die die Nervenfasern umgeben sowie in der Schädigung der Fasern selbst. Die Annahme eines autoimmunen Hintergrunds basiert zunächst auf dem histologischen Erscheinungsbild, bei dem es zum Eindringen ortsfremder Entzündungszellen (Infiltration), vorwiegend von Lymphozyten und Makrophagen in das ZNS kommt (Lassmann et al., 1994). Weitere Hinweise ergeben sich aus Parallelen zum Tiermodell, der sog. Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), die in verschiedenen Tierstämmen (z.B. Nager) durch Immunisierung mit Myelinantigenen oder durch Übertragung von Myelin-spezifischen T-Lymphozyten ausgelöst werden kann und in ihrem Verlauf der MS sehr ähnlich ist (Wekerle et al., 1994).

Epidemiologische Untersuchungen zeigen, dass genetische Faktoren dazu beitragen an MS zu erkranken. Dafür spricht eine 20-40fach höhere Wahrscheinlichkeit für das Auftreten der Erkrankung bei Familienangehörigen von MS-Patienten verglichen mit der Normalbevölkerung (Sadovnick et al., 1988) und eine bei 30% liegende Konkordanzrate (beide erkrankt) monozygoter Zwillinge, die damit 10fach höher ist als die dizygoter Zwillinge (Sadovnick et al., 1993; Ebers et al., 1995). Aufgrund des autoimmunen Charakters der MS wurden vor allem Gene untersucht, die die Immunantwort kontrollieren. So konnte eine Assoziation der MS mit Genen des sog. HLA („Human Leucocyte Antigen“) Komplexes dokumentiert werden. Bei MS-Patienten vieler Populationen (Ebers et al., 1995) findet sich ein bestimmtes HLA-Merkmal (DR2) 4fach häufiger als in der übrigen Bevölkerung (Oksenberg et al., 1993). Geographische Unterschiede des weltweiten Auftretens der MS deuten auf Umwelteinflüsse als weiteren Auslöser der Erkrankung hin (Abb. 2). Deutliche Unterschiede in der Häufigkeit der MS treten in Abhängigkeit vom geo-graphischen Breitengrad auf (Kurtzke, 1980). Die größten Häufigkeiten werden in beiden Hemisphären in den gemäßigten Klimazonen gefunden (Nordeuropa, Nordamerika sowie Australien und Neuseeland) mit einer abnehmenden Häufigkeit in Richtung des Äquators (Zentralafrika, Japan). Außerdem scheint das MS-Risiko bei Angehörigen der kaukasischen Population höher zu sein als bei solchen mit afrikanischer oder asiatischer Abstammung.

Zusammenfassend muss die MS daher als komplexe multifaktorielle Autoimmun-erkrankung angesehen werden, an deren Entstehung mit großer Wahrscheinlichkeit mehrere Gene und bislang unbekannte Umgebungsfaktoren beteiligt sind.

Abb. 2: Geographische Verteilung von MS

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Serono GmbH, 2002

5. Molekulare Pathogenese

Im Rahmen der MS-Pathogenese wird den T-Helferzellen (TH-Zellen, Subpopulation der T-Lymphozyten) mit ihren Untergruppen der sog. TH1- und TH2- Zellen die wichtigste entzündungsauslösende und -fördernde (TH1) bzw. entzündungs-hemmende (TH2) Rolle zugeschrieben. Aus Blut und Liquor MS-Erkrankter konnten Zellen isoliert werden, die eine Reihe von Myelin- (MBP, PLP, MOG, MAG) und Nicht-Myelinantigenen (aus Oligodendrozyten und Astrozyten) des ZNS erkennen (Hohlfeld et al., 1995; Martin et al., 1995; Steinman et al., 1995). Das Vorhandensein autoreaktiver Zellen führt jedoch nicht notwendigerweise zur MS. Lymphozyten, die gegen verschiedene Myelinbestandteile gerichtet sind, finden sich genauso im Blut von Gesunden (Martin et al., 1992; Wucherpfennig et al., 1994). Daraus lässt sich folgern, dass potentiell autoreaktive T- und B- Lymphozyten offensichtlich Bestandteile des normalen Immunsystems sind, die bei Gesunden normalerweise durch physiologische Kontrollmechanismen (Apoptose, Anergie) zur Aufrecht-erhaltung der Selbst-Toleranz in Schach gehalten werden, bei MS-Patienten aber offensichtlich versagen (Hartung, 1996). Die Pathogenese der MS stellt man sich vereinfacht so vor: die autoreaktiven TH -Zellen können mittels ihres T-Zell-Rezeptors Antigene aus dem ZNS erkennen. Sie dringen durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ins ZNS ein, vermehren sich dort (expandieren klonal) und starten dann eine Entzündungskaskade, die sich nach der Immunattacke teilweise selbst wieder limitiert (Obert, 2000). Eine schematische Zusammenstellung der wahrscheinlich für die Pathogenese der MS verantwortlichen Kaskade von Ereignissen zeigt Abb. 3.

- Initiale Aktivierung von T-Lymphozyten und Durchtritt durch die BHS

Abb. 3: MS-Pathogenese [modifiziert nach Rudick et al., 1997]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Solange die autoreaktiven TH -Zellen in einem „ruhenden“ Zustand im Blut der Patienten zirkulieren, verhindert die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ihr Eindringen ins ZNS. Weshalb es bei MS-Patienten bei Krankheitsbeginn zu einer Aktivierung dieser Zellen im peripheren Blut kommt, ist noch nicht hinreichend erklärt. Als Mechanismen für eine Triggerung werden u.a. bakterielle oder virale Superantigen und sog. Molekulares Mimikry diskutiert. Beim letzteren handelt es sich um eine Art Täuschungsmanöver, mit dem die Erreger versuchen sich unerkannt freien Eintritt zu verschaffen. Im Laufe der Evolution haben sie Abschnitte eigener Proteinmoleküle immer stärker Strukturen des Wirts angepasst. So enthalten einige Viren (z.B. Masern, Adenoviren) Aminosäure-sequenzen, die in Teilstücken mit solchen z.B. des MBP übereinstimmen (Wucher-pfennig et al., 1995) und somit zu einer fehlgeleiteten Immunreaktion gegen Autoantigene führen können. Damit TH -Zellen mit ihren T-Zell-Rezeptoren ihr spezifisches Antigen überhaupt erkennen können, muss es ihnen in prozessierter Form von Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) im Zusammenhang mit MHC-Klasse II Molekülen (beim Menschen HLA genannt) dargeboten werden. Zu einer vollständigen Aktivierung kommt es aber erst durch die Präsenz ko-stimulatorischer Moleküle, die auf dem T-Lymphozyten (z.B. CD 28) und der APZ (z.B. B-7) exprimiert sein müssen. Derart gegen verschiedene neuronale Antigene aktivierte T-Zellen können die intakte BHS passieren (Wekerle et al., 1986). Die Einwanderung der aktivierten TH -Zellen aus dem Blut ins Gehirn und Rückenmark erfordert eine sequentiell erfolgende, komplexe Interaktion sog. Adhäsionsmoleküle (z.B. ICAM-1 mit LFA-1, VCAM-1 mit VLA-4), die auf den autoreaktiven T-Lymphozyten und den Endothelzellen der BHS unter Einfluss von Zytokinen exprimiert werden. Durch die Bindung der Adhäsionsmoleküle können die T-Zellen an das Enthodel anheften und mittels proteolytischer Enzyme (Matrixmetalloproteinasen) schließlich die BHS penetrieren (Leppert et al., 1995). Ein Teil dieser Adhäsionsmoleküle wird nach der Aktivierung von der Oberfläche der Zellen abgelöst und in die Umgebung abgegeben. Sie sind dann als lösliche Moleküle im Blut mittels ELISA, wie in dieser Arbeit bei sICAM-1 und sVCAM-1 durchgeführt, nachweisbar.

- Lokale T-Zell-Reaktivierung und Th1-Zytokin-vermittelte Entzündung

Eingedrungene autoreaktive TH -Zellen müssen im ZNS reaktiviert werden, um eine lokale Entzündungsreaktion in Gang zu setzen (Hart et al., 1995). Auch hier bedarf es einer Interaktion mit einer APZ, in der Regel einer Mikrogliazelle. Durch den Kontakt mit den spezifischen Antigenen können die TH -Zellen proliferieren und durch die Freisetzung spezifischer Zytokine eine Kaskade entzündlicher Reaktionen in Gang setzen (Olsson, 1995). Die TH1- und TH2- Zellen sind dabei durch unterschiedliche Zytokinmuster charakterisiert. Die TH1-Zellen synthetisieren die sog. pro-inflammatorischen Zytokine wie IFN-g, TNFa und TNFß und spielen damit die entscheidene Rolle bei der Initiation der Entzündungsreaktionen. Unter anderem kommt es unter Einfluss der Zytokine zum einen zu einer Schädigung der BHS, wodurch es zu einer gesteigerten Infiltration weiterer Entzündungszellen (B-Lymphozyten, Makrophagen) ins ZNS kommt und zum anderen zu einer Aktivierung von Makrophagen und Migrogliazellen, wobei eine Erhöhung der Expression von MHC-Klasse II Molekülen (vermehrte Präsentation von Autoantigen) und eine verstärkte phagozytäre Aktivität (direkter Abbau des Myelins) und Freisetzung weiterer entzündungsfördernder Mediatoren (Sauerstoff- und Stickstoffradikale) induziert wird (Hartung et al., 1992). Als Vertreter der TH1-Zytokine werden in dieser Arbeit die Expressionen von IFN-g und TNF-ß untersucht.

- B-Lymphozyten und die Rolle von Autoantikörpern

Die TH2-Zellen sezernieren auf der einen Seite Zytokine wie IL-4, IL-5 und IL-6, die wichtige Differenzierungs- und Proliferationssignale für die eingewanderten B-Lymphozyten darstellen und sie zur Produktion potentieller Myelin-spezifischer Autoantikörper anregen können. Autoantikörper können über verschiedenste Mechanismen zur Zerstörung des Myelins beitragen (Aktivierung von Makrophagen und Mikroglia, Erleichterung der Phagozytose durch Opsonisierung der Myelinoberfläche, Aktivierung des Komplementsystems mit Ausbildung von Membranangriff-Komplexen).

- Beendigung der Entzündungsreaktion

Auf der anderen Seite synthetisieren die TH2-Zellen sog. anti-inflammatorisch wirkende Zytokine wie IL-4, IL-10 und TGFß und wirken damit der TH1-induzierten entzündlichen Reaktion entgegen. Das am Beginn der Entzündungsreaktion vorliegende Ungleichgewicht zwischen der TH1- und TH2- vermittelten Immunantwort wird durch eine vermehrte Synthese der entzündungshemmenden TH2 Zytokine ausgeglichen (Link et al., 1994; Söderström et al., 1995). Die eingewanderten autoreaktiven T-Lymphozyten werden vermutlich durch Apoptose beseitigt (Schmied et al., 1993.)

6. Therapie mit rekombinantem Beta-Interferon (rIFN-ß)

Der Versuch, rIFN-ß zur Behandlung der MS einzusetzen, geht zurück auf das Jahr 1978 (Obert, 2000). Damals galt die MS als primär durch eine Virusinfektion hervor-gerufene Krankheit, worauf die Annahme beruhte, IFN-ß als potente antivirale Substanz könne das pathogene Geschehen regulieren. Tatsächlich berichtete eine erste klinische Studie (damals noch mit natürlichem IFN-ß) mit MS-Patienten von einem signifikanten Rückgang der Schubrate (Jacobs et al., 1981). Heute sind mit dem rIFN-ß1a sowie dem rIFN-ß1b zwei verschiedene Arten rekombinanter ß-Interferon Präparate auf dem Markt erhältlich. In diese Arbeit wurden MS-Patienten eingeschlossen, die mit RebifÒ (rIFN-ß1a, Serono GmbH, Unterschleißheim) bzw. BetaferonÒ (rIFN-ß1b, Schering Deutschland GmbH, Berlin) therapiert wurden. Das RebifÒ entspricht in der Aminosäuresequenz dem natürlichen humanen IFN-ß. Es wird gentechnisch in Säugetierzellen, sog. CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) produziert (Piani et al., 2001). Dagegen wird das BetaferonÒ aus Bakterienzellen (Escherichia coli) gewonnen (Derynck et al., 1980) und ist deshalb in seinem Bau mit dem natürlichen IFN-ß nicht identisch (nachträgliche Veränderung der Aminosäuresequenz aufgrund unterschiedlicher Faltung; keine Glykosylierung vorhanden). Dass die rekombinanten ß-Interferon Präparate einen positiven Effekt auf den Verlauf der MS sowohl bezüglich der Reduktion der Schubanzahl als auch der Verminderung der Progredienz ausüben, konnte in mehreren Studien gezeigt werden (IFNB Multiple Sclerosis Study Group 1993, 1995; Paty et al., 1993; Jacobs et al., 1996; PRISMS Study Group, 1998). Die Mechanismen, wie und warum rIFN-ß diese Wirkungen vermittelt, sind bis heute jedoch noch weitgehend ungeklärt.

6.1. Wirkhypothese des rIFN-ß

Alle Interferone vermitteln ihre biologischen Effekte indirekt zunächst durch Bindung an spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen, gefolgt durch die Weitergabe des Signals mittels Transduktionskaskaden bis in den Zellkern, was in der Expression spezifischer IFN- induzierbarer Gene resultiert (Rubinstein et al., 1986; Pfeffer et al., 1997). Die antiviralen Wirkungen des rIFN-ß können aufgrund der Kenntnis, dass virale Infektionen MS-Schübe auslösen können (Sibley et al., 1985) zu einer Verbesserung beitragen, jedoch werden die komplexen, auf den pleiotropen Eigenschaften des Zytokins beruhenden, immunmodulatorischen Effekte des rIFN-ß als wichtiger erachtet. Einen positiven Effekt auf die MS-Pathogenese üben unter anderem die zu beobachtenden antagonistischen Wirkungen zwischen IFN-ß und IFN-g aus, die aufgrund gemeinsam genutzter Bereiche der intrazellulären Signalkaskaden hervorgerufen werden (Ransohoff, 1998). Als pro-inflammatorisches Zytokin spielt IFN-g, neben TNF, eine entscheidene Rolle bei der Initiierung der entzündlichen Reaktionen. rIFN-ß inhibiert die Freisetzung von IFN-g und somit auch die vorwiegend durch IFN-g induzierte Expression von MHC-Klasse II Molekülen auf Makrophagen und Astrozyten, die für die Antigenpräsentation und damit für die Reaktivierung der autoreaktiven TH -Zellen im ZNS entscheidend sind (Ling et al., 1985; Noronha et al., 1993). Gleichzeitig wird damit auch die durch IFN-g hervorgerufene Aktivierung von Makrophagen inhibiert, wodurch die phagozytotische Aktivität und die Freisetzung weiterer Entzündungsmediatoren reduziert werden. Weiterhin wird durch die verminderte Freisetzung von IFN-g auch eine Inhibition der Expression von Adhäsionsmolekülen sowohl auf den Entzündungszellen als auch auf den Zellen der BHS herbeigeführt. Mehr noch bewirkt die Behandlung mit rIFN-ß einen Anstieg der löslichen Formen von sICAM-1 und sVCAM-1, die wiederum in kompetitiver Art mit den zellgebundenen Formen interferieren können. Alles in allem verhindern diese Effekte das Eindringen autoreaktiver TH -Zellen durch die BHS ins ZNS. Neben IFN-g wird auch die Freisetzung weiterer pro-inflammatorischer Zytokine wie z.B. TNF-a, was die Apoptose bei Oligodendrozyten bewirkt, inhibiert (Pober et al., 1986). Gleichzeitig wird die Synthese anti-inflammatorisch wirkender Zytokine wie IL-4 und IL-10 verstärkt, so dass es unter Einwirkung von rIFN-ß zu einer Wiederherstellung des TH1/TH2 Gleichgewichtes kommt (Yasuda et al., 1999; McRae et al., 1997; Rudick et al., 1996). Die meisten der heute bekannten Daten stammen allerdings aus in vitro Experimenten und können die komplexe Situation des interaktiven Zytokin-Netzwerks in vivo daher nur begrenzt wiedergeben. Zusammenfassend lässt sich jedoch erkennen, dass die immunmodulatorischen Effekte des rIFN-ß bei der MS zu einer Verminderung der autoaggressiven Reaktionen beitragen, auch wenn damit dem Patienten keine Aussicht auf Heilung geboten werden kann.

7. Heterogenität

Aufgrund der intensiven Forschung in den letzten Jahren zeigt sich immer mehr, dass die MS wohl nicht als eine homogene Krankheitsentität betrachtet werden kann. Vielmehr muss sie vermutlich als Sammelbegriff für eine heterogene Familie entzündlich-demyelinisierender ZNS-Erkrankungen herangezogen werden (Berger, 2001), wobei sich die Heterogenität klinisch betrachtet zunächst in variablen Formen des natürlichen Verlaufs der Erkrankung (klinische Verlaufsformen s.o.) und vor allem in einem unterschiedlichen, nicht prognostizierbarem Ansprechen auf therapeutische Maßnahmen äußert. Obwohl neben den drei wesentlichen natürlichen Verlaufsformen der MS (RR-MS, SP-MS, PP-MS) heute weitere Formen des primär-chronisch progredienten Verlaufs (RP-MS, TP-MS, PR-MS) unterschieden werden (Gayou et al., 1997; Kremenchutzky et al., 1999) sowie weitere Krankheitsbilder wie das der akuten MS vom Typ Marburg und andere seltene Formen (z.B. Devic-Syndrom) das klinische Spektrum der MS erweitern (Poser et al., 1992), spiegelt beides wohl doch nicht die ganze Heterogenität der MS wider. Verschiedene Studien lassen darüber hinaus auch auf eine mögliche pathologische Heterogenität zwischen verschiedenen Patienten schließen (Lucchinetti et al., 1996; 2000). So konnten vier verschiedene Muster der Gewebezerstörung in aktiven MS-Läsionen gezeigt werden, die nahe legen, dass sowohl das Ziel des autoimmunen Angriffs, Myelin oder Oligodendrozyten, als auch die Mechanismen der Zerstörung möglicherweise verschiedene Subgruppen von MS-Patienten und verschiedene Stadien der Krankheitsentwicklung wiedergeben könnten. Obwohl die verschiedenen Muster der Demyelinisierung und Entzündung nicht mit den klinischen Verläufen einer schub-förmigen oder progredienten MS korreliert werden können, tragen sie doch zum Verständnis der immunologischen und neurodegenerativen Mechanismen bei der Läsionsentstehung bei (Gold et al., 2002). Auch bei der vermuteten genetischen Heterogenität der MS konnte bislang eine reproduzierbare Assoziationen nur mit dem HLA-DR2 Allel innerhalb des MHC-Komplexes, aber noch keine eindeutige Korrelation zwischen Genotyp und klinischem Verlauf gefunden werden. Obwohl also ein gewisser Einfluss der MHC-Haplotypen auf die Entwicklung einer MS besteht, wurde einerseits gezeigt, dass auch gesunde Individuen diese genetischen Merkmale tragen und anderseits wurden weitere Genorte als assoziativ mit der MS identifiziert, was bedeuten könnte, dass eine Kombination einer heterogenen Gruppe von Genen das Risiko eines Menschen diktiert an MS zu erkranken, aber auch möglicherweise die individuelle Immunpathogenese bzw. die Entwicklung eines pathologischen oder klinischen Subtyps von MS bestimmen könnte (Berger, 2001). Aufgrund der also in verschiedenen Bereichen sich andeutenden Heterogenität der MS wird es aus medizinischer Sicht als wichtig erachtet, in Zukunft eine differenziertere Subtypisierung der MS-Patienten nach u.a. genetischen, klinischen und neuropathologischen Parametern vorzunehmen, um Patienten für eine individuelle Therapie zu selektionieren und damit den Erfolg bisheriger Therapieansätze zu verbessern.

8. Prognostische Surrogat-Marker

Verlässliche Prognosen über den spontanen Langzeitverlauf der MS lassen sich erst nach mehrjähriger (bis zu 10 Jahren) klinischer Beobachtung der Patienten stellen (Weinshenker, 1995). Es besteht somit für den individuellen Patienten lange Zeit Unsicherheit über seinen weiteren Krankheitsverlauf und somit auch über seine gesamte Lebenssituation. Wie man aus Studien zum natürlichen Verlauf, die zwischen 1960 und 1980 durchgeführt wurden, weiß, gehören zu den, aus rein klinischer Sicht betrachteten wichtigsten günstigen prognostischen Faktoren u.a. weibliches Geschlecht, ein früher initial schubförmiger Beginn mit einer geringen Anzahl und einer vollständigen Remission von Schüben sowie eine mono-symptomatische Ausprägung der neurologischen Defizite. Es muss dabei aber bedacht werden, dass diese Faktoren mehr auf Gruppen von Patienten als auf die individuelle Situation eines Einzelnen anwendbar sind. Da nur ca. 1/10 der pathologischen Krankheitsaktivität klinisch z.B. in Form von Schüben sichtbar wird (Bitsch, 2001), stellt die Klinik nur die „Spitze des Eisberges“ dar. Die Erkrankung beginnt vermutlich schon Jahre vor der klinischen Erstmanifestation, was zeigt, dass klinische Merkmale alleine nicht sensitiv genug sind den weiteren Verlauf individuell vorherzusagen. Des weiteren hat sich in den letzten Jahren seit Einführung der rekombinanten ß-Interferone als eine Behandlungsform der MS gezeigt, dass nicht alle Patienten gleichermaßen auf die Therapie ansprechen. Eine große Anzahl von Patienten profitiert nicht von den immunmodulatorischen Effekten des rIFN-ß („Non-responder“), wohingegen bei den „Respondern“ die Krankheitsprogression verlang-samt, aber nicht völlig zum Stillstand gebracht werden kann. Darüber hinaus wurden trotz der Behandlung bei einigen Patienten Verschlimmerungen der Schübe beobachtet. Bislang wurden zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Therapie mit rIFN-ß zum einen die klinischen Parameter des natürlichen Krankheitsverlaufs wie die Schubrate und die Progression der Behinderung, bewertet nach der EDSS („expanded disability status scale“; Kurtzke, 1983) sowie zum anderen serielle Magnetresonanz-tomographische (MRT) Untersuchungen herangezogen. Um daraus verlässliche Aussagen ableiten zu können, bedarf es jedoch langer Beobachtungszeiten, trotz deren es bislang aber noch nicht gelungen ist klinische Kriterien abzuleiten, die eine Voraussage im Hinblick auf ein Nichtansprechen oder eine Verschlimmerung bei einzelnen zu behandelnden Patienten ermöglichen würden. Daher wurde in den letzten Jahren verstärkt auch nach biologischen / immunologischen Krankheitsmarkern gesucht, die als Surrogat-Marker nicht nur zu einer Beschreibung der klinischen Krankheitsaktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt des MS-Verlaufes, sondern auch für eine sensitivere und schneller verfügbare individuelle Prognose bezüglich der Krankheitsprogression und der Aussicht auf Ansprechen einer Therapie herangezogen werden könnten. Mit Blick auf die autoimmune Pathogenese der MS scheint es sinnvoll nach Surrogat-Markern im Umfeld der immunologischen Parameter (Zytokine, Adhäsionsmoleküle) zu suchen.

Teil B: Labor-Methoden für das Screening immunologischer Surrogat-Marker

Aufgrund der Annahme, dass der Beginn des für die MS verantwortlichen Auto-immunprozesses im peripheren Blut erfolgt, ist es sinnvoll auch im Blut die Konzentration von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen zu bestimmen. Die biologische Aktivität der Zytokine ist aber auch abhängig von dem Vorhandensein der entsprechenden Zytokin-Rezeptoren. Manche dieser Rezeptoren wie auch die Adhäsionsmoleküle werden von der Oberfläche der Zellen nach einer Aktivierung abgelöst und in die Zirkulation freigesetzt. Als lösliche Formen können sie wie die Zytokine mittels ELISA-Messungen quantifiziert werden. Eine andere Möglichkeit zur Quantifizierung der immunologischen Parameter besteht in der Bestimmung der spezifischen mRNA Levels in den peripheren Blutleukozyten mittels der quantitativen „real-time“ RT-PCR.

1. Die Polymerase-Ketten-Reaktion

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) wurde Anfang der 80er Jahre von Kary Mullis (Saiki et al.,1985; Mullis et al.,1986; Mullis et al.,1987) entwickelt. Die PCR hat die gesamte molekularbiologische Forschung revolutioniert und ist heutzutage zu einer Standardmethode geworden, die in einem großen Bereich von Forschungsprojekten angewendet wird sowie zur Verbesserung der routinemäßigen Diagnostik von Pathogenen und Krankheiten von medizinischer und veterinärmedizinischer Wichtigkeit beigetragen hat. Die Anwendungsmöglichkeiten reichen vom rein qualitativen Nachweis bakterieller- oder viraler Infektionen in der Virologie und Mikrobiologie bis zur quantitativen Genexpressionsanalyse (RT-PCR), von der Erstellung des „genetischen Fingerabdrucks“ für die Überführung von Tätern in der Kriminalistik (T-RFLP) und forensischen Medizin bis hin zur Entschlüsselung des humanen Erbgutes im Humangenomprojekt. Darüber hinaus hat die PCR aber auch für eher spektakuläre Bereiche Anwendung gefunden. So wurde sie in der molekularen Archäologie u.a. für den Nachweis von DNA in 4000 Jahre alten ägyptischen Mumien herangezogen (Pääbo, 1985) sowie für die Aufklärung historischer Rätsel wie im Falle von Kasper Hauser (Weichhold et al., 1998) eingesetzt.

2. „Real-Time” und „On-Line“ PCR

Das Fluoreszenz-basierte Verfahren der sog. kinetischen „real-time“ und „on-line“ PCR ist die heute modernste Methode der Detektion von Nukleinsäuren. Hierbei handelt es sich um die Möglichkeit, die gerade amplifizierten PCR Produkte in jedem Zyklus des PCR-Prozesses in „Echtzeit“, d.h. noch während des Ablaufs im Thermozykler, zu detektieren. Das erste „real-time“ System wurde von Higuchi et al. (1992, 1993) entwickelt. Durch die Verwendung von Ethidiumbromid (EtBr) als Interkalator und eines modifizierten Thermozyklers konnte, nach Bestrahlung der Proben mit UV-Licht, die resultierende Fluoreszenz mittels einer CCD- bzw. Videokamera detektiert werden. Dadurch war es möglich in jedem Zyklus die Akkumulation der Produkte durch die Zunahme der Fluoreszenz, resultierend aus dem Interkalieren von EtBr in die dsDNA und der damit verbundenen Verstärkung seiner Fluoreszenzintensität, zu messen. Wurden anschließend die gemessenen Fluoreszenzsignale gegen die Zyklenanzahl aufgetragen, konnte ein Abbild des gesamten Reaktionsverlaufes einer PCR dargestellt werden.

Mit den heutigen kommerziellen Systemen ist es möglich geworden den Reaktionsverlauf während der einzelnen Zyklen des PCR-Prozesses, durch die Kopplung an einen PC, auf einem Monitor „on-line“ zu verfolgen. Ein großer Vorteil kann daraus abgeleitet werden. Endlich ist die PCR aus dem Blackbox-Dasein ins Licht des Betrachters getreten. Man sieht nicht nur das Endergebnis einer PCR, sondern auch was sich zuvor abgespielt hat, womit auch die Möglichkeit verbunden ist, die Qualität der Reaktion sofort beurteilen zu können.

3. Prinzip der „Real-Time“ PCR zur Bestimmung einer Startkopienzahl

3.1. Unterschied zur konventionellen PCR

Die Gelegenheit, den PCR-Prozess direkt verfolgen zu können, hat einen neuartigen Ansatz zur Bestimmung einer anfänglich vorhandenen Kopienzahl von Nukleinsäuren möglich gemacht. Im Unterschied zur konventionellen PCR bei der eine „Endpunkt-Analyse“ vorgenommen wird nachdem die Reaktion bereits beendet ist, erfolgt bei der „real-time“ PCR die Detektion der amplifizierten Produkte direkt anhand der Kinetik, also des Reaktionsverlaufes jeder PCR an sich. Man spricht von einer „kinetischen Analyse“. Unterschiedliche Reaktionen werden durch den Zeitpunkt charakterisiert, zu dem die Amplifikation erstmalig detektiert wird und nicht mehr durch die Menge des akkumulierten Endproduktes.

Abb. 4: Theoretische Aspekte der PCR Amplifikation

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Roche Applied Science, 2001 [modifiziert]

Bei der PCR handelt es sich um einen exponentiellen Prozess, bei dem eine vorhandene DNA-Sequenz identisch repliziert wird. In der Theorie (Abb. 4) wird die Zahl der Kopien pro Zyklus verdoppelt [N=N0 x 2n]. So entspricht die maximal in der PCR mögliche Effizienz dem Wert 2. In der Realität wird die Effizienz von ver-schiedenen PCR-Para-metern beeinflusst, so dass die Effizienz zwar konstant bleibt, aber ungleich 2 ist [N=N0 x (Econst)n]. Diese mathematische Beschreibung gilt jedoch nur für ca. 2-5 Zyklen der gesamten PCR, in denen tatsächlich eine exponentielle Vermehrung stattfindet. In dieser „log-linearen Phase“ kann ein Anstieg des Signals direkt mit dem Anstieg der DNA Menge korreliert werden. Nur dieser Bereich wird bei einer „kinetischen Analyse“ zur Bestimmung der Kopienzahlen herangezogen.

Abb. 5: Typische PCR-Verläufe

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Roche Applied Science, 2001

Im Gegensatz dazu basiert eine „Endpunkt-Analyse“ bei der konventionellen PCR auf der Auswertung von Reaktionen, die sich in der „Plateau-Phase“ (Wittwer, 2001) befinden. Sie ist gekennzeichnet durch eine variable Amplifikationseffizienz [N=N0 x (Evar)n] und wird u.a. durch Produktinhibition (Pyrophosphat), eine verminderte Aktivität der Taq-Polymerase und der Abnahme der Reagenzien-konzentrationen hervorgerufen (Freeman et al., 1999). Die PCR- Amplifikation ist abhängig von der Template-Konzentration (Abb. 5). Jedoch können Reaktionen mit einer niedrigen Anfangskopienzahl das gleiche „Plateau“ erreichen wie Reaktionen, die mit einer höheren Kopienzahl gestartet, aber mit verschiedenen Amplifikationseffizienzen abgelaufen sind. Ein weiterer wichtiger Vorteil der „real-time“ PCR liegt also in der Möglichkeit sehr viel präzisere Quantifizierungen vornehmen zu können.

3.2. Der Cp-Wert

Abb. 6: Crossing Point (CP)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Bio-Rad Laboratories GmbH, 2000

Abb. 7: Standardkurve

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Roche Applied Science, 2001

Als Parameter für die Bestimmung der Startkopienzahl wird der sog. „Crossing Point” (CP) auch bezeichnet als „Threshold-Cycle“ (CT) herangezogen (Abb. 6). Er repräsentiert in Bruchteilen die Zyklenzahl, in der die Fluoreszenz zum ersten Mal über einen Schwellenwert hinweg ansteigt. Je mehr Startkopien in die PCR eingebracht wurden, desto früher wird ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz gemessen. Der Schwellenwert wird von der Software aus der Schwankungsbreite der Basisfluoreszenz der PCR-Reaktionen der ersten Zyklen berechnet, zu einem Zeitpunkt also, zu dem noch keine PCR-Produktbildung messbar ist.

Wie Higuchi et al. (1993) gezeigt haben, kann durch die Auftragung der CP-Werte gegen den Logarithmus der Start-kopienzahl einer Verdünnungsreihe von Proben bekannter Konzentration eine Standardkurve (Abb. 7) generiert werden, da die CP-Werte eine direkte Proportionalität zur Menge des anfänglich eingesetzten Templates aufweisen (Gibson et al., 1996; Heid et al., 1996). Die Quantifizierung der Targetmenge einer unbekannten Probe erfolgt schlicht im Bezug auf eine solche Standardkurve über die gemessenen CP-Werte.

4. Das LightCycler®-System

Der LightCycler® (Wittwer et al., 1997; Wittwer et al., 1997) ist eines der heute kommerziell verfügbaren Systeme für die „real-time“ PCR. Er besteht aus einer Zykler-Komponente und einem Fluorimeter. Als Temperatur-Transfermedium wird Luft benutzt. Durch die geringe Masse der Luft können sehr schnelle Temperaturwechsel erzielt werden (Wittwer et al., 1990).

Abb. 8: Glaskapillaren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Roche Applied Science, 2001

Um für einen schnellen Temperaturtransfer auch in den Ansätzen zu sorgen, werden Glaskapillaren (Wittwer et al., 1989) (Abb. 8) eingesetzt. Durch das günstige Verhältnis von Oberfläche zu Volumen wird ein besonders effizienter Hitzetransfer ermöglicht. Die Kapillaren dienen zum einen als Reaktionsgefäße, zum anderen können sie gleichzeitig als Meßküvetten für die Fluoreszenzmessungen verwendet werden. Das Fluorimeter beherbergt eine Licht-emittierende Diode (LED) als Lichtquelle. Das emittierte Licht wird gefiltert und über eine Linse auf die Spitze der Kapillare fokussiert. Die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz wird von derselben Linse wieder gesammelt und über spezielle Filter an Photohybrid-Detektoren weitergegeben. Diese optische Einheit enthält Filtersysteme für 530nm (SYBR- Green I), 640nm (LC-Red 640) und 710nm (LC-Red 710), so dass eine Detektion von drei Farben möglich ist.

5. Fluoreszenz-basierte Detektionsformate

Allgemein lassen sich nicht-spezifische von spezifischen Detektionsverfahren unterscheiden.

5.1. Unspezifische Detektion mittels SYBRÒ- Green I

Das einfachste Prinzip basiert auf der Interkalation von Fluoreszenz-Farbstoffen in Doppelstrang-DNA wie z.B. bei EtBr (Higuchi et al., 1992). Heute findet für die „real-time“ PCR vor allem SYBR- Green I aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund Verhältnisses Verwendung. Es wird angenommen, dass es an die kleine Rinne der DNA bindet. Die Vorteile liegen in der universellen Verwendbarkeit und in der hohen Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Bei der Verwendung von SYBR- Green I fehlt jedoch jede Spezifität hinsichtlich des zu untersuchenden Templates, denn auch Primer-Dimere oder unspezifische Nebenprodukte, die sich während der Reaktion bilden, verursachen einen Fluoreszenzanstieg. Dieser ist zunächst nicht von dem des spezifischen Produktes zu unterscheiden (s. Schmelzkurvenanalyse).

5.2. Hybridisierungssonden für eine Sequenz-spezifische Detektion

Das Problem der mangelnden Spezifität wurde bereits zuvor von Holland et al. (1991) und Lee et al. (1993) gelöst. Die heutige gängige Methode basiert auf der Ausnutzung des sog. „Fluoreszenz [oder Förster (1946, 1948)] -Resonanz - Energie - Transfer“ (FRET) (Clegg, 1995), wie sie von Cardullo et al. (1988) eingeführt wurde.

Abb. 9: Das Prinzip des Fluoreszenz Reso-nanz Energie Transfers (FRET) [Mülhardt, 2000]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Als FRET (Abb. 9) bezeichnet man einen physikalischen Prozess, bei dem ein Fluorochrom F1 (der Donor) nach Anregung durch kurzwelliges Licht seine Emissionsenergie auf ein zweites Fluorochrom F2 (den Akzeptor) überträgt, das darauf mit der Emission längerwelligen Lichtes reagiert. Der Energietransfer von einem auf das andere Molekül erfolgt über Dipol-Dipol Wechselwirkungen. Basierend auf diesem Prinzip wurden verschiedenen Sondentypen entwickelt. Zu denen am häufigsten verwendeten zählen die „TaqManÒ-Sonden“ (Lee et al., 1993; Livak et al., 1995), die „Molecular Beacons“ (Tyagi et al., 1996) und die „Hybridization Probes“ (Wittwer et al., 1997). Bei Messungen nach TaqMan- und Molecular Beacons- Prinzip wird zusätzlich zu den Primern ein Oligonukleotid der Reaktion zugefügt, das beide Fluorophore (hier „Reporter“ und „Quencher“ genannt), vorzugsweise am 5´- und 3´- Ende trägt. FRET wird hierbei dazu benutzt die Fluoreszenz des Reporters solange zu unterdrücken, bis die Sonde an das spezifische Fragment hybridisiert. Zur Unterbrechung des Energietransfers kommt es nach der Hybridisierung durch Zerschneiden der TaqMan-Sonde über die 5´- 3´ Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase bzw. durch Auflösen einer Haarnadelstruktur beim Molecular Beacon. In beiden Fällen kann der Quentscher die Fluoreszenz des Reporters durch genügend großen Abstand dann nicht mehr auslöschen.

Abb. 10: „Hybridization Probes“ Format

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Quelle: Roche Applied Science, 2001

Im Gegensatz dazu bestehen die „Hybridization Probes“ (Abb. 10) aus zwei Oligonukleotiden, wobei das eine am 3´-Ende mit dem Donormolekül (Fluorescein), das andere am 5´-Ende mit dem Akzeptormolekül (LC-Red 640 bzw. 705) markiert ist. Zum Energietransfer kommt es erst dann, wenn beide „Hybridization Probes“ in „head-to-tail“ Anordnung an einen internen Bereich des gleichen DNA-Stranges in unmittelbarer Nähe zueinander hybridisieren. Für einen effizienten FRET darf der Abstand beider „Hybridization Probes“ nicht größer als 1-5 Nukleotide betragen.

6. Schmelzkurvenanalyse

Die Schmelzkurvenanalyse basiert darauf, dass jede DNA bei einer für sie charakteristischen Temperatur, dem Schmelzpunkt (Tm), denaturiert. Der Tm eines DNA-Fragmentes ist u.a. abhängig von seiner Länge, der Sequenz, dem GC-Gehalt und dem Salzgehalt der Pufferlösung und bezeichnet die Temperatur, bei der die Hälfte der untersuchten DNA einzelsträngig vorliegt. Basierend auf diesem Prinzip kann im LightCycler® eine Schmelzkurvenanalyse sowohl unter Verwendung von SYBR-Green als auch mit „Hybridization Probes“ durchgeführt werden. Je nach Detektionsformat können unterschiedliche Analysen vorgenommen werden. So kann bei Messungen mit SYBR-Green, wie die Analyse auch in dieser Arbeit angewendet wurde, eine Verifizierung zwischen spezifischem Produkt und Primer-Dimeren im Reaktionsgefäß nach der PCR erfolgen (Ririe et al., 1997). Hierbei werden die PCR-Produkte kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich aufgeheizt und die damit verbundene Fluoreszenzabnahme aufgezeichnet. Beim Tm eines Produktes kommt es zur sprunghaften Reduktion der Fluoreszenz, was eine eindeutige Identifizierung erlaubt. Primer-Dimere schmelzen schon bei wesentlich geringeren Temperaturen als die längeren spezifischen Produkte.

7. Reverse Transkription - Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)

Durch die Kombination von „Reverser Transkription“ und einer nachfolgenden PCR wurde die Amplifikation individueller definierter RNA-Sequenzen ermöglicht (Rappolee et al., 1988; Rappolee et al., 1989). Auf diese Weise lassen sich u.a. Variationen in der mRNA-Expression spezifischer Moleküle (z.B. Zytokine) bezüglich der Menge oder des Musters analysieren, die zu vielen immunologisch-vermittelten Erkrankungen beitragen können. Die RT-PCR ist wesentlich sensitiver und präziser als die auf Hybridisierung basierenden traditionellen RNA-Techniken (Northern-Blot, RNase protection assay) (Wang et al., 1999), wodurch sie ein hervorragendes Werkzeug darstellt, um in geringen Mengen vorkommende mRNAs oder mRNAs in geringen Mengen von Zellen zu detektieren und zu quantifizieren. Da RNA nicht als Template für die PCR dienen kann, besteht der erste Schritt einer RT-PCR in der reversen Transkription jeder mRNA in eine komplementäre ssDNA-Kopie (cDNA), unter Verwendung des retroviralen Enzyms „Reverse Transkriptase“, gefolgt von der exponentiellen Amplifikation einer spezifischen cDNA mittels Gen-spezifischem Primerpaar in der PCR-Reaktion (Freeman et al., 1999; Bustin, 2000). Generell gibt es zwei Strategien die bei der Durchführung einer RT-PCR befolgt werden können. Wird ein 1-Schritt-Verfahren angewendet, reduziert das zwar den zeitlichen Aufwand, jedoch muss für jeden untersuchten Parameter eine einzelne RT-Reaktion durchgeführt werden. Daher ist für ein Screening vieler verschiedener Marker ein 2-Schritt-Verfahren, in dem beide Reaktionen getrennt voneinander durchgeführt werden, vorteilhafter.

8. RT-PCR Quantifizierungsprinzipien

Schon bald nach der Entwicklung der PCR wurden Versuche unternommen, sie nicht nur zum qualitativen Nachweis, sondern auch zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuremengen einzusetzen (Wang et al., 1989; Gilliland et al., 1990).

Im allgemeinen werden, wie auch bei anderen Methoden mit quantitativem Anspruch, zwei Quantifizierungsprinzipien für die Durchführung einer quantitative RT-PCR unterschieden: die „absolute“ und die „relative“ Quantifizierung (Freeman et al., 1999; Ginzinger, 2002). Während bei einer absoluten Quantifizierungsmethode die Target-Konzentration als Absolutwert (z.B. Kopienzahl/µg RNA) anhand eines externen Standards bekannter Konzentration ermittelt wird, beschreibt die relative Methode die Veränderung der Expression des Target-Gens in Relation zu einer Referenz, wie z.B. einem endogenen „housekeeping“ Gen oder einer unstimulierten Kontrolle (Stordeur et al., 2002). Für die Analyse der Genexpression wird die RT-PCR häufig unter Verwendung von sog. Haushaltsgenen („housekeeping genes“) als Referenz durchgeführt. Dabei handelt es sich um eine große Gruppe von Genen, die in allen eukaryontischen Zellen, unabhängig vom Spezialisierungsgrad exprimiert werden. Sie kodieren für Genprodukte, die an essentiellen strukturellen, metabolischen, synthetischen oder reproduktiven Prozessen beteiligt sind (Ibelgaufts, 1993).

Da angenommen wird, dass sie konstitutiv auf einem ähnlichen mRNA-Level in allen Zelltypen exprimiert werden, fungieren sie als interne Kontrolle, gegen die der Expressionslevel des zu untersuchenden Gens normalisiert werden kann. Indem die Konzentration des Targets in jeder Probe durch die Konzentration des „housekeeping“ Gens in derselben Probe dividiert wird, können, die RT-PCR beeinflussende Faktoren wie z.B. Variationen der anfänglich eingesetzten RNA-Menge oder RNA-Qualität, eine mögliche RNA-Degradation, Differenzen in der Effizienz der cDNA-Synthese, eventuell vorhandene Inhibitoren und Pipettierfehler korrigiert werden. Für die überwiegende Mehrheit der experimentellen Studien ist eine relative Messung die Methode der Wahl. Eine akkurate absolute Messung mit einer hohen Richtigkeit („wahrer Wert“) ist, wenn überhaupt, nur mit großem Aufwand zu erzielen, bedenkt man alleine die Abhängigkeit einer korrekten Quantifizierung von der Richtigkeit der verwendeten Standards (Freeman et al., 1999; Rasmussen, 2001).

Teil C: Ziele der Arbeit

In dieser Arbeit wurde ein serielles Immunonitoring im Vergleich verschiedener an Multiple Sklerose erkrankter Patientengruppen durchgeführt. Für das anwendungs-bezogene Screening MS-relevanter immunologischer Parameter wurde ein für die Fragestellung geeignetes System des neuartigen Verfahrens der quantitativen „real-time“ RT-PCR entwickelt und mit ELISA-Testsystemen kombiniert, um die immunologische Situation bei MS-Patienten auf Gen- und Proteinebene unter Einfluss einer rekombinanten ß-Interferontherapie verfolgen zu können.

Aufgrund ihrer entscheidenen Rolle in der MS-Pathogenese wurden für die Untersuchungen Zytokine (IL-4, IFN-g, IFN-ß, TNF-ß), Zytokinrezeptoren (IL-4R, sTNF-R1, sTNF-R2, sIL-4R) sowie Adhäsionsmoleküle (sICAM-1, sVCAM-1) nach folgenden Kriterien ausgewählt:

- TH1-TH2 Konzept der pro-inflammatorischen (IFN-g, TNF-ß) und anti-inflammatorischen (IL-4) Zytokinwirkungen
- Zytokin-Zytokinrezeptor Wechselwirkungen (sIL-4R, sTNF-R1, sTNF-R2)
- Bekannte antagonistische Wirkungen (IL-4, IFN-g, IFN-ß)
- Prozesse an der Blut-Hirn-Schranke (sICAM-1, sVCAM-1)

Mit der Beschreibung immunologischer Profile und deren Entwicklung über den Zeitverlauf bei untherapierten und ß-Interferontherapierten (rIFN-ß1a [RebifÒ], rIFN-ß1b [BetaferonÒ]) MS-Patienten waren folgende Ziele verbunden:

Bis heute ist die genaue Wirkweise der ß-Interferone weitesgehend unbekannt. Durch den Vergleich der Situation untherapierter und therapierter Patienten sollten potentielle Wirkmechanismen aufgedeckt werden.

Der Therapieeffekt wird bis heute vorwiegend anhand klinischer Parameter (Schubanzahl, EDSS) gemessen, zu deren Evaluierung lange Beobachtungszeiten von Nöten sind. Daher sollte ein anwendungsbezogenes Testsystem mittels der immunologischen Parameter entwickelt werden, dass prognostische Aussagen bezüglich des weiteren klinischen Verlaufs und des Ansprechens der Therapie im Sinne von „Respondern“ und „Nonrespondern“ erlauben würde.

III. MATERIAL UND METHODEN

Teil a: Der Klinische Bereich

1. Allgemeines Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie

Bei der in diese Arbeit einbezogenen wissenschaftlichen Studie handelt es sich um offene, kontrollierte, nicht-randomisierte, prospektive Verlaufsbeobachtungen bei Patienten mit Multipler Sklerose (MS) unter Therapie mit rekombinaten ß-Interferonen (rIFN-ß1a, rIFN-ß1b). In der offenen Studie erfolgte keine Blindung, sowohl der Patient als auch der behandelnde Arzt kannten somit die Art der Behandlung. Aufgrund der ethischen Vertretbarkeit wurde keine Randomisation vorgenommen. Die Patienten haben in Absprache mit dem Arzt über die Gruppen-zugehörigkeit entschieden und konnten während der Beobachtung nach ihrem Befinden zwischen den Gruppen wechseln. Die MS-Patienten wurden im Rahmen der Gießener MS-Ambulanz für die Studie rekrutiert. Vor einer Aufnahme wurden sie über die Teilnahme aufgeklärt und gaben für die in der Studie durchgeführten Blutabnahmen und -untersuchungen ihr schriftliches Einverständnis.

In der Studie wurden zwei in der Therapie unterschiedliche Verumgruppen [rIFN-ß1a (RebifÒ, Serono GmbH, Unterschleißheim); rIFN-ß1b (BetaferonÒ, Schering Deutschland GmbH, Berlin)] im Vergleich zu einer Gruppe untherapierter MS- Patienten (Kontrollgruppe) und zu gesunden Individuen ohne neurologische Erkrankungen untersucht. In den Gruppen der BetaferonÒ-therapierten MS-Patienten konnten darüber hinaus die Verlaufsformen der schubförmig-remittierenden MS (RR-MS) und der sekundär chronisch-progredienten MS (SP-MS) verglichen werden.

Als Indikation für eine Interferon-Therapie mit RebifÒ und BetaferonÒ galten zum Zeitpunkt der durchgeführten Studie eine klinisch gesicherte MS vom schubförmigen Verlauf mit mindestens zwei Schüben innerhalb der letzten zwei Jahre und erhaltener Gehfähigkeit des Patienten. Während der Untersuchungsphase wurde Betaferon auch für die sekundär chronisch-progrediente MS zugelassen. Hierfür gilt als Indikation eine sich um einen Punkt im EDSS pro Jahr verschlechternde Progression.

Den therapierten MS-Patienten wurde unmittelbar vor Therapiebeginn und danach jeweils in Abständen von 3 Monaten bei ihrer Wiedervorstellung in der Ambulanz Blut für die Bestimmung der immunologischen Parameter entnommen. Die geplante Beobachtungsphase betrug bei den RebifÒ-therapierten sowie bei den BetaferonÒ-therapierten SP-MS Patienten jeweils 12 Monate. Die BetaferonÒ-therapierten RR-MS Patienten sollten über einen Zeitraum von 24 Monaten beobachtet werden.

Auch die untherapierten MS-Patienten wurden alle 3 Monate in der Sprechstunde vorstellig, wobei auch ihnen Blut für die wissenschaftlichen Untersuchungen entnommen wurde. Der geplante Beobachtungszeitraum betrug 12 Monate.

2. Untersuchte Patientenkollektive

Für aussagefähige Untersuchungen wurden insgesamt 96 an MS erkrankte Patienten [77 Frauen (80,2%), 19 Männer (19,8%)] im Zeitraum von April 1998 bis Februar 2002 für die in diese Arbeit eingegangene wissenschaftliche Studie rekrutiert (Abb. 11). Zum Vergleich wurden 20 gesunde Probanden in die Studie aufgenommen.

Alle Patienten hatten eine nach den Kriterien von Poser et al. (1983) klinisch gesicherte Multiple Sklerose. 79 der MS-Patienten wiesen eine RR-MS auf, wohingegen 17 MS-Patienten schon in die Verlaufsform der SP-MS übergegangen waren. Insgesamt 27 der RR-MS Patienten wurden mit RebifÒ therapiert, 18 mit BetaferonÒ und 50 der RR-MS Patienten blieben untherapiert, wobei 16 Patienten dieser Gruppe im Verlauf der Beobachtung in eine Therapie mit RebifÒ (N= 13) bzw. mit BetaferonÒ (N= 3) gewechselt haben und in diesen Gruppen weiter dokumentiert wurden. Alle SP-MS Patienten wurden ausschließlich mit BetaferonÒ behandelt. Die Patienten wurden standardmäßig über 12 Monate beobachtet und quartalsweise kontrolliert (Visiten VO vor sowie V1, V2, V3, V4 nach 1, 2, 3 bzw. 4 Quartalen). Von diesem Schema abweichend kam es jedoch zu einer vorzeitigen Beendigung der Behandlung / Beobachtung aus den in Abb. 11 genannten Gründen. In den geplanten Beobachtungszeiträumen haben 6 Patienten die ursprüngliche Therapie aufgrund von Nebenwirkungen (n= 4) bzw. einer unter Therapie fortschreitenden Progredienz (n= 2) abgebrochen.

Abb. 11: Disposition der MS-Patienten und der gesunden Probanden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Zusammensetzung der einzelnen Kollektive ist im folgenden detaillierter beschrieben. Die demographischen Daten werden im Ergebnisteil in Tab. 9 vergleichend dargestellt.

2.1. Untherapiertes Kollektiv (Kontrollgruppe)

In der untherapierten Vergleichsgruppe wurden 50 RR-MS Patienten möglichst über 12 Monate beobachtet. Zu einem vorzeitigen Abbruch der Beobachtungsphase kam es, da 16 der Patienten in die therapierten Kollektive wechselten, wobei sich 13 Patienten für eine Therapie mit rIFN-ß1a (RebifÒ) und 3 Patienten für eine Therapie mit rIFN-ß1b (BetaferonÒ) entschieden hatten. In den therapierten Gruppen wurden diese Wechsler weiter dokumentiert, weshalb sie zwei Kollektiven zugeordnet werden konnten und damit doppelt auftraten. Bei 13 weiteren untherapierten Patienten kam es aus verschiedenen Gründen ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch (Wechsler zu anderen Therapieformen, Noncompliance, zum Besuch K4 nicht erschienen), so dass beim Zeitpunkt von 12 Monaten noch 21 Patienten in die Auswertungen eingehen konnten. Die Geschlechterverteilung im Kollektiv liegt bei 3:1 zu Gunsten der Frauen. Das Durchschnittsalter bei der Erstdiagnose der MS beträgt 30,7 Jahre (SD ± 7,5). Die Dauer der Erkrankung liegt im Mittel bei 5,6 Jahren (SD ± 5,9). Bei Aufnahme in die wissenschaftliche Studie waren die Patienten durchschnittlich 35,8 Jahre (SD ± 8,4) alt mit einer mittleren Schubanzahl in den letzten zwei Jahren von 1,8 (SD ± 0,7), einem mittleren EDSS-Wert von 1,5 (SD ± 1,0) sowie einem Progressionsindex von 2,4 (SD ± 10,4).

2.2. ß-Interferon Therapierte Kollektive (Therapiegruppen)
2.2.1. rIFN-ß1a (RebifÒ) Therapiertes Kollektiv

Insgesamt wurden 27 RR-MS Patienten mit dem Wirkstoff rIFN-ß1a (RebifÒ) therapiert, von denen 14 Patienten primär, die restlichen 13 sekundär nach Wechsel aus der untherapierten Kontrollgruppe diese Therapie erhielten. Das Präparat wurde vom Patienten selbst in Form einer Fertigspritze mit einer Wochendosis von 3x 22 µg (18 MIU biologische Aktivität) subcutan (s.c.) verabreicht. Die Patienten wurden unter der Therapie soweit möglich über einen Zeitraum von 12 Monaten beobachtet. Zu einem vorzeitigen Abbruch der Therapie kam es bei 4 Patienten aus verschiedenen Gründen (Wechsler zu anderen Therapieformen, unerwünschte Ereignisse (UE), fehlende Besuchstermine), so dass beim Zeitpunkt von 12 Monaten noch 23 Patienten in die Auswertungen eingehen konnten. Die Geschlechterverteilung im Kollektiv liegt bei 4:1 zu Gunsten der Frauen. Das Durchschnittsalter bei der Erstdiagnose der MS beträgt 30,6 Jahre (SD ± 6,8). Die Dauer der Erkrankung liegt im Mittel bei 6,6 Jahren (SD ± 5,3). Bei Aufnahme in die wissenschaftliche Studie waren die Patienten durchschnittlich 36,7 Jahre (SD ± 8,9) alt mit einer mittleren Schubanzahl in den letzten zwei Jahren von 2,5 (SD ± 0,9), einem mittleren EDSS-Wert von 2,7 (SD ± 2,1) sowie einem Progressionsindex von 0,9 (SD ± 1,6).

2.2.2. rIFN-ß1b (BetaferonÒ) Therapierte Kollektive

- RR-MS Kollektiv

Insgesamt wurden 35 MS-Patienten mit dem Wirkstoff rIFN-ß1b therapiert. Davon gehörten 18 Patienten zur RR-MS Gruppe, von denen 15 primär, die restlichen 3 sekundär nach Wechsel aus der untherapierten Kontrollgruppe diese Therapie erhielten. Die übrigen 17 Patienten stellten die SP-MS Gruppe dar. Das Präparat wurde vom Patienten selbst alternierend jeden zweiten Tag s.c. verabreicht. Dies ergab eine mittlere Wochendosis von 28 MIU biologische Aktivität (875 µg).

Die therapierten RR-MS Patienten wurden unter der Therapie soweit es möglich war über einen Zeitraum von 24 Monaten beobachtet. Bis zu einem Zeitpunkt von 12 Monaten konnten alle 18 Patienten vollständig beobachtet werden. Danach haben 7 Patienten die Therapie aus verschiedenen Gründen abgebrochen (Wechsler zu anderen Therapieformen, UE, Noncompliance, nach T5 nicht weiter beobachtet), so dass beim Zeitpunkt von 24 Monaten noch 11 Patienten in die Auswertungen eingehen konnten. Die Geschlechterverteilung im Kollektiv liegt bei 5:1 zu Gunsten der Frauen. Das Durchschnittsalter bei der Erstdiagnose der MS beträgt 28,2 Jahre (SD ± 7,6). Die Dauer der Erkrankung liegt im Mittel bei 6,3 Jahren (SD ± 4,3). Bei Aufnahme in die wissenschaftliche Studie waren die Patienten durchschnittlich 34,1 Jahre (SD ± 7,9) alt mit einer mittleren Schubanzahl in den letzten zwei Jahren von 2,8 (SD ± 1,2), einem mittleren EDSS-Wert von 2,3 (SD ± 1,3) sowie einem Progressionsindex von 0,7 (SD ± 0,8).

- SP-MS Kollektiv

Die therapierten SP-MS Patienten wurden unter Therapie soweit es möglich war über einen Zeitraum von 12 Monaten beobachtet. Zu einem vorzeitigen Abbruch der Therapie kam es bei 3 Patienten aus verschiedenen Gründen (Wechsler zu anderen Therapieformen, UE, fehlender Besuchstermin), so dass beim Zeitpunkt von 12 Monaten noch 14 Patienten in die Auswertungen eingehen konnten. Die Geschlechterverteilung im Kollektiv liegt bei 3:1 zu Gunsten der Frauen. Das Durchschnittsalter bei der Erstdiagnose der MS beträgt 35,9 Jahre (SD ± 9,4). Die Dauer der Erkrankung liegt im Mittel bei 12,6 Jahren (SD ± 8,7). Bei Aufnahme in die wissenschaftliche Studie waren die Patienten durchschnittlich 47,9 Jahre (SD ± 9,0) alt mit einer mittleren Schubanzahl in den letzten zwei Jahren von 1,4 (SD ± 0,6), einem mittleren EDSS-Wert von 5,2 (SD ± 0,9) sowie einem Progressionsindex von 1,0 (SD ± 1,5).

2.3. Gesundenkollektiv

20 gesunde Individuen ohne neurologische Erkrankungen wurden im Umfeld des Neurochemischen Labors rekrutiert. Zum Zeitpunkt der Blutabnahme haben sie nach eigener Angabe keine, das Immunsystem beeinflussenden anderen Erkrankungen aufgewiesen bzw. Therapeutika eingenommen. Die Geschlechterverteilung im Kollektiv liegt bei 3:1 zu Gunsten der Frauen. Das Durchschnittsalter bei Studienbeginn beträgt 36,1 Jahre (SD ± 13,5).

2.4. Verwandtschaftsbeziehungen von Patienten der untersuchten Kollektive

Verwandtschaftliche Beziehungen zwischen den Patienten der verschiedenen Kollektive traten in einem Fall auf. Es handelte sich um ein weibliches Geschwisterpaar, wobei eine Patientin mit RebifÒ behandelt wurde, die andere untherapiert blieb.

3. Dokumentation von Patientendaten aus dem klinischen und wissenschaftlichen Bereich: Entwicklung eines EDV-gestützten Dokumentationssystems zur Erfassung von Patientendaten (Access-Datenbank)

Ein an der Neurologischen Klinik mit Unterstützung der Serono GmbH (Unter-schleißheim) iniziiertes Pilotprojekt „Qualitätsnetzwerk Multiple Sklerose Mittelhessen“ sah die Einführung eines EDV-gestützten, Qualitätsmanagement-orientierten Dokumentations-, Evaluations- und Kommunikationsprogramms (TQ-MSÒ PromiseÒ: T otal Q uality Management in der Versorgung von MS Patienten; Pr axis- o rientiertes M ultiple Sklerose I nformations- S ystem zur Einhaltung von Qualitätsstandards in der Versorgung von MS Patienten) zur verbesserten Versorgung von MS Patienten in einem Netzwerk aus u.a. Kliniken und Praxen vor. Dieses Programm ermöglichte eine strukturierte Dokumentation aller für den klinischen Alltag relevanten Patientendaten in einer Datenbank. Allerdings war in diesem Programm keinerlei Möglichkeit zur Dokumentation wissenschaftlichen Datenmaterials vorgesehen. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit ein komplexes Access-Datenbanksystem für eine prospektive und einheitliche Erfassung der, für die gesamten in der Arbeitsgruppe bestehenden Forschungsprojekte, wissenschaftlich relevanten Daten entwickelt und für eine Verknüpfung mit „TQ-MS Promise“ erweitert.

4. Klinische Methoden

4.1. Klinische Untersuchungen

Bei therapierten und untherapierten MS-Patienten erfolgte im Rahmen ihrer dreimonatigen Ambulanzbesuche eine vom behandelnden Arzt durchgeführte standardisierte neurologische Untersuchung inklusive der Bestimmung der Gehfähigkeit (Wegstrecke in Metern) der MS-Patienten. Mittels dieser Untersuchungen wurden die Funktionen von acht Funktionellen Systemen überprüft (Pyramidenbahn [Lähmungen], Kleinhirn [Ataxie, Tremor], Hirnstamm [Nystagmus, Sprechstörungen], Sensorium [Missempfindungen, Taubheitsgefühl, Kribbeln], Blasen- und Mastdarmfunktionen [Inkontinenz], Sehfunktionen [Doppelbilder, Gesichtsfeldeinschränkung], cerebrale Funktionen [Bewegungskoordination] und mentaler Funktionen [Depression, Demenz]). Die Art der Symptome, ihr Beginn und Verlauf tragen wesentlich zur Diagnosestellung bei und werden zur Lokalisation der Schädigung im ZNS herangezogen.

4.2. Schübe

Als Schub bezeichnet man die sich klinisch äußernden MS-typischen neurologischen Ausfallerscheinungen einzelner Funktionen des ZNS. Sie können sich innerhalb weniger Stunden bis zu Tagen entwickeln. Die Schübe zeigen das Auftreten eines neuen Symptoms, das Wiederauftreten eines früheren Symptoms oder die Verschlechterung eines vorhandenen Symptoms an. Die Dauer muss länger als 24 Stunden anhalten. Die Remission (Rückbildung der Symptome) kann vollständig oder nur teilweise erfolgen. Sie erfolgt manchmal spontan auch ohne Behandlung, kann sich aber auch über einen längeren Zeitraum hinauszögern.

Die Dokumentation der Schübe erfolgte anamnestisch bei den dreimonatigen Terminen in der MS-Ambulanz durch den behandelnden Arzt.

4.3. EDSS

Die EDSS (expanded disability status scale) ist eine Leistungsskala nach Kurtzke (1983) und gibt Auskunft über den aktuellen Grad der Behinderung eines MS- Patienten. Ferner kann sie als Basis genommen werden, um mögliche im Verlauf auftretende Veränderungen oder den Grad der Verschlechterung des Krankheitsbildes vergleichend aufzuzeigen. Daher wird die EDSS auch eingesetzt, um das Anschlagen oder Versagen einer Langzeittherapie, z.B. mit Interferonen, abzuschätzen.

Die Werte der Skala reichen von 0,0 (keine neurologischen Defizite) in 0,5-Punkt-Schritten bis 10 (Tod infolge MS) (Anhang: Abb. 1). Die Angaben der Grade in der EDSS ergeben sich aus der standardisierten neurologischen Untersuchung der acht Funktionellen Systemen (s.o.) unter Einbeziehung der noch vorhandenen Gehfähigkeit eines MS Patienten. Für jedes der Systeme werden Punktwerte vergeben. Aus der Kombination der einzelnen Scores ergeben sich die Behinderungsgrade in der EDSS.

Teil B: Der labormethodische Bereich

Für das Immunmonitoring der zu analysierenden Zytokine auf verschiedenen Ebenen der Genexpression fanden molekularbiologische und immunologische Methoden Verwendung. Für die Analyse der mRNA-Expression wurde das neueste Fluoreszenz-basierte Verfahren der „real-time“ und „on-line“ RT-PCR herangezogen. ELISA-Testsysteme wurden für die Bestimmung der Proteinkonzentrationen im Serum entwickelt. Die verwendeten Methoden und deren Etablierung für das MS-System werden im folgenden detaillierter beschrieben.

1. Material

1.1. Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien besaßen, sofern nicht anders angegeben, den Reinheitsgrad `zur Analyse´ bzw. `für die Molekularbiologie´ und wurden von den Firmen Merck (Darmstadt) und Roth (Karlsruhe) bezogen. Enzyme und andere molekularbiologische Reagenzien wurden von Roche Molecular Biochemicals (Mannheim), Qiagen (Hilden), Life Technologies (Karlsruhe), Eurogentec (Köln) und Promega (Heidelberg) bezogen. Primer und Hybridisierungssonden wurden von TIB Molbiol (Berlin) entwickelt und synthetisiert. Die Standardplasmide wurden von GenExpress (Berlin) kloniert. Die Reagenzien waren für die Verwendung mit RNA geeignet. Arbeitsflächen und Glas- bzw. Plastikmaterialien (Küvette, Pipetten) wurden mit einer gebrauchsfertige Lösung (LTK 008, biodelta, Bad Oeynhausen) behandelt, um kontaminierende Nukleinsäuren bzw. RTasen und DNasen zu entfernen.

1.2. Materialien

Für die Arbeit mit RNA wurden spezielle Plastikmaterialien zur einmaligen Verwendung von den Firmen Biozym (Hessisch-Oldendorf) und Greiner (Frickenhausen) bezogen. Für die Verarbeitung der Blutproben wurden sterile, pyrogenfreie Plastikmaterialien der Firmen Kabe Labortechnik (Nümbrecht-Elsenroth), Greiner (Frickenhausen), BD Biosciences (Heidelberg) und Nunc (Wiesbaden) benutzt, um eine Stimulation der Zellen zu vermeiden.

1.3. Humanes Probenmaterial

MS-Patienten und gesunden Probanden wurde je nach labormethodischer Anwendung Vollblut in unterschiedlich präparierten Probenröhrchen (Kabevetten®, Kabe Labortechnik, Nümbrecht-Elsenroth) entnommen und sofort weiter bearbeitet. Für die Bestimmung der Proteinkonzentration löslicher Zytokine und -rezeptoren bzw. löslicher Adhäsionsmoleküle (ELISA) wurde das Blut in sog. Serum-Röhrchen entnommen. Diese Röhrchen waren mit einem Koagulans präpariert. Das in wenigen Minuten geronnene Blut wurde für 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand (Serum) wurde in Kryoröhrchen aliquotiert und bei -20°C eingefroren.

Für die Quantifizierung der Transkriptanzahlen (Q-RT-PCR) wurde Blut in EDTA-di-Kaliumsalz präparierten Röhrchen entnommen, wodurch die Koagulation verhindert wurde. Da während der zweimal wöchentlich stattfindenden MS-Sprechstunde keine RNA-Isolation aus den abgenommenen Patientenproben vorgenommen werden konnte, wurden diese in der Weise vorbereitet, dass sie zunächst bei -80°C eingefroren werden konnten. Diese Proben wurden später zur Isolation von Gesamt-RNA aus Leukozyten herangezogen (s.u.).

2. Molekularbiologische Arbeiten

2.1. Von der RNA-Isolation zur Reversen Transkription

Von MS-Patienten und gesunden Probanden wurde das frisch entnommene EDTA antikoagulierte Vollblut für die RNA-Isolation benutzt. Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung des „QIAamp® RNA Blood Mini Kits“ (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus den Leukozyten isoliert. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Isolationsmethode (Boom et al., 1990) beruht auf der spezifischen Bindung von Nukleinsäuren an eine Silica-Gel-Membran unter Beisein von chaotropen Salzen (Vogelstein et al., 1979; Hamaguchi et al., 1962) in hoher Konzentration. Proteine absorbieren nicht an die Membran und werden ausgewaschen. Die gebundenen Nukleinsäuren werden unter Verwendung von Salzen in geringer Konzentration wieder von der Säule eluiert.

2.1.1. Vorbereitung der Proben während der MS-Sprechstunde

Nach Abnahme der Patientenproben wurden 1,5 mL Blut mit 7,5 mL EL-Puffer versetzt, gemischt und für 10-15 min auf Eis inkubiert. Während dieser Zeit wurden selektiv die Erythrozyten lysiert. Da sie in ca. 1000fach größerer Menge im Blut vorkommen als die Leukozyten und keine RNA enthalten, sollten sie vor der RNA Isolation entfernt werden. Die Suspension wurde während der Inkubation durchsichtig, wodurch eine vollständige Lyse angezeigt wurde. Anschließend wurden die Leukozyten mittels einer Zentrifugation für 10 min, 1600 rpm, 4°C pelletiert. Nach entfernen des Überstandes wurde das Pellet mit 3mL EL-Puffer gewaschen und wiederum zentrifugiert (s.o.). Das aus Leukozyten bestehende Pellet wurde nach sorgfältiger Abnahme des Überstandes in 600µL RLT-Puffer resuspentiert. Durch die Zugabe des Puffers wurden zum einen die Zellen lysiert, zum anderen die für die Bindung der RNA benötigten chaotropen Salze eingebracht. Um die freigesetzte RNA vor dem Abbau durch RNasen zu schützen, wurde dem RLT-Puffer zusätzlich zum schon vorhandenen Guanidiniumthiocyanat, 2-Merkaptoethanol (Merck, Darmstadt) hinzugefügt, wodurch eine Inhibition der RNAsen durch die Reduzierung von Disulfid-Brücken erzielt wurde. Die Zell-Lysate wurden bei -80°C eingefroren.

2.1.2. RNA-Isolation mit Durchführung eines DNase-Verdaus

Um enthaltene Salze vollständig zu lösen, wurde das eingefrorene Zell-Lysat für 10 min bei 37°C aufgetaut. Alle folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur (15°C-20°C) so schnell wie möglich durchgeführt.

Zur Homogenisierung des Lysates wurde es auf die sog. „Shredder“-Säule pipettiert und für 2 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Dieser Schritt bewirkte u.a. das Scheren der genomischen DNA, um sie in den folgenden Schritten leichter entfernen zu können. Der Durchfluss wurde anschließend mit 600µL Ethanol (70%) versetzt, mit der Pipette durchmischt und für die RNA-Bindung auf die Silica-Gel-Membran pipettiert. Die Säule wurde für 15 sec bei 11.000 rpm zentrifugiert, anschließend mit 350µL RW1-Puffer gewaschen und wiederum zentrifugiert (s.o.). Anschließend wurde direkt auf der Säule ein DNase-Verdau mittels des „RNase-Free DNase Sets“ (Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchführt. Dazu wurden 80µL DNase I (ca. 27 Units) auf die Säulen-Membran pipettiert und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Säule wiederum mit 350µL RW1-Puffer gewaschen und zentrifugiert (s.o.). Mittels dieses Puffers wurden Reste von DNA und Proteinen ausgewaschen. Zur Entfernung der chaotropen Salze wurde die Säule anschließend mit 500µL RPE-Puffer gewaschen und zentrifugiert (s.o.). Um die Bindebedingungen für die RNA beizubehalten, wurde dem Puffer Ethanol zugegeben. Der Waschschritt wurde wiederholt und zur vollständigen Entfernung von Puffer und Ethanol 3 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Schließlich wurde die RNA in 50µL RNase-freiem H2O von der Säule eluiert.

2.1.3. Konzentrationsbestimmung der RNA im Photometer

Die Konzentration und Reinheit der isolierten RNA wurde im Spektralphotometer (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Cambridge, England) bei 260nm (OD260), 280nm (OD280) und 320nm (OD320) bestimmt. Dazu wurde die RNA 1:5 in RNase-freiem H2O verdünnt und in einer Quarzglasküvette (50µL, 1cm Schichtdicke; Hellma, Müllheim) ausgemessen. Zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren wird der OD260 Wert herangezogen, wobei 1 OD260 einer Konzentration von 40µg/mL ssRNA entspricht (Sambrook et al., 1989). Die Reinheit der isolierten RNA wurde überprüft mittels des OD260/OD280 Verhältnisses.

2.1.4. cDNA-Synthese

In der Reversen Transkriptionsreaktion wurden unter Verwendung einer Reversen Transkriptase die mRNAs aus den Leukozyten in einen Pool von Einzelstrang-cDNAs umgeschrieben, um sie in der anschließenden PCR amplifizieren zu können. Für die cDNA-Synthese wurden 9,5µL Gesamt-RNA [ca. 0,2-1,2µg] in einem Endvolumen von 20µL unter Verwendung eines herkömmlichen Thermocyclers (Hybaid, Heidelberg) revers transkribiert.

Die RNA sowie 1µL Oligo-dT12-18 Primer [0,1µg/µL] (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) wurden zunächst bei 70°C für 10 min im Cycler inkubiert, um vorhandene Sekundärstrukturen der mRNAs aufzulösen. Anschließend wurden die Ansätze sofort auf Eis abgekühlt. Je 9,5µL auf Eis vorbereiteter Mastermix, bestehend aus 4µL 5x Reaktionspuffer (Life Technologies, Karlsruhe), 2µL Dithiothreitol [0,1M] (Life Technologies), 2µL dNTPs [5mM jedes] (Eurogentec, Köln), 0,5µL RNase-Inhibitor [40U/µL] (Promega, Heidelberg) und 1µL SuperScript® M-MLV RNase H– Reverse Transkriptase [200U/µL] (Life Technologies) wurde den Ansätzen zugegeben. Durch eine Zentrifugation wurden die Ansätze gemischt. Die cDNA Synthese wurde durchgeführt bei 35°C, 10 min für das Annealing des Primers an den poly A-Bereich, 42°C, 60 min für die Reverse Transkription, 95°C, 5 min zur Inaktivierung der RTase und 4°C, ∞ zur schnellen Abkühlung der Ansätze. Die cDNAs wurden in silikonisierte Reaktionsgefäße aliquotiert und bei -20°C gelagert.

2.2. Messung der Genexpression mittels quantitativer „Real-Time“ RT-PCR
2.2.1. Strategie für die RT-PCR Optimierungen

Zwei RNA-Isolationskits (Qiagen, Roche) wurden bezüglich der Qualität und des Ertrags der extrahierten RNA verglichen. Die RT-Reaktion wurde durch die Variation der in die Reaktion eingebrachten Menge an Gesamt-RNA auf ihre Linearität hin überprüft. Auch wurden verschiedene RTasen (Life Technologies, Roche, Qiagen) verglichen. Die PCR-Bedingungen wurden zunächst hinsichtlich der MgCl2-Konzentration (1-5mM) mit verschiedenen Primer- Kombinationen unter Verwendung von Plasmid-Standardverdünnungen (105, 104, 103) und cDNA (1:1, 1:10) optimiert. Die amplifizierten Produkte wurden unter Verwendung von SYBR-Green I mit einer angeschlossenen Schmelzkurvenanalyse verifiziert, um spezifische Produkte und Primer-Dimere aufgrund ihrer Unterschiede im Tm zu identifizieren. Für die Adaption auf das spezifische „Hybridization Probes“-Format wurde erneut eine MgCl2-Titration (1-5mM) notwendig. Sämtliche Etablierungsreaktionen wurden zusätzlich mittels Agarosegel-Elektrophorese überprüft, um die Produktlänge mit den Schmelzpeaks korrelieren zu können. Um auf mögliche genomische DNA-Kontaminationen (unvollständiger DNase-Verdau) der Gesamt-RNA kontrollieren zu können (besonders wichtig für IFN-beta, da keine mRNA-spezifischen Primer vorlagen), wurde die isolierte RNA in der PCR für 45 Zyklen unter Verwendung der optimierten Primer-Sonden-Paare ohne vorherige RT amplifiziert (RT-minus Kontrolle). Weitere Optimierungen beinhalteten die Variation der Primer- und Sondenkonzentrationen sowie der Annealing-Temperaturen und eine Kontrolle auf das Vorhandensein von Inhibitoren (EDTA, Heparin, Porphyrine aus dem Blut).

Um die PCR Amplifikationseffizienzen von cDNA aus MS-Patientenmaterial mit der von den homologen DNA Plasmid-Standards vergleichen zu können, wurden, so wie bei den Plasmid-Standardkurven, durch PCR Amplifikation von Verdünnungsreihen der cDNA (serielle 1:10 Verdünnungen in MS2-RNA; 5-fach Bestimmung jedes Verdünnungspunktes) ebenfalls „Standardkurven“ der cDNA generiert. Die Kopienzahlen der verschiedenen Parameter aus der cDNA wurden mittels der geeigneten importierten Plasmid-Standardkurve ermittelt.

2.2.2. Oligonukleotide

Die Primer und Hybridisierungssonden (Tab. 1) wurden entwickelt und synthetisiert von TIB Molbiol (Berlin). Für die PCR Amplifikationen wurden die Primer in entsalzter Form, die Sonden mehrfach HPLC-gereinigt eingesetzt. Um eine Amplifikation von genomischer DNA zu verhindern, wurden die Primersysteme für verschiedene Exons oder über Exon-Intron-Grenzen hinweg synthetisiert. Das IFNß-Gen enthält keine Introns, weshalb keine Möglichkeit bestand, die Primer im Gegensatz zu allen anderen Targets mRNA-spezifisch zu synthetisieren.

Die Fluoreszenzmarkierung der Hybridisierungssonden erfolgte bei der Donor-Sonde mit Fluorescein (3´-Ende), die der Akzeptor-Sonde mit LightCycler Red 640 (5´-Ende). Damit die freie OH-Gruppe am 3´-Ende der Akzeptor-Sonde nicht als Primer verlängert werden konnte, wurde sie mit einer Phosphat-Gruppe blockiert.

Tab. 1: Primer, „Hybridization Probes“ und Plasmid-Standards für die Q-RT-PCR

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

a die Nukleotid Positionen basieren auf den Sequenzen der humanen Gene für PBGD (GenBank

accession no. X04808), IL-4 (GenBank accession no. M13982), IL-4R (GenBank accession no.

X52425) , IFN g (GenBank accession no. M29383), IFNß (GenBank accession no. NM002176).

b F: Forward primer; R: Reverse primer; FL: Donor-Sonde; LC: Akzeptor-Sonde

c FL: 5,6-carboxyfluorescein angehängt an 3´- 0 -ribose; Red640: LightCycler Red640 angehängt an

das 5´ Ende; ph: Phosphat-Gruppe angehängt an das 3´ Ende.

d BS, BSK: pBluescript (Stratagene, Amsterdam, Niederlande); AT: AT-Cloning vector (BD

Biosciences Clontech, Heidelberg, Deutschland)

e die Sonden werden durch den A/G Polymorphismus für Ile50Val nicht beeinträchtigt

2.2.3. Plasmid-Standards

Die Plasmide dienten als externe, homologe DNA-Standards bekannter Konzentration für die Erstellung von Standardkurven für jedes einzelne Zytokin sowie für das `housekeeping´ Gen PBGD. Die Plasmide (Tab. 1) wurden kloniert von GenExpress (Berlin). Die Klonierungen erfolgten entweder mittels eines A/T- Klonierungsvektors (BD Biosciences Clontech, Heidelberg) oder eines pBluescript Klonierungsvektors (Stratagene, Amsterdam, Niederlande).

- Transformationen

Für die Transformation der Plasmide wurden 100µL E. coli JM 109 `high-

efficiency´ kompetente Zellen (Promega) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben im Herstellerprotokoll. Nach dem Zufügen der zu transformierenden Plasmid-DNA (ca. 4ng) wurden die Ansätze für 20 min auf Eis inkubiert. Durch einen Hitzeschock für 50 sec bei 42°C im Wasserbad wurde die Transformation veranlasst. Nach einer weiteren Inkubation für 2 min auf Eis wurden je 900µL eisgekühltes SOC-Medium (Invitrogen) zugegeben. Zur Regeneration der Zellen wurden sie 90 min bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Von den Transformationsansätzen wurden je 100µL auf Selektivmedium (LB-Ampicillin-Agar: s.u.) ausplattiert, um die Bakterien, die die Plasmid-DNA aufgenommen haben zu selektieren. Das Wachstum erfolgte über Nacht bei 37°C.

- Anlegen von 50mL Flüssigkulturen

Je 50mL LB-Ampicillin-Medium (s.u.) wurde mit einer Bakterienkolonie der Transformationsansätze angeimpft und über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert.

LB-Ampicillin-Medium (Agar): (Sambrook et al., 1989)

10g/L Bacto-Trypton

5g/L Hefeextrakt

10g/L NaCl

2mL/L Ampicillin (Endkonzentration: 100µg/mL)

(15g/L Agar)

60 min autoklaviert (1bar Überdruck, 121°C), pH Einstellung auf 7,5 mit NaOH

- Isolierung der Plasmid-DNA

Die Bakterienkulturen wurden in einer Kühlzentrifuge für 15 min bei 5000rpm zentrifugiert. Die anschließenden Präparationen der Plasmid-DNA erfolgten mittels des „HiSpeed Plasmid Midi Kits“ der Firma Qiagen nach den Angaben im Protokoll. Die Aufreinigungsmethode basiert auf einer Modifikation der „alkalischen Lyse“ (Birnboim, 1983) mit anschließender Bindung der Plasmid-DNA an eine Anionenaustauschersäule.

- Restriktion mit HIND III

Für eine optimale PCR Amplifikation wurden die Plasmid-Standards in linearisierter Form eingesetzt. Dazu bot sich das Restriktionsenzym Hind III an. Für die Restriktion wurde die Plasmid-DNA mit 2µL Hind III [10U/µL] (Roche) und dem vom Hersteller empfohlenen Restriktionspuffer (1/10 des Gesamtvolumens) versetzt. Zur Inkubation bei 37°C für 1h wurden die Ansätze ins Wasserbad gestellt.

- Aufreinigung der linearisierten Plasmid-DNA

Für die Aufreinigung der linearisierten Plasmid-Standards aus den Restriktions-ansätzen wurde das „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen) herangezogen. Auch hierbei wurde die Nukleinsäure, in diesem Fall die DNA, unter Einfluß von chaotropen Salzen an eine Silica-Gel-Membran gebunden (siehe RNA Isolation). Die Durchführung erfolgte nach dem Herstellerprotokoll.

- Konzentrationsbestimmung der DNA im Photometer und Berechnung von Kopienzahlen der Plasmid-Standards

Die DNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch bestimmt (1 OD260 = 50µg/mL). Durch die Messung der OD280 und OD320 wurde auch die Reinheit der DNA kontrolliert (S. 34). Die Kopienzahlen der einzelnen Plasmid-Standards wurden aus der Größe des verwendeten Plasmids (Vektor + Insert), dem durchschnittlichen Molekülgewicht eines Basenpaares (660g/mol) und der Avogadro-Konstante berechnet.

- Verdünnungsreihen der externen Plasmid-Standards

Für die Quantifizierung der verschiedenen Zytokine sowie von PBGD wurde der entsprechende homologe Plasmid-Standard verwendet, um sicher zu stellen, dass cDNA und Standard zumindest mit sehr ähnlicher Effizienz amplifiziert wurden.

Für die Erstellung der externen Standardkurven wurden die linearisierten Plasmide seriell in 1:10 Schritten mit MS2-RNA [Endkonzentration: 10ng/µL] (Roche) in silikonisierten Reaktionsgefäßen derart verdünnt, dass sie eine Endkonzentration in der PCR von 1x 106 bis 1x 100 aufwiesen. Die MS2-RNA diente dabei als Hintergrund, um die Bindung der Plasmid-DNA an die Gefäßwände zu verhindern. Die einzelnen Verdünnungspunkte wurden in silikonisierte Gefäße aliquotiert. Bei -20°C gelagert, konnten sie länger als ein halbes Jahr verwendet werden.

2.2.4. Externe Standardkurven für den Import in verschiedene PCR-Läufe

Die Softwareversion 3.5 des LightCyclerâ Systems ermöglichte es für jeden Parameter externe Standardkurven zu generieren, die als separate Dateien (*.xsc) hinterlegt und somit in verschiedene PCR-Läufe importiert werden konnten.

Um verlässliche Standardkurven für jeden Parameter zu erstellen, wurden für jeden Verdünnungspunkt 5-fach Messungen über den gesamten Kurvenbereich hinweg durchgeführt. Für die Kontrolle der Reproduzierbarkeit wurden die Standardkurven an verschiedenen Tagen wiederholt. Die Standardkurven sollten einen quadratischen Fehler der linearen Regressionsgeraden von £ 0,05 und eine Steigung nahe -3,3 aufweisen und somit eine Amplifikationseffizienz nahe 2,0 (E= 10-1/Steigung) erreichen.

Eine Voraussetzung für das Importieren der externen Standardkurven war, dass eine Probe mit bekannter Konzentration in jeden Lauf integriert werden musste. Dafür wurde die entsprechende aliquotierte 103 Standard-Verdünnung herangezogen. In jedem Lauf wurde ein Duplikat der Verdünnung als Standard definiert und eine Einfachbestimmung des Standards als unbekannte Probe definiert mitgemessen (weiterhin genannt: `103 Triplikat´). Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit importierter Standardkurven wurden jeweils 10 separate Läufe mit importierten Standardkurven für PBGD, IL-4 und IL-4R bezüglich ihrer Variationen analysiert.

2.2.5. „Real-Time“ PCR unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelzkurvenanalyse

Für die Optimierungsreaktionen der quantitativen RT-PCR wurde das SYBR-Green I Format des LightCycler® -Systems mit anschließender Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse verwendet.

SYBR®-Green I (Molecular Probes) ist ein Farbstoff der spezifisch an doppelsträngige DNA bindet (Wittwer et al., 1997). Durch die Bindung des Farbstoffs an die kleine Rinne der DNA wird seine Fluoreszenz verstärkt. Während der PCR bindet SYBR-Green I an die synthetisierten DNA-Produkte, so dass ein Anstieg der Fluoreszenz, wenn sie am Ende jedes Elongationsschritts gemessen wird, die Menge des in dem Zyklus entstandenen PCR-Produktes repräsentiert.

Der Sinn einer Schmelzkurvenanalyse ist es die charakteristische Schmelz-temperatur einer Target-DNA zu bestimmen. Der Schmelzpunkt (Tm) eines DNA-Fragmentes ist abhängig von seiner Länge und dem GC-Gehalt und bezeichnet die Temperatur, bei der die Hälfte der untersuchten DNA einzelsträngig vorliegt. Mittels des für jedes Fragment charakteristischen Tm-Wertes lassen sich z.B. spezifische PCR-Produkte von unspezifischen Nebenprodukten (Primer-Dimere) unterscheiden (Ririe et al., 1997). Die Schmelzkurvenanalyse wurden im Anschluss an eine PCR durchgeführt. Dabei wurde die Fluoreszenz einer Probe mit Zunahme der Temperatur kontinuierlich gemessen. Aufgrund des Schmelzverhaltens der DNA (Denaturierung des Doppelstranges) wurde mit Zunahme der Temperatur eine abnehmende Fluoreszenz detektiert.

Sämtliche Etablierungsreaktionen für die quantitative RT-PCR wurden unter Verwendung des „LightCycler-FastStart DNA Master SYBR- Green I“ (Roche) nach den Angaben im Herstellerprotokoll durchgeführt. Als Master wurde auch hierbei ein gebrauchsfertiger „Hot Start“ Reaktionsmix mit FastStart Taq DNA-Polymerase verwendet (S. 43).

Alle Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20µL pro Kapillare durchgeführt. Ein Mastermix aus den folgenden Komponenten wurde auf Eis zusammen gegeben und in die vorgekühlten Kapillaren pipettiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

* FastStart Taq DNA-Polymerase, SYBR-Green I, Reaktionspuffer, dNTP Mix (dUTP anstelle dTTP),

10mM MgCl2

Zu den 18µL Mastermix wurden 2µL cDNA (1:1, 1:10) bzw. 2µL Plasmid-Standard Verdünnung (105, 104, 103) addiert. In jedem Lauf wurde eine Negativkontrolle mitgeführt, bei der das DNA-Template durch H2O ersetzt wurde.

Nach verschließen der Kapillaren wurden sie für 20 sec bei 3000 rpm zentrifugiert und sofort in den LightCycler überführt.

2.2.6. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelzkurvenanalyse

- Amplifikation

Auch im SYBR-Green I Format wurde zur Aktivierung der FastStart Taq DNA-Polymerase stets ein Prä-Inkubationsschritt von 10 min bei 95°C vorangestellt, gefolgt von 45 Amplifikationszyklen (IFN-beta: 50 Zyklen) bestehend aus 15 sec bei 95°C für die Denaturierung, 10 sec bei 60°C für das `Annealing´ der Primer und 15 sec bei 72°C (Länge Fragment [bp]/25) für die Elongation der Primer. Anschließend wurde der Rotor und die Thermalkammer für 30 sec bei 40°C abgekühlt. Die Eingabe der Protokolle erfolgte ansonsten nach den Vorgaben im LightCycler® Handbuch. Die Rate für den Temperaturwechsel betrug stets 20°C/sec. Die Fluoreszenzmessungen müssen im SYBR-Green I Format im Gegensatz zum Hybridisierungssonden Format am Ende der Elongations-Phase vorgenommen werden, da hier die DNA-Fragmente doppelsträngig vorliegen. Die PCR Rohdaten wurden mittels der LightCycler® Softwareversion 3.5 analysiert. Für die Bestimmung der `Crossing Points´ (Cp) wurden die gemessenen Signale aus dem Fluoreszenz-Kanal 1 herangezogen (`Second Derivative Maximum´ Methode; `proportional baseline adjustment´). Die Softwareversion 3.5 adaptierte automatisch die Fluorimeter-Verstärkung für jeden Messkanal, um eine optimale Darstellung der Fluoreszenzdaten zu erreichen.

- Schmelzkurve

Das Programm für die Schmelzkurvenanalyse beinhaltete drei Schritte. Zunächst wurden bei 95°C und 0 sec die in der PCR amplifizierten DNA-Fragmente denaturiert. Durch eine Abkühlung auf 65°C für 15 sec erfolgte die Renaturierung. Anschließend wurde durch schrittweise Erhöhung der Temperatur von 0,1°C/sec und kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz die Schmelzkurve erstellt.

2.2.7. Quantitative „Real-Time“ PCR unter Verwendung von „Hybridization Probes“

Das LightCycler® -System (Roche) wurde in Verbindung mit der Softwareversion 3.5 für die „real-time“ und „on-line“ Amplifikation sowie für die Datenerfassung und -auswertung (Quantifizierungen) benutzt.

Die Reaktionen wurden unter Verwendung des „LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes“ (Roche) nach den Angaben im Herstellerprotokoll durchgeführt. Der Master ist ein gebrauchsfertiger „Hot Start“ Reaktionsmix, durch dessen Verwendung die Spezifität und Sensitivität der PCR verbessert werden konnte. Er besteht aus zwei Lösungen (FastStart Taq DNA-Polymerase bzw. Reaktionsmix), die kurz vor Verwendung zusammen gegeben wurden. Die FastStart Taq DNA-Polymerase ist eine modifizierte Form der thermostabilen rekombinanten Taq DNA-Polymerase. Sie ist inaktiv bei Raumtemperatur aufgrund des Vorhandenseins von Hitze-labilen Gruppen an einigen Aminosäureresten des Enzyms und wird bei hohen Temperaturen >70°C wieder `aktiviert´ (Dang et al., 1996; Nilsson et al., 1997) (Prä-Inkubationsschritt: siehe Amplifikationsprotokoll). Dadurch kann die Bildung von nicht-spezifischen Nebenprodukten verhindert werden.

Alle Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20µL pro Kapillare durch-geführt. Ein Mastermix aus den folgenden Komponenten wurde auf Eis zusammen gegeben und in die vorgekühlten Kapillaren pipettiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

* FastStart Taq DNA-Polymerase, Reaktionspuffer, dNTP Mix (dUTP anstelle dTTP), 10mM MgCl2

Zu den 18µL Mastermix wurden 2µL cDNA bzw. 2µL der 103 Plasmid-Standard Verdünnung (103 Triplikat: S. 40) addiert. In jedem Lauf wurde eine Negativkontrolle mitgeführt, bei der das DNA-Template durch H2O ersetzt wurde.

Nach verschließen der Kapillaren wurden sie für 20 sec bei 3000 rpm zentrifugiert und sofort in den LightCycler überführt.

2.2.8. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von „Hybridization Probes“

Zur Aktivierung der FastStart Taq DNA-Polymerase wurde stets ein Prä-Inkubationsschritt von 10 min bei 95°C vorangestellt, gefolgt von 45 Amplifikations-zyklen (IFN-beta: 50 Zyklen) bestehend aus 10 sec bei 95°C für die Denaturierung, 10 sec bei 60°C für das `Annealing´ der Primer und 15 sec bei 72°C (Länge Fragment [bp]/25) für die Elongation der Primer. Anschließend wurde der Rotor und die Thermalkammer für 30 sec bei 40°C abgekühlt. Die Eingabe der Protokolle erfolgte ansonsten nach den Vorgaben im LightCycler® Handbuch. Die Rate für den Temperaturwechsel betrug stets 20°C/sec. Die Fluoreszenzmessungen wurden am Ende der Annealing-Phase, d.h. bei Bindung der „Hybridization Probes“, vorgenommen. Die PCR Rohdaten wurden mittels der LightCycler® Softwareversion 3.5 analysiert. Für die Bestimmung der `Crossing Points´ (Cp) wurde die Ratio der Signale gemessen im Fluoreszenz-Kanal 2 zu Fluoreszenz-Kanal 1 herangezogen (`Second Derivative Maximum´ Methode; `proportional baseline adjustment´). Die Softwareversion 3.5 adaptierte automatisch die Fluorimeter Verstärkung für jeden Messkanal, um eine optimale Darstellung der Fluoreszenzdaten zu erreichen.

2.2.9. Gel-Elektrophorese

Für die Überprüfung der Restriktionsansätze der Plasmid-Standards sowie der Etablierungsreaktionen für die „real-time“ RT-PCR wurden elektrophoretische Auftrennungen im Agarosegel durchgeführt. Je nach Grad der erforderlichen Auftrennung wurden 1-2% Agarose in 1x TAE-Puffer gegeben und in einer Mikrowelle bis zur Auflösung der Agarose erhitzt. Vor Auftrag der Proben auf das polymerisierte Gel wurden sie mit Probenpuffer (Endkonzentration: Sucrose [40% w/v], Bromphenolblau [0,25% w/v], Xylencyanol FF [0,25% w/v], Orange G2 [0,25% w/v] versetzt. Die Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurde mit einem parallel zu den Proben laufenden Größenstandard durchgeführt (`Smart Ladder´: Eurogentec). Nach Anfärben der Gele mit Ethidiumbromid (0,001% w/v) wurden die DNA-Banden unter UV-Licht bei 302nm sichtbar gemacht und fotografiert.

3. Immunologische Arbeiten

Für die Messung löslicher Zytokine (TNF-beta), Zytokinrezeptoren (sTNF-R1, sTNF-R2, sIL-4R) und Adhäsionsmolekülen (sICAM-1, sVCAM-1) im Serum von MS- Patienten und gesunden Probanden wurden „Sandwich-ELISA“ Systeme der Firmen Biosource Deutschland GmbH (Solingen), Bender MedSystems (Wien, Österreich) und Diaclone (Besancon, Frankreich) verwendet. Die Serum-Proben wurden aliquotiert bei -20°C gelagert und ein wiederholtes Auftauen-Wegfrieren vermieden.

3.1. Prinzip

Ein Sandwich-ELISA benötigt zwei Antikörper, die gegen besondere Epitope des Antigens (Protein) gerichtet sind. Einer dieser Antikörper wird auf die Oberfläche der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert („Coating“ Antikörper). Anschließend wird mittels einer nicht-spezifischen Proteinlösung die Fläche zwischen dem gebundenen ersten Antikörper ausgefüllt, um zu verhindern, dass das zu messende Protein an das Plattenmaterial adsorbiert und damit hohe unspezifische Hintergrundwerte erzeugen würde. Durch Zugabe des zu messenden Proteins sowohl aus dem zu analysierenden Probenmaterial als auch aus dem Standard (rekombinantes Protein) wird der erste Antikörper-Antigen Komplex mit dem „Coating“ Antikörper gebildet. Nach Entfernen von nicht gebundenen Reagenzien (automatischer Washer: Dade Behring ELISA Processor II, Schwalbach) wird der zweite Antikörper („Detecting“ Antikörper“) zugegeben, wodurch das Sandwich vervollständigt wird. Für die nachfolgende kolorimetrische Detektion wird ein Enzym-Konjugat (Peroxidase-Streptavidin) zugefügt. In diesem Fall ist der zweite Antikörper mit Biotin konjugiert (sVCAM-1; sIL-4R; sTNF-R1; sTNF-R2). Alternativ kann der Antikörper aber auch direkt das Enzym tragen (TNF-beta; sICAM-1). Wird anschließend das Enzym-Substrat bestehend aus Tetramethylbenzidin und H2O2 hinzugegeben, kann dadurch das konjugierte Enzym und damit wiederum das zu analysierende Protein durch Messung des Produktes aus der kolorimetrischen Reaktion, nach Abstoppen der Reaktion mit Schwefelsäure, in einem Photometer bei 450nm gegen 620nm (kinetic microplate reader, Molecular Devices GmbH, Deutschland) detektiert werden. Die Intensität der entstehenden Färbung (gelb) ist direkt proportional zur Konzentration des gemessenen Proteins, welche durch die Interpolation auf eine mitgeführte Standardkurve ermittelt wird.

3.2. sIL-4R (Diaclone)

Für die Messung des löslichen IL-4R (sIL4-R) im Serum wurde ein kommerzielles Fertigkit verwendet und nach den Angaben im Herstellerprotokoll durchgeführt. Das Serum wurde 1:4 verdünnt eingesetzt. Bei Fehlen von Serum-Proben wurde auf Plasma-Proben zurückgegriffen, die unverdünnt eingesetzt werden mussten. Die im Plasma ermittelten Proteinkonzentrationen wurden mit dem Faktor 4 multipliziert, um sie den Serum-Werten anzupassen. Die Intra-Assay Präzision (n= 8) lag bei einem CV= 4,4% (755,52 pg/mL ± 33,27), die Inter-Assay Präzision (n= 12) bei einem CV= 7,3% (809,18 pg/mL ± 59,12).

3.3. „ModuleSets®“ (TNF-beta; sICAM-1; sVCAM-1: Bender MedSystems) und „CytoSets®“ (sTNF-R1, sTNF-R2: Biosource)

Bei ModuleSets und CytoSets handelt es sich um einzelne vorgetestete, aufeinander abgestimmte und optimierte Antikörperpaare, Standards und Reagenzien zur kostengünstigen Entwicklung eigener ELISA-Systeme. Die Durchführung beider Testsysteme erfolgte angelehnt an die Angaben in den Herstellerprotokollen.

Für beide Systeme wurden die folgenden Lösungen und Materialien verwendet:

PBS: 8,0g NaCl

1,42g Na2HPO4 · 2H20

0,2g KH2PO4

0,2g KCl

auf 1 Liter mit dest. H20, pH 7,4

„Coating“ Puffer: PBS

„Blocking“ Puffer: PBS + 5,0g/L BSA

„Assay“ Puffer: PBS + 5,0g/L BSA + 1mL/L Tween 20

„Standard Diluent“: PBS + 10,0g/L BSA + 1mL/L Tween 20

„Wash“ Puffer: PBS + 1mL/L Tween 20

„Stop“ Lösung: 4N H2SO4

16 mL H20 + 2mL H2SO4 (95-98%)

TMB + H2O2: TMB Microwell Peroxidase Substrat System, KPL, Gaithersburg, Maryland, USA

„Sample Diluent“: Proteinmatrix in dest. H20 (Bender MedSystems, Wien,

Österreich

Mikrotiterplatten: Nunc-Immuno® Plate MaxiSorp®, Nunc, Dänemark

Um die Matrix der Standards (rekombinante Proteine) an die der untersuchten Serum-Proben anzupassen, wurden die Standards zunächst in „Standard Diluent“ mit 10g/L BSA (CytoSets) bzw. in „Assay“ Puffer mit 5g/L BSA (ModuleSets) entsprechend der in den Herstellerprotokollen angegeben Konzentrationen aufgelöst. Die erforderlichen Verdünnungen für die Standardkurven wurde je nach Protokoll in 100% FKS (TNF-R1; TNF-R2; TNF-beta), „Sample Diluent“ (sICAM-1) bzw. „Assay“ Puffer (sVCAM-1) angesetzt. Die Konzentrationsbereiche der Standardkurven wurden an die erforderlichen Bereiche des jeweiligen Parameters angepasst. Unbekannte Patientenproben, Standards und Kontrollen wurden jeweils in Duplikaten gemessen. Als Kontrolle wurde in allen Tests ein Aliquot eines Serum-Pools mitgemessen. Der Pool wurde aus Blut von mehreren Sepsis Patienten gewonnen, aliquotiert und bei -20°C gelagert.

Die Intra-Assay Präzisionen liegen bei den CytoSets bei einem CV= 2,2% (TNF-R1 [n=10]: Mittelwert ± SD: 1049 pg/mL ± 22,90) und CV= 1,2% (TNF-R2 [n= 10]: 3404,71 pg/mL ± 41,78) und bei den ModuleSets bei einem CV= 13,2% (TNF-beta [n= 9]: 289,56 pg/mL ± 38,30), CV= 6,8% (sICAM-1 [n= 6]: 695ng/mL ± 47,45) und CV= 3,3% (sVCAM-1 [n= 10]: 1039,98 ± 33,85).

Die Inter-Assay Präzisionen liegen bei den CytoSets bei einem CV= 11,3% (TNF-R1 [n=6]: Mittelwert ± SD: 1165,99 pg/mL ± 132,27) und CV= 4,5% (TNF-R2 [n= 8]: 3269,10 pg/mL ± 145,38) und bei den ModuleSets bei einem CV= 10,5% (TNF-beta [n= 9]: 244,99 pg/mL ± 25,77), CV= 21,8% (sICAM-1 [n= 6]: 751,20 ng/mL ± 163,71) und CV= 7,2% (sVCAM-1 [n= 10]: 1034,48 ± 73,97).

4. Statistische Analysen

Die Durchführung der statistischen Analysen erfolgte im Institut für angewandte Statistik Dr. Jörg Schnitker GmbH, Bielefeld.

Für die Analyse der Ergebnisse wurden folgende statistische Verfahren angewendet:

(1) Allgemeine Behandlung von Fehlwerten:

Für die Verlaufsdarstellungen der einzelnen Patienten über die Beobachtungs- bzw. Therapiephase von 12 bzw. 24 Monaten wurden fehlende Untersuchungstermine (Patient ist zum vereinbarten Termin nicht erschienen) gemäß der Methode „Last Observation Carried Forward“ ergänzt. Das bedeutet, dass die aus Labor und Klinik ermittelten Werte des vorherigen Besuches für den jeweils fehlenden Besuchstermin für die Auswertungen herangezogen wurden.

(2) Bei Vergleich von Daten zwischen zwei Gruppen: U-Test

(3) Bewertung der Intragruppentendenzen über den Zeitverlauf: Wilcoxon-Test

(4) Korrelationsanalysen zwischen der Expression der immunologischen Parameter und MS-spezifischer Einflussfaktoren bzw. klinischen Aktivitätsparametern: Spearman-Rang-Test

(5) Prognostische Aussagen der Expression immunologischer Parameter für den weiteren klinischen Verlauf bzw. eine Therapieresponse: logistische Regression

Signifikanzniveau: a=0,05; p-Werte < 0,15 werden als statistisch auffällig diskutiert

IV. ERGEBNISSE

Teil A: Quantitative „Real-Time“ und „On-Line“ RT-PCR

Die folgenden Ergebnisse sind zum größten Teil in BioTechniques (2002) 33: 1078-1089 veröffentlicht (siehe Anhang).

1. Etablierung und Validierung der quantitativen 2-step „Real-Time“ RT-PCR

Für die Analyse der Genexpression von Zytokinen und -rezeptoren aus Leukozyten von MS-Patienten wurde eine quantitative 2-step „real-time“ RT-PCR Methodik entwickelt. Zur Quantifizierung der verschiedenen Targets wurde das LightCyclerÒ System in Verbindung mit dem Sequenz-spezifischen „Hybridization Probe“ -Format und unter Verwendung von importierten externen Plasmid-Standardkurven herangezogen.

1.1. RNA-Isolation und Reproduzierbarkeit der cDNA-Synthese

Die Isolation von hochreiner RNA ist eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung einer erfolgreichen RT-PCR. Gerade wenn eine große Anzahl von Proben bearbeitet werden muss, sollte die Isolationsmethode einfach und verlässlich durchzuführen sein. Aus diesem Grund wurde das „QIAampÒ RNA Blood Mini Kit“ (Qiagen) und das „High Pure RNA Isolation Kit“ (Roche) bezüglich der Qualität und des Ertrags der isolierten Gesamt-RNA und der Anwendbarkeit auf die gegebene „Sprechstundensituation“ (Material und Methoden S. 33) verglichen.

Tab. 2: Reproduzierbarkeit von RNA-Isolation und cDNA-Synthese

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

* „High Pure“ isolierte RNA ist im Photometer nicht detektierbar

Mit dem „QIAamp“ Kit konnten reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei der spektralphotometrischen Messung der Gesamt-RNA Konzentration als auch bei einer PCR Quantifizierung verschiedener Parameter erzielt werden (Tab. 2).

Ausgehend von einer Blutprobe eines MS-Patienten, aus der in 10 unabhängigen Aliquots aufgeteilt eine RNA-Isolation durchgeführt wurde, lag der Variationskoeffizient (CV) für die photometrische Messung (OD260) bei 6,7%. Mittels „High Pure“ Kit isolierte RNA konnte im Photometer aufgrund des geringen anfänglich eingesetzten Blutvolumens (200-500µL) nicht detektiert werden. Bei einer Amplifikation der 10 resultierenden cDNA-Aliquots aus jeder der zuvor eingefrorenen individuellen RNA-Isolationen und anschließender Quantifizierung der absoluten Kopienzahlen anhand der jeweiligen importierten Standardkurve ergaben sich CVs von 25,5 % (Kopienzahl Mittelwert ± SD: 3116 ± 794; CV von CP= 1,3 %) für PBGD, 21 % für IFN-g (5954 ± 1249; CV von CP= 1,1 %) und 18 % für IL-4R (20096 ± 3647; CV von CP= 1,1 %). Eine Quantifizierung von IFN-g aus „High Pure“ isolierter RNA ergab mit einem CV von 75,5 % (810,9 ± 612,6; CV von CP= 3,1 %) sehr große Abweichungen.

1.2. Linearitätsbestimmung der cDNA-Synthese

Die Menge an isolierter Gesamt-RNA aus den Patientenproben variierte aufgrund des individuellen physiologischen Status eines jeden MS-Patienten erheblich. Der Schwankungsbereich lag ca. zwischen 0,2-1,2µg/9,5µL. Eine Quantifizierung geringer RNA-Mengen mittels photometrischer Messung der OD260 ist nicht verlässlich genug, um eine festgelegte Menge (z.B. 1µg) Gesamt-RNA in die cDNA-Synthese Reaktion einsetzen zu können (Kühne, 1997). Das liegt unter anderem daran, dass ein Großteil der Messungen aus dem verlässlichen Extinktionsbereich zwischen 0,1-1,0 (Sauer et al., 1998) herausfallen und nicht genügend Material für Wiederholungsmessungen vorliegt. Daher wurde ein konstantes Volumen (9,5µL) der isolierten Gesamt-RNA pro cDNA-Ansatz verwendet. Um sicherzustellen, dass variierende RNA Mengen die RT-Reaktion nicht beeinflussen, wurde der Linearitätsbereich der cDNA-Synthese in Abhängigkeit vom unterschiedlichen RNA Gehalt und einer unterschiedlichen Stärke der Genexpression der verschiedenen gemessenen Parameter ermittelt. Dafür wurden zwei, den Schwankungsbereich umfassende Gesamt-RNA Isolationen (1,2µg/9,5µL bzw. 0,2µg/9,5µL) 5-fach in seriellen 1:5 Schritten in MS2-RNA (Endkonzentration: 10ng/µL) verdünnt. Unverdünnte und verdünnte RNAs wurden in die cDNA-Synthese eingesetzt und anschließend in der PCR in jeweils 5-fach Bestimmungen für die verschiedenen Parameter amplifiziert. Abb. 12 zeigt exemplarisch Ergebnisse für PBGD, als das für die relative Quantifizierung verwendete „housekeeping“ Gen, für IL-4 als einen Parameter mit einer geringeren Expressionsstärke als PBGD und für IL-4R als einen Parameter mit einer höheren Expressionsstärke im Vergleich zu PBGD. Für die drei Parameter konnte eine lineare Beziehung über mindestens drei log-Stufen hinweg beobachtet werden und zwar sowohl unabhängig von der in die RT-Reaktion eingesetzten RNA-Menge, als auch von der Parameter-abhängigen Expressions-stärke. Eine Linearität bezüglich des RNA-Gehaltes besteht über einen Bereich von ca. 1200ng-8ng/9,5µL für IL-4 bzw. von ca. 1200ng-0,3ng/9,5µL für PBGD und IL-4R. Das Detektionslimit der Gesamt-RNA Konzentration liegt bei ca. 0,8µg/mL für IL-4 bzw. 0,03µg/mL für PBGD und IL-4R. Ein Einfluß der variierenden RNA-Mengen der MS-Patienten auf die mRNA-Quantifizierung kann für den minimalen Bereich von 1,2µg-0,008µg (IL-4) ausgeschlossen werden.

Abb. 12: Lineare Beziehung der cDNA-Synthese in Abhängigkeit vom RNA-Gehalt und der Stärke der Genexpression

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Unverdünnte und serielle 1:5 Verdünnungen (MS2-RNA: 10ng/µL) zwei verschieden konzentrierter RNA-Isolationen von MS-Patienten (1,2µg/9,5µL [ausgefüllte Symbole] bzw. 0,2µg/9,5µL [offene Symbole]) wurden verwendet für die cDNA-Synthese mit anschließender PCR Amplifikation (45 Zyklen) in 5-fach Bestimmung für PBGD (Quadrat) als „housekeeping“ Gen, IL-4 (Dreieck) als Parameter mit einer Genexpressionsstärke < PBGD und IL-4R (Kreis) als Parameter mit einer Genexpressionsstärke > PBGD. Die Kurven wurden ermittelt durch Auftrag der Mittelwerte (n=5) des log der RNA Konzentration [ng/9.5µL] gegen den Mittelwert (n=5) der „Crossing Points“ (CP) und sind in der Form y=mx+b dargestellt. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichungen. Die Regressionskoeffizienten sind in allen Fällen ³ 0,98.

1.3. Allgemeine Optimierungen der PCR Reaktionen

- „Hot Start“ PCR

Im allgemeinen bezeichnet eine „Hot Start“ PCR eine Reaktion, der mindestens ein Reagenz solange vorenthalten wird, bis das Reaktionsgefäß eine Temperatur von 60-80°C erreicht hat (Chou et al., 1992). Damit soll der Bildung von nicht-spezifischen PCR Produkten durch Fehlhybridisierung der Primer und Primer-Dimeren, wie sie bei Raumtemperatur entstehen können, vorgebeugt werden. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass ein „Hot Start“ die Sensitivität und Spezifität der PCR entscheidend verbessern kann (Mullis, 1991; Chou et al., 1992; Kellogg et al., 1994).

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Details

Seiten
195
Jahr
2003
ISBN (eBook)
9783638235105
Dateigröße
4.8 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v19367
Institution / Hochschule
Philipps-Universität Marburg – Fachbereich Biologie
Note
1,0
Schlagworte
Immunmonitoring Patienten Multipler Sklerose Therapie Aufdecken Wirkmechanismen Suche Markern

Autor

  • Benedikte Sabina Kühne (Autor)

    1 Titel veröffentlicht

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Titel: Immunmonitoring bei Patienten mit Multipler Sklerose unter Therapie mit ß-Interferonen - Aufdecken von Wirkmechanismen und Suche nach prognostischen Markern