Lade Inhalt...

Klonierung des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) und Untersuchung der Interaktion mit dem Protein APP in Verbindung mit der Alzheimer Krankheit

Bachelorarbeit 2011 56 Seiten

Medizin - Neurologie, Psychiatrie, Süchte

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Datenblatt

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Alzheimer Erkrankung
1.1.1 Epidemiologie und Pathologie
1.1.2 Genetische Risikofaktoren
1.1.3 Histopathologie und Amyloid-Hypothese
1.2 Amyloid Precursor Protein
1.2.1 Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP
1.3 PICALM
1.3.1 Expressionsmuster und zelluläre Lokalisation von PICALM
1.3.2 Assoziation von PICALM mit AD
1.4 Zielsetzung

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Zelllinien
2.1.2 Bakterienstämme
2.1.3 Kulturmedien
2.1.4 Antibiotika
2.1.5 DNA-Vektoren
2.1.6 Oligonukleotide
2.1.7 Labormaterialien und -chemikalien
2.1.8 Puffer
2.1.9 Kits
2.1.10 Antikörper
2.1.11 DNA- und Proteinstandards
2.1.12 Enzyme
2.1.13 Geräte
2.1.14 Software
2.2 Methoden
2.2.1 Zellkulturmethoden
2.2.2 Proteinmethoden
2.2.3 DNA-Methoden und Klonierung

3 Ergebnisse
3.1 Klonierung und Überexpression von PICALM
3.1.1 Expressionstest C-terminal getagter PICALM-Konstrukte
3.1.2 Klonierung von PICALM
3.1.3 Toxizitätsvergleich N- und C-terminal getagter Konstrukte
3.2 Interaktionstudien von PICALM mit APP
3.2.1 Einfluss der PICALM Überexpression auf endogene APP-Level
3.2.2 Einfluss der APP Überexpression auf endogene PICALM-Level
3.3 Fluoreszenzmikroskopie
3.3.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM
3.3.2 Untersuchung möglicher Kolokalisation von PICALM und APP

4 Diskussion
4.1 Verwendete Zelllinien
4.2 Klonierung und Überexpression von PICALM
4.3 Interaktionstudien von PICALM mit APP
4.4 Fluoreszenzmikroskopie
4.4.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM
4.4.2 Kolokalisationsstudien von PICALM und APP

5 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Eidesstattliche Erklärung

Danksagung

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Alzheimer Erkrankung

1.1.1 Epidemiologie und Pathologie

Die Alzheimer Erkrankung (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung und mit einer Prävalenz von 6-9 % die Hauptursache von Demenz bei Personen über dem 65. Lebensjahr [Bickel, 2000]. In Deutschland leiden über eine Millionen Menschen an der AD, weltweit waren 2005 über 24 Millionen Menschen betroffen [Ferri et al., 2005], bis 2050 wird sich die Zahl wahrscheinlich mehr als vervierfachen [Prince et al., 2009].

Die AD wurde erstmals 1907 vom deutschen Psychiater und Neuropathologen Alois Alzheimer beschrieben [Alzheimer, 1907]. Im Verlauf der Erkrankung kommt es unter anderem zu einer progressiven Verschlechterung des Erinnerungsvermögens, der Orientierung, des Urteilsvermögens sowie der Sprache; zudem leiden viele Betroffene an Depressionen.

Die ersten Alzheimer-typischen Veränderungen im Gehirn entwickeln sich bereits 20-30 Jahre vor den ersten klinischen Symptomen, was eine frühzeitige klinische Diagnose dieser Erkrankung immer noch sehr schwierig macht.

1.1.2 Genetische Risikofaktoren

Grundsätzlich unterscheidet man die familiäre von der sporadischen Form der AD, wobei letztere am häufigsten auftritt. Phänotypisch sind beide jedoch nicht zu unterscheiden.

Bei der familiären, erblichen Form der AD, die bei 5-10 % aller Patienten vorliegt, kommt es bereits vor dem 65. Lebensjahr zum Ausbruch der Krankheit (early-Onset) [Selkoe, 2001]. Bei dieser Form der Erkrankung sind bisher autosomal-dominante Mutationen in drei Genen identifiziert: Amyloid Precursor Protein (APP, Chr. 21), Presenilin 1 (PSEN1, Chr. 14) sowie Presenilin 2 (PSEN2, Chr. 1). Mutationen in diesen Genen führen zur verstärkten Produktion des Peptids Amyloid-beta ^β), insbesondere Aβ42, welches am häufigsten in senilen Plaques vorkommt (siehe 1.2.1) [Hardy, 1997; Selkoe, 2001].

Die meisten Fälle von AD betreffen jedoch Personen über 65 Jahren (late-Onset). Für diese Form ist bisher eine Reihe von genetischen Risikofaktoren bekannt. Als hauptsächlicher genetischer Risikofaktor wurde das Allel ε4 des Apolipoproteins E (ApoE) identifiziert, einem Plasmaprotein, welches in den Cholesterintransport involviert ist [Strittmatter et al., 1993].

In genomweiten Assoziationsstudien wurden weitere Gene identifiziert, welche als Risiko- bzw. protektive Faktoren im Zusammenhang mit AD stehen [Waring et al., 2008] (www.alz.org).

1.1.3 Histopathologie und Amyloid-Hypothese

Im Gehirn von Patienten mit AD treten histopathologisch zwei charakteristische Merkmale auf: Extrazelluläre Senile Plaques sowie intrazelluläre neurofibrilläre Tangles (Abb. 1).

Neurofibrilläre Tangles (NFTs) (Abb. 1B) bestehen aus umeinander gewundenen Filamenten von hyperphosphoryliertem Tau-Protein, einem Mikrotubuli-bindenden Protein. Durch die Hyperphosphorylierung geht die stabilisierende Wirkung auf Mikrotubuli verloren, gleichzeitig kommt es zu einer toxischen Wirkung auf Neurone, indem das patholgische Tau normales Tau sowie andere, Mikrotubuli-stabilisierende Proteine verdrängt und dadurch die Mikrotubulifunktion hemmt [Iqbal et al., 2005]. Hauptbestandteil der senilen Plaques (Abb. 1A) sind unlösbare Aggregate von fehlgefaltetem, 40 bis 42 AS langen Aβ.

In ihrer Amyloid-Kaskaden-Hypothese postulierten Hardy und Higgins 1992, dass die extrazellulären Akkumulationen von Aβ im Gehirn die Hauptursache der AD sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Histopathologische Charakteristika der AD. A Senile Plaques. B Neurofibrilläre Tangles. Modifiziert nach [Armstrong et al., 1996].

Danach resultieren die Bildung von NFTs und der weitere Fortschritt der Krankheit von einem Ungleichgewicht zwischen Aβ-Produktion und -Clearence [Hardy et al., 2002; Hardy et al., 1992]. Um die Hypothese zu beweisen muss jedoch weiter daran gearbeitet werden; solange können durchaus auch andere Hypothesen in Betracht gezogen werden.

1.2 Amyloid Precursor Protein

Das auf Chromosom 21 gelegene APP-Gen codiert für das Amyloid Precursor Protein (Abb. 2A), einem Transmembranprotein mit extrazellulär gelegenem N- und intrazellulärem C-Terminus. APP gehört zu einer konservierten Genfamilie, kommt ubiquitär vor und besitzt einige Charakteristika eines Zelloberflächenrezeptors, denn es kann sowohl extrazelluläre Liganden als auch intrazelluläre Adaptorproteine binden [Kang et al., 1987]. Die genaue biologische Funktion von APP ist jedoch weiterhin unklar. Im Menschen existieren drei Isoformen die durch alternatives Spleißen entstehen, wobei in Neuronen die 695 AS große Form dominiert (Abb. 2B) [Haass et al., 1991; Selkoe, 2001]. APP reift im endoplasmatischen Retikulum (ER) und unterliegt posttranslationaler Modifikation, unter anderem Phosphorylierung und Glykosylierung. Über den sekretorischen Signalweg gelangt es schließlich an die Plasmamembran (Abb. 3B) [Selkoe, 2001]. Durch die ständig stattfindende Proteolyse und den Transport von APP liegt der Großteil des zellulären APPs im Golgi-Apparat respektive Trans-Golgi- Netzwerk (TGN) vor, nur ein kleiner Teil ist an der Plasmamembran lokalisiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: APP. A Kristallstruktur (http://en.wikipedia.org/wiki/Amyloid_precursor_protein) B Isoformen. KPI=Kunitz-Protease-Inhibitor-Domäne. Neugestaltet nach [Fukuchi et al., 1998].

1.2.1 Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP

APP kann auf zwei unterschiedliche Wege prozessiert werden, den amyloidogenen sowie den nicht-amyloidogenen Weg (Abb. 3A).

Der nicht-amyloidogene Signalweg beginnt an der Zelloberfläche mit der Spaltung von APP innerhalb der Aβ-Sequenz durch eine α-Sekretase, wodurch eine Produktion von Aβ verhindert wird [Esch et al., 1990; Sisodia et al., 1990]. Die α-Sekretase zählt zur Familie der A Disintegrin and Metalloproteases (ADAMs) [Allinson et al., 2003] und spaltet APP in das lösliche sekretierte Amyloid Precursor Protein α (sAPPα) sowie das membrangebundene, 83 AS große Carboxy-Terminus-Fragment-α (CTF-α, C83). C83 wird schließlich durch die γ-Sekretase zum nicht-toxischen p3 und der APP- Intrazellulären-Domäne (AICD) weiter prozessiert [Selkoe, 2001].

Für die Prozessierung von APP über den amyloidogenen Weg wird dieses zunächst endocytotisch reinternalisiert und schließlich durch das β-site of APP-cleaving enzyme 1 (BACE1, β-Sekretase, Memapsin 2) in sauren Kompartimenten der Zelle gespalten (Abb. 3B) [Koo et al., 1994; Vassar et al., 1999]. Dabei entstehen das lösliche sekretierte Amyloid Precursor Protein β (sAPPβ) sowie das membrangebundene, 99 AS große Carboxy-Terminus-Fragment-β (CTF-β, C99). Wie C83, so wird auch C99 nachfolgend durch die γ-Sekretase gespalten, was zur Bildung von Aβ und der AICD führt [Selkoe, 2001].

Da die γ-Sekretase, eine Aspartyl-Protease, nur geringe Sequenzspezifität besitzt, kann sie die sAPPs an verschiedenen Stellen im Transmembranbereich spalten, wodurch 40 bis 43 AS lange Aβ-Peptide generiert werden [Selkoe et al., 2007]. Es wird mehr Aβ40 als Aβ42 gebildet, jedoch hat Aβ42 eine stärkere Tendenz zu aggregieren und Fibrillen zu formen, die sich in den senilen Plaques sammeln (Abb. 1) [Kim et al., 2005].

Aufgrund der für die Prozessierung notwendigen zellulären Kolokalisation von APP und BACE1 sind insbesondere Transportprozesse und die beteiligten Proteine von besonderer Wichtigkeit (Abb. 3B). Intrazellulär werden die beiden Proteine durch Clathrin coated vesicles (CCV) über diverse Adaptorproteine (AP) transportiert. Zu den APs zählt unter anderem AP180 [Kim et al., 2000].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP. A Amyloidogene und nicht- amyloidogene APP-Prozessierung (vgl. Text). Modifiziert nach [Tang, 2009]. B Transport von APP und BACE1. Die beiden Proteine besitzen nach Synthese im ER einen ähnlichen sekretorischen Signalweg zur Zelloberfläche (1). Dort angekommen werden sie rasch über Clathrin coated vesicles endocytotisch aufgenommen (2). APP wird entweder zurück zum Golgi-Apparat transportiert oder in endosomalen Kompartimenten durch BACE1 degradiert (amyloidogener Signalweg) und in Form von Aß zurück zur Zelloberfläche transportiert (3). Die nicht-amyloidogene Prozessierung von APP findet durch α-Sekretase an der Zelloberfläche statt. Modifiziert nach [Thinakaran et al., 2008].

1.3 PICALM

Das Phosphatidyl Inositol Clathrin Assembly Lymphoid Myeloid Leukemia Protein (PICALM, auch AP180-2 bzw. CALM) (Abb. 4) wurde zum ersten Mal 1996 identifiziert. Das dafür codierende Gen auf Chromosom 11 war dabei Teil eines Fusionsgens einer seltenen Translokation, beobachtet in Patienten mit Akuter Myeloider Leukämie [Dreyling et al., 1996].

Im Menschen liegen drei Isoformen von PICALM vor: Die 652 AS große Form entspricht der ganzen Länge des Proteins, bei den 632 AS bzw. 610 AS großen Formen handelt es sich um kürzere Varianten, die durch alternatives Spleißen entstehen [Baig et al., 2010]. PICALM ist das Homolog des hirnspezifischen Clathrin-Adaptorproteins AP180 [Tebar et al., 1999]. Daher wird vermutet, dass auch PICALM eine Rolle im Prozess der Clathrin- vermittelten Endocytose (CVE) spielt. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression als auch Depletion von PICALM die Internalisierung des EGF-Rezeptors durch CCV hemmen. Daher ist PICALM wohl am Prozess der Rezeptor-vermittelten-Endocytose beteiligt, vielleicht sogar speziell für Zelloberflächenrezeptoren [Meyerholz et al., 2005; Tebar et al., 1999].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Kristallstruktur von PICALM (http://en.wikipedia.org/wiki/PICALM).

Außerdem wird der endocytotische Transport von VAMP2 (Vesicle-associated membrane protein 2), einem Bestandteil synaptischer Vesikel, ebenfalls entscheidend durch PICALM reguliert. PICALM scheint somit auch am Recycling synaptischer Vesikel durch CVE beteiligt zu sein [Harel et al., 2008].

1.3.1 Expressionsmuster und zelluläre Lokalisation von PICALM

PICALM wird in den meisten humanen Geweben exprimiert [Dreyling et al., 1996]. In hippocampalen Neuronen, Astrocyten und Oligodendrocyten der Ratte als auch in humanem Hirngewebe konnte dessen Expression ebenfalls nachgewiesen werden [Baig et al., 2010; Tebar et al., 1999; Yao et al., 2003]. Im menschlichen Gehirn kommt PICALM außerdem in Endothelzellen vor [Baig et al., 2010].

Betrachtet man die intrazelluläre Lokalisation von überexprimiertem PICALM, so ist dieses eher diffus über den kompletten Zellkörper hinweg verteilt, was in HeLa- bzw. COS-Zellen festgestellt wurde. Dabei scheint es im Bereich des Golgi-Apparats zu akkumulieren, je stärker die Expression ist. Ist diese dagegen schwach zeigt sich umso eher eine punktuelle Verteilung im Cytoplasma [Tebar et al., 1999]. Untersuchungen in Ratten-Neuronen zeigten, dass sich PICALM auch in Neuronen gleichmäßig im Zellkörper, vor allem in endosomalen Kompartimenten verteilt, jedoch kaum in Synapsen anzutreffen ist [Yao et al., 2003]. In Neuronen konnten PICALM auch selektive wachstumsfördernde Eigenschaften zugewiesen werden [Bushlin et al., 2008].

1.3.2 Assoziation von PICALM mit AD

In mehreren genomweiten Assoziationsstudien wurden kürzlich SNPs im PICALM-Locus mit der Alzheimer Erkrankung signifikant assoziiert [Carrasquillo et al., 2010; Harold et al., 2009; Jun et al., 2010; Lambert et al., 2011; Schjeide et al., 2011]. Dazu siehe auch www.alzgene.org.

Nach kombinierter Meta-Analyse (p=2,3*10-11) ist dabei SNP rs541458, der sich 8 kb 5' zum PICALM-Gen befindend [Harold et al., 2009], einer der Signifikantesten (genomweite Signifikanz für p<5*10-8). Schließlich konnte für diesen SNP zum ersten Mal eine Verbindung zwischen Alleldosis und den Leveln von CSF Aß42, einem etablierten AD-Biomarker, gezeigt werden: Mit steigender Zahl des AD-Risikoallels T nehmen die CSF Aß42-Level ab, was somit erste Hinweise liefert, inwieweit AD und PICALM pathogenetisch assoziiert sein könnten [Schjeide et al., 2011].

1.4 Zielsetzung

Die genauen physiologischen bzw. pathophysiologischen Auswirkungen von PICALM, insbesondere auf Mechanismen, welche in die AD involviert sind, sind noch unbekannt. Wie bereits dargestellt ist APP und das daraus gebildete Aß an der Entstehung der AD beteiligt, der Amyloid-Hypothese zufolge sogar kausal [Hardy, 1997]. Da APP für die amyloidogene Prozessierung via CVE internalisiert wird und PICALM an der CVE beteiligt ist, ist durchaus ein Zusammenhang beider Proteine vorstellbar [Koo et al., 1994; Tebar et al., 1999].

Vorrangiges Ziel dieser Arbeit ist es nun, die Interaktion von PICALM mit APP in Verbindung mit der AD zu untersuchen.

Über Klonierung soll zunächst ein Konstrukt geschaffen werden, mit dessen Hilfe eine stabile Überexpression von PICALM sowohl in einer murinen als auch einer humanen Zelllinie durchgeführt werden kann, wodurch Untersuchungen der Funktion und der zellulären Lokalisation des Proteins möglich sind. Ausgehend davon wird schließlich mit Hilfe von Western Blot Analyse und Immuncytochemie der Einfluss von PICALM auf APP untersucht.

Diese Arbeit soll somit ein besseres Verständnis über die Mechanismen ermöglichen, inwieweit PICALM mit der AD im Zusammenhang steht.

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Zelllinien

NEURO-2A-Zellen (N2A): Murine Neuroblastomzellen (DSMZ Nr.: ACC 148)

Die Zelllinie entstand aus einem Spontantumor aus Albino Mäusen des Stammes A und wurde 1967 zum ersten Mal in einer in vitro Kultur etabliert [Olmsted et al., 1970]. Da es sich um extrem schnell wachsende neuronale Zellen handelt, die außerdem sehr widerstandsfähig gegen äußere Einflüsse sind, eignen sie sich gut als einfaches Ersatzmodell für primäre Neurone.

HEK-293-Zellen (HEK): Humane embryonale Nierenzellen (DSMZ Nr.: ACC 305)

Die originale HEK-Zelllinie wurde 1962 zum ersten Mal durch Transformation menschlicher embryonaler Nierenzellen mit dem Virus SV-40 etabliert [Shein et al., 1962]. Durch Transformation mit DNA des humanen Adenovirus 5 wurde daraus die HEK-293-Zelllinie generiert [Graham et al., 1977]. Erst kürzlich wurde gezeigt dass HEK- 293-Zellen bestimmte Neurofilamente (NF) exprimieren, deren Expression charakteristisch für Neuronen in frühen Differenzierungsstadien ist. Demnach besitzen HEK-293-Zellen (im Folgenden als HEK zeichnet) Eigenschaften von neuronalen Vorläuferzellen [Shaw et al., 2002]. Dies und die Tatsache, dass es sich hierbei um humane Zellen handelt, sprechen für ihre Verwendung in der Grundlagenforschung im Rahmen humaner neurodegenerativer Erkrankungen.

2.1.2 Bakterienstämme

Escherichia coli DH5œ Genotyp: F- end A1 hsd R17 (rk-, mk+) sup E44 thi-1 λ - rec A1 gyr A96 rel A1 D (arg F- lac ZYA) U 169 φ80d lacZDM15

2.1.3 Kulturmedien

2.1.3.1 Zellkulturmedien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3.2 Bakterienkulturmedien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.4 Antibiotika

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.5 DNA-Vektoren

2.1.5.1 Plasmid-Expressionsvektoren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.5.2 Konstrukte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.6 Oligonukleotide

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.7 Labormaterialien und -chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.8 Puffer

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.9 Kits

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.10 Antikörper

2.1.10.1 Primärantikörper

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.10.2 Sekundärantikörper

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.11 DNA- und Proteinstandards

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]

Details

Seiten
56
Jahr
2011
ISBN (eBook)
9783656153450
ISBN (Buch)
9783656153641
Dateigröße
2.9 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v190555
Institution / Hochschule
Universität Ulm – Experimentelle Neurologie
Note
1,3
Schlagworte
klonierung phosphatidylinositol picalm untersuchung interaktion protein verbindung alzheimer krankheit

Autor

Teilen

Zurück

Titel: Klonierung des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) und Untersuchung der Interaktion mit dem Protein APP in Verbindung mit der Alzheimer Krankheit