Lade Inhalt...

Der Einsatz der komparativen genomischen Hybridisierung zur Untersuchung genetischer Veränderungen in menschlichen Tumorzellen

Examensarbeit 2002 91 Seiten

Medizin - Neoplasmen, Onkologie

Leseprobe

image 37ee88d390a0908a8c738318263a7526

Inhaltsverzeichnis 3

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. Zankl für die Vergabe dieses interessanten Themas.

Bei Herrn Dr. med. Gerdt Hübner (Westpfalz-Klinikum Kaiserslautern) möchte ich mich für die Bereitstellung der Gewebsproben im Rahmen der ACUP-Studie bedanken.

Ebenso bei Herrn PD Dr. med. Becker (Pathologisches Institut des Westpfalz- für die Überlassung der Paraffinschnitte und die freundliche Hilfestellung.

Mein weiterer Dank gilt den Mitarbeitern am Institut für Humangenetik der Universität Homburg für ihre bereitwillige Unterstützung bei der Auswertung der Experimente.

Ebenso bedanke ich mich bei den Mitarbeitern der Abteilung Ökologie für die Bereitstellung der Geräten zur Kontrolle der DNA-Extraktion.

Bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung Humanbiologie und den Molekularbiologen, die durch ihre freundliche und hilfsbereite Zusammenarbeit diese Arbeit zu einem spannenden Erlebnis machten.

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung mein Studium ermöglichten.

Abkürzungsverzeichnis 7

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin Abb. Abbildung ACUP Adenocarcinom mit unbekanntem Primärtumor AD lat. Aqua destillata (destilliertes Wasser) abs absolut (reinst) AK Antikörper

Bio Biotin BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat bp Basenpaar(e) BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) BT Bikarbonat-Tween bzw. beziehungsweise

C Cytosin °C Grad Celsius ca. circa CCD charge-coupled device cDNA complementary DNA CGH comparative genomic in situ hybridization (Vergleichende genomische in situ Hybridisierung) cm Zentimeter

DAPI 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldichlorid dATP 2’-Desoxyadenosin-5’-triphosphat dCTP 2’-Desoxycytidin-5’-phosphat dGTP 2’-Desoxyguanosin-5’-triphosphat dTTP 2’-Desoxythymidin-5’-triphosphat dUTP 2’-Desoxyuridin-5’-triphosphat dNTP 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat DIG Digoxigenin d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinacid (Desoxiribonukleinsäure) DNAse Desoxyribonuklease-Enzym

EDTA Ethyl-Diamin-Tetraessigsäure EtOH Ethanol et al. “et alia“ (lat.) und andere evtl. eventuell

FAB Fragment antigene binding FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FITC Fluorescein-5-isothiocyanat FKS fötales Kälberserum

G Guanosin G-Banden Giemsa-Banden g Gramm GTP Guanosintriphosphat ggf. gegebenenfalls

h Stunde(n)

homogeneously stained region (einheitlich gefärbte Region) HSR H 2 0 Wasser

Abkürzungsverzeichnis 8

kb Kilobasenpaar(e)

l Liter LOH loss of heterozygosity (Verlust der Heterozygotie)

Mbp Megabasenpaare m milli M molar mM Millimolar ml Milliliter min Minute(n) mm Millimeter mikro = 10 -6 μ Nanogramm = 10 -9 g ng NBT 4-Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid Nr. Nummer

OD optische Dichte OT Objektträger pH „potentia hydrogenii“ (lat.) negativer dekatischer Logarithmus der Hydroxonium-Ionen-Konzentration PHA Phytohämagglutinin PBS phosphate buffered saline (Phosphatpuffer) Ph/Ch Phenol/Chloroform RT Raumtemperatur RNAse Ribonuklease RPMI Roosevelt Park Memorial Institute SDS Sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) sec Sekunde(n) SSC standard saline citrate buffer (Natrium-Citrat-Puffer) T Thymidin Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan TRITC Tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat U Units U/min Umdrehungen pro Minute u.a. unter anderem ÜN über Nacht UV Ultraviolett V Volt v/v Volume per volume Vol. Volumenantei(e) w/v Weight per volume WHO World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation) z.B. zum Beispiel

I. Einleitung und Aufgabenstellung 9

I. Einleitung und Aufgabenstellung

II. Theoretische Grundlagen 10

II. Theoretische Grundlagen

II. Theoretische Grundlagen 11

1.2. Häufigkeit

image 7bd82fa18222bb093934c53c38939835

Tabelle 2.1.: prozentuale Anteile der jährlichen Krebsneuentstehungen

image bb2d587d2d0e61da5e4521044527cd46

Tabelle 2.2.: prozentuale Anteile der jährlichen Krebssterbefälle (Robert Koch Institut, 2001)

II. Theoretische Grundlagen 12

1.3. Stadieneinteilung

Beim TNM-System wird die Tumorausbreitung (Staging) beurteilt:

T steht für die Tumorgröße, wobei T von T1 für kleine Tumoren bis T3 oder T4 für große Tumoren reicht.

N steht für den Lymphknotenbefall; N1 steht für den Befall von Lymphknoten in der nächsten Umgebung des Tumors, N2 und N3 für den Befall weiter entfernter Lymphknoten.

M steht für den Nachweis von Metastasen, also von Tochtergeschwülsten. M1 heißt, dass sich irgendwo im Körper Metastasen gebildet haben.

1.4. Therapie

II. Theoretische Grundlagen 13

1.5.1. Historisches

1.5.2. Mutationsinitiation

II. Theoretische Grundlagen 14

Lungenkrebs je 100 000 Einwohnern bei 5,8, in New Orleans dagegen 110. (DeVita et al., 1993).

Des Weiteren erhöht Rauchen das Risiko der Entstehung von Lungenkrebs bzw. von Krebs der Atmungsorgane bis zum 40-fachen und ist bei ca. 90% dieser Krebsfälle als Hauptursache zu betrachten.

Falsche Ernährung, vor allem zu ballaststoffarme, wird für die Entstehung von Krebs im Magen-Darm-Trakt oder von Prostatakrebs verantwortlich gemacht und Alkohol insgesamt für eine große Anzahl von Krebsarten (Deutsche Krebshilfe, 1999). Weiterhin sind Umweltgifte und ionisierende Strahlung (Radon, Röntgen, Nuklearmedizin) als Auslöser von Krebs zu nennen.

Es erweist sich jedoch als äußerst schwierig die einzelnen Risikofaktoren als solche zu identifizieren, da einige als mutagene Tumorinitiatoren fungieren, die direkt genetische Veränderungen auslösen. Z.B. Karzinogene im Tabakrauch (Hecht, 1997) sowie Aflatoxine auf Erdnüssen (Kobertz et al., 1997). Andere dienen als Tumorpromotoren auf dem Weg zum voll ausgebildeten Krebs. Als Beispiel seien hier die Fortpflanzungshormone der Frau genannt, da Frauen, die in jungen Jahren Kinder zur Welt bringen. Es besteht ein positiver Zusammenhang zwischen einer frühen Schwangerschaft und dem geringeren Risiko an Brustkrebs zu erkranken (Cairns, 1978).

1.5.3. Krebs und psychische Gesichtspunkte

II. Theoretische Grundlagen 15

kämpferischen und positiv aufgelegten Menschen unterscheiden sich nicht von eher resignativen und pessimistisch gesonnenen Personen.

Die Entstehung von Krebs ist daher fast ausschließlich genetisch und/oder durch bestimmte Lebensweisen zu erklären. (siehe Abschnitt 1.5.2) Eine "Krebspersönlichkeit" scheint nicht zu existieren (Schwarz, 1994)..

1.5.4. Onkogene

II. Theoretische Grundlagen 16

Fusionsgen mit funktioneller Aktivierung von ALK durch den NPM-Promotor; Morris et al. 1994). Andererseits kann infolge einer Amplifikation des Genes (Alitaro et al., 1983) eine erhöhte Kopienzahl in der betreffenden Zelle vorliegen und ebenfalls zu einer verstärkten Expression des Genproduktes führen (Collins et James, 1993).

1.5.5. Tumorsuppressorgene

II. Theoretische Grundlagen 17

Tumorsuppressorgene durch Deletionen oder Punktmutationen des genetischen Materials in ihrer Funktion beeinträchtigt. Manche Tumorsuppressorgene sind nur in bestimmten Tumoren betroffen, andere spielen bei der Entstehung verschiedener Neoplasien eine Rolle (z.B. p53 in ca. 40-50 % aller Tumoren; Soussi et al., 1994). Die Bedeutung von Tumorsuppressorgenen bei der Entstehung von hämatologischen Tumoren ist erst in den letzten Jahren verstärkt Gegenstand zytogenetischer Forschung geworden. In einer großen retrospektiven Auswertung von 6422 haematologischen Neoplasien mit einzelnen klonalen Aberrationen (Johansson et al., 1993) wurden alle in diesen Fällen berichteten, zum Verlust genetischen Materials führenden numerischen oder strukturellen chromosomalen Aberrationen aufgeführt und, nach Malignomtyp geordnet, zusammengestellt. Aus der für einzelne Krankheitsbilder spezifischen Häufung solcher Veränderungen in bestimmten Regionen lassen sich Vermutungen auf die Existenz von Genen mit tumorsupprimierenden Eigenschaften in diesen Bereichen ziehen.

1.5.6. Mutatorgene

II. Theoretische Grundlagen 18

2. Methoden der Tumordiagnostik

II. Theoretische Grundlagen 19

Darüber hinaus zeigte sich, dass das am Chromosom 22 fehlende Stück nicht verloren geht, sondern an den langen Arm eines Chromosom 9 transloziert wird. Durch Verfeinerung der Bänderungstechniken wurde so im Laufe der Jahre eine Vielzahl den Menschen betreffende Chromosomenaberrationen entdeckt (Übersicht bei Heim et al., 1995; Mitelman et al., 1997; Passarge, 1998; Buselmaier et al.,1999; Oscier et al., 1999;).

2.1. Tumorassoziierte Chromosomenaberrationen

II. Theoretische Grundlagen 20

Dies betrifft zum Beispiel Amplifikationen von Genen, die für eine Resistenz gegen bestimmte Chemikalien verantwortlich sind. Um so erstaunlicher ist es, dass diese Amplifikationen auch in Tumoren auftraten, die noch nicht chemotherapeutisch behandelt wurden. Dies gilt insbesondere für das kindliche Neuroblastom. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass in der Tumorzelle eine Genamplikation auftreten kann und dass diese gesteigerte Expression der amplifizierten Gene der Tumorzelle einen Wachstumsvorteil sichert. Dadurch wird auch die Hypothese der Amplifikation von zellulären Onkogenen gestärkt (Alitalo et al.,1983; Alitalo und Schwab, 1986; Cooper, 1990).

2.2. Zytogenetische Tumordiagnostik

II. Theoretische Grundlagen 21

II. Theoretische Grundlagen 22

3.1. Funktionsprinzip

II. Theoretische Grundlagen 23

Hybridisierungssignal der Kontroll-DNA dient dabei als interner Standard. Im Gegensatz zur konventionellen FISH sind zur Durchführung der Experimente keine intakten Tumorzellkerne oder Metaphasen nötig, da als Ausgangsmaterial lediglich DNA des zu untersuchenden Gewebes benötigt wird. Des Weiteren werden mittels CGH gleichzeitig sämtliche Chromosomen untersucht, was einen umfassenden Überblick über das Vorhandensein chromosomaler Imbalancen im Tumorgenom in einem einzigen Experiment erlaubt.

Ein Vorteil gegenüber der Bänderungsanalyse ist die genaue Zuordnung vermehrten oder verminderten chromosomalen Materials zu den entsprechenden chromosomalen Regionen. Dies ist bei der Metaphasenanalyse von Tumorzellen mit komplexem Karyotyp und Auftreten von sogenannten “Markerchromosomen”, d.h. aus mehreren Bruchstücken zusammengesetzten Chromosomen, in vielen Fällen nicht zweifelsfrei möglich.

3.2.1. Strukturelle Aussagen

II. Theoretische Grundlagen 24

3.2.2. Problematische Regionen

3.2.3. Auflösungsvermögen

II. Theoretische Grundlagen 25

Im Falle etwaiger Genamplifikationen mit einer großen Anzahl von Kopien des bzw. der amplifizierten Gene steigt das räumliche Auflösungsvermögen weiter an und erlaubt damit im günstigsten Fall die Zuordnung des amplifizierten genetischen Materials zu einer chromosomalen Bande. Von anderen Autoren wurde als Grenze für den Nachweis von Amplifikationen ein Produkt (Größe des Amplikons mal Kopienzahl) von 2 Mb angegeben (Kallioniemi et al., 1994).

3.2.4. Zuordnung chromosomaler Aberrationen

3.2.5. Tumorzellgehalt

II. Theoretische Grundlagen 26

Ein Vorteil der CGH liegt in der gegenüber anderen zytogenetischen Techniken erhöhten Spezifität des Untersuchungsergebnisses begründet. Zur traditionellen zytogenetischen Analyse werden die Tumorzellproben für die Gewinnung von Metaphasen in Zellkulturen vermehrt. Dabei ist aber nicht gewährleistet, dass es während der Kultivierung zu einer Stimulation des tumorigenen Klones kommt oder dass in diesem keine zusätzlichen Aberrationen auftreten. Da die CGH den zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme vorherrschenden Zellklon erfasst, sind Kulturartefakte ausgeschlossen.

III. Material und Methoden 27

III. Material und Methoden

1. Untersuchungsmaterial

1.1. Tiefgefrorenes Gewebe von Humantumoren

Das Tumorgewebe war bei -70 °C in Nährmedium (RPMI 1640 Gibco BRL + 5% DMSO) eingefroren und wurde bis zur weiteren Verwendung darin aufbewahrt. Im Einzelnen handelte es sich um folgende Tumoren bzw. ihre DNA:

image b274aaf734c91db110d3d33e2dea5b53
Name O8.8 M1 M150 O1 M2 N1

Tabelle 3.1.: Übersicht der tiegefrorenen Humantumoren

1.2. Frisches Gewebsmaterial aus der ACUP 2 - Studie

image 6ec83859eb2f700a978f5211c2c6b773

III. Material und Methoden 28

1.3. Paraffiniertes Gewebe von Humantumoren

image 2d846e2a63f4416598b9c398bac5181f

Tabelle 3.3.: Übersicht über die paraffinierten Gewebsproben

1.4 Humanes Vollblut

Zur Herstellung von Metaphasenpräparaten und zur Isolierung humaner Kontroll- wurde venöses Blut einer gesunden männlichen Person (der Autor) gewonnen. Dieses wurde mit einem heparinisiertem Röhrchen aufgefangen und anschließend sofort weiterverarbeitet.

III. Material und Methoden 29

2. Chromosomenpräparation

Materialien und Reagenzien

Blutentnahmeröhrchen: 12 ml (Greiner Labortechnik)

Heparinlösung: 2 ml Liquemin zu 8 ml isotonischer NaCl-Lösung

Liquemin (Rohe AG) Wirkstoff: Heparin Natrium, 0,5 ml = 5000 I.E.

Zentrifugenröhrchen: Glas, 15 ml

Töpfchen: Plastik 50 ml

Objektträger: 76 x 26 mm (Roth, keine Superfrost beschichteten Objektträger)

Nährmedium: RPMI 1640 (Gibco BRL)

Colcemidlösung: 10 μg/ml (Serva)

0,075 M KCl: auf 37 °C vorgewärmt

Fixans: Methanol/Eisessig (3 Vol./1 Vol.), eisgekühlt

Phytohämagglutinin: steril (Gibco BRL)

Brutschrank: bei 37 °C, 5 % CO 2 -angereichert, 30 % Luftfeuchte

Durchführung:

A) Vorbereitung und Anreicherung der Metaphasen

1. Entnahme von 2-10 ml Venenblut in ein steriles, mit 0,3 ml Heparinlösung benetztes Blutentnahmeröhrchen 2. zuerst 8 ml Nährmedium in Behälter pipettieren, dann 0,2 ml Phytohämagglutinin hizufügen und dazu 0,8 ml humanes Vollblutt geben

III. Material und Methoden 30

3. Behälter vorsichtig schwenken und Deckel schließen (nicht vollständig, um Gasaustausch zu ermöglichen) 4. Behälter für insgesamt 71 Stunden im Brutschrank inkubieren 5. Zugabe von 0,2 ml Colcemid-Lösung nach der 69. Stunde und Reinkubation 6. Dekantieren des Behälters in ein Zentrifugenspitzröhrchen und bei 1000 U/min 10 min zentrifugieren. 7. Überstand bis zum Röhrchenknick absaugen und verwerfen 8. Hypotoniebehandlung: vorsichtiges Resuspendieren des Sedimentes in ca. 5 ml 0,0375 M KCl-Lösung anschließend Inkubation bei 37 °C für 20 Min. 9. 10 min bei 1000 U/min zentrifugieren

10. Absaugen der KCl-Lösung und vorsichtige! Resuspension mit frischem, eisgekühltem Fixans; mit weiterem Fixans auf ca. 5 ml auffüllen 11. mindestens 30 min Einwirkdauer im Kühlschrank (Röhrchen verschließen) 12. 10 min bei 1000 U/min zentrifugieren 13. Waschschritt: Überstand bis Röhrchenknick abziehen, durch frisches Fixans ersetzen und 10 min bei 1000U/min zentrifugieren

diesen Schritt wiederholen bis Sedimentfarbe weiß erscheint (2-4mal) 14. Überstand absaugen und so viel Fixans zugeben bis optimale Metaphasendichte erreicht ist (ca. 2-3ml, im Phasenkrontrast-Mikroskop prüfen) 15. Die verschlossenen Zentrifugenröhrchen bis zur endgültigen Verwendung bei -20 °C lagern

B) Präparation der Objekträger

1. Objektträger durch kurzes Einstellen in Küvette mit destilliertem Wasser benetzen 2. 3 - 7 Tropfen der Zellsuspension aus ca. 40 cm Höhe auf Objektträger auftropfen 3. Objektträger kurz abtropfen lassen und sofort auf Heizplatte (60°C) trocknen 4. Methaphasendichte und Qualität im Umkehrphasenmikroskop kontrollieren 5. Objektträger bis zum Gebrauch bei -20 °C einfrieren oder bei 4 °C im Exsikator aufbewahren

III. Material und Methoden 31

3. Isolation genomischer DNA

III. Material und Methoden 32

3.1. Isolation genomische DNA aus Tumorgewebe

mittels Phenol/Chloroform Extraktion

Materialien und Reagenzien

Mörser und Stößel sowie flüssiger Stickstoff

Alternativ: Skalpell und Petrischale

Kunststoff-Transfer-Pipette (5 ml)

Zentrifugenröhrchen: 15 ml (Sarstedt)

Details

Seiten
91
Jahr
2002
ISBN (eBook)
9783656998853
ISBN (Buch)
9783867468848
Dateigröße
13.6 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v186130
Institution / Hochschule
Technische Universität Kaiserslautern
Note
1.3
Schlagworte
einsatz hybridisierung untersuchung veränderungen tumorzellen

Autor

Teilen

Zurück

Titel: Der Einsatz der komparativen genomischen Hybridisierung zur Untersuchung genetischer Veränderungen in menschlichen Tumorzellen