Zur Genauigkeit der Lokalisierung immobiler und mobiler submikroskopischer Partikel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildanalyse

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG

2 DAS KONFOKALE LASER-SCANNNING-MIKROSKOP (CLSM)
2.1 DER AUFBAU DES MIKROSKOPES UND DAS KONFOKALE PRINZIP
2.2 DIE BILDAUFNAHME
2.3 DIE PUNKTÜBERTRAGUNGSFUNKTION DES CLSM
2.3.1 Die laterale Intensit ä tsverteilung
2.3.2 Die axiale Intensit ä tsverteilung
2.3.3 Die N ä herung durch eine Gau ß -Funktion

3 THEORIE
3.1 RAUSCHANALYSE DER BILDER
3.1.1 Die Rauschquellen
3.1.1.1 Das Photonenrauschen
3.1.1.2 Das Rauschen der Sekundärelektronen
3.1.1.3 Der Dunkelstrom des Photomultipliers
3.1.1.4 Das Elektronikrauschen
3.1.2 Das Signal-Rausch-Verh ä ltnis
3.1.3 Das vereinfachte Rauschmodell
3.2 NANOLOKALISIERUNG IMMOBILER SUBMIKROSKOPISCHER PARTIKEL
3.2.1 Die Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit
3.2.2 Definition der Fehlergrenzen f ü r die Fitparameter
3.2.3 Die Fehler in den Parametern
3.2.4 Der dreidimensionale Fitproze ß

4 EXPERIMENTELLE METHODEN UND ERGEBNISSE
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER PROBEN
4.2 MESSUNG DER PUNKTÜBERTRAGUNGSFUNKTION
4.2.1 Laterale Aufl ö sung
4.2.2 Axiale Aufl ö sung
4.3 RAUSCHANALYSE
4.3.1 Bildaufnahme und -analyse
4.3.2 Bestimmung der Rauschzahl in Abh ä ngigkeit der PMT-Spannung
4.3.3 Messung der Rauschzahl in Abh ä ngigkeit von der Mittelungszahl
4.4 NANOLOKALISIERUNG IMMOBILER SUBMIKROSKOPISCHER PARTIKEL
4.4.1 Eindimensionale Messungen
4.4.2 Dreidimensionale Messungen
4.4.3 Vergleich der Theorie mit den Messungen an immobilen Partikeln
4.5 NANOLOKALISIERUNG MOBILER SUBMIKROSKOPISCHER PARTIKEL
4.5.1 Aufnahmegeschwindigkeiten
4.5.2 Eindimensionale Messungen
4.5.3 Dreidimensionale Messungen
4.5.4 Vergleich der gemessenen Diffusionskoeffizienten mit theoretischen Werten

5 DISKUSSION
5.1 RAUSCHANALYSE DER BILDER
5.2 LOKALISIERUNG SUBMIKROSKOPISCHER PARTIKEL
5.2.1 Abweichung zwischenTheorie und Experiment
5.2.2 Auswirkung des Brechungsindex auf die axiale Lokalisierung
5.2.3 Grenzen f ü r die Nanolokalisierung von mobilen Partikeln

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

7 LITERATURVERZEICHNIS

1 Einleitung

Eine zentrale Aufgabe der Biophysik ist die Aufklärung der Struktur und Funktion von komplexen biologischen Systemen, wie z.B. Zellen und deren Kompartimente. Dabei ist die Untersuchung der Zellkernarchitektur und -funktion gegenwärtig von besonderem Interesse. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß der Zellkern ein geordnetes System ist. In bestimmten Zellzyklen nehmen z.B. die Chromosomen definierte Orte ein und eine Vielzahl von intranukleären Domänen lassen sich ausmachen. Zudem gibt es einen intranukleären Transport von Molekülen und der Kern selbst weist bei Replikations- und Transkriptionsvorgängen eine hohe Dynamik auf. Der genaue interne Aufbau des Zellkerns ist jedoch weitgehend unbekannt [Cremer et al., 1993; Marshall et al., 1997;Abney et al. 1997]. Die wichtigste Funktion des Zellkerns ist die Übermittlung von genetischer Information an die proteinsynthetisierenden Kompartimente des Zytoplasmas. Dazu werden DNA-Abschnitte abgelesen und in Ribonukleinsäure- Moleküle umgewandelt. Diese werden ins Zytoplasma abgegeben und gelangen an die entsprechenden Orte der Proteinsynthese. Zudem wird eine Vielzahl von Proteinen, die eine Kernlokalisationssequenz (NLS) besitzen, vom Zytoplasma in den Kern transportiert. Innerhalb des Kerns müssen diese Proteine dann an den Ort der Wirkung gelangen.

Betrachtet man den Transport eines Proteins vom Zytoplasma an seinen Wirkungsort im Kern, so läßt sich dieser Vorgang in zwei Schritte unterteilen. Zunächst erfolgt die Translokation der Moleküle über die Kernhülle durch die Kernporen. Diese hochmolekulare zylindrische Proteinstruktur (125 MD, 120 x 60 nm; Reichelt et al., 1990; Pante und Aebi, 1996) erlaubt eine hochspezifische Regulation des Transportes. Moleküle mit einer Größe von 8-20 nm werden ausschließlich aktiv transportiert, d.h. unter Energieverbrauch. Dazu muß das Molekül die entsprechende NLS aufweisen. Der genaue molekulare Ablauf dieses Transportvorganges ist noch unbekannt. Kleinere Moleküle werden passiv, d.h. durch einfache Diffusion, von den Kernporen translokiert [Melchior und Gerace, 1995; Görlich, 1997]. Anschließend erfolgt der Transport von der Kernhülle zum entsprechenden Wirkungsort des Moleküls. Auch die Funktonsweise dieses intranukleären Transportes ist noch unbekannt. Je nach Protein kann dieser Vorgang natürlich auch in umgekehrter Richtung ablaufen.

Die Aufklärung dieser Transportmechanismen, die eng mit der submikroskopischen dreidimensionalen Struktur des Zellkerns verknüpft sind, sind von hohem physiologischen Interesse und Gegenstand aktueller Forschung.

Eine der effektivsten Möglichkeiten, die genauen Transportmechanismen zu untersuchen, besteht darin, die Trajektorien einzelner Moleküle und Partikel während des Transportes in lebenden Zellen direkt zu visualisieren und quantitativ auszuwerten [Gosh und Webb, 1994; Schmidt et al, 1995; Schütz et al. 1997; Saxton, 1997]. Dies erfordert Untersuchungsmethoden, die keinen Einfluß auf die Struktur und Funktion einer Zelle haben, aber dennoch in der Lage sind , diese real abzubilden und zu analysieren. Das konfokale-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) stellt eine solche nichtinvasive Technik dar, die es erlaubt dreidimensionale, komplexe biologische Proben in vielfältiger Weise, auch mit realer dreidimensionaler Auflösung, abzubilden und zu analysieren.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die Möglichkeiten eines konventionellen CLSM im Hinblick auf die Detektion von Trajektorien mobiler submikroskopischer Partikel und Moleküle zu definieren.

Die Größe der betrachteten Moleküle und Partikel liegt deutlich unterhalb der Wellenlänge des Lichtes. Das Bild der submikroskopischen Teilchen ist daher eine Airy- Scheibe mit einem Radius von ca. 200 nm, je nach Apertur des Objektivs. Dadurch ist das Auflösungsvermögen des Mikroskopes begrenzt, d.h. Strukturen, die näher zusammenliegen als der Radius der Airy-Scheibe können nicht mehr getrennt dargestellt werden.

In dieser Arbeit wird nun die Tatsache ausgenutzt, daß die Position des Zentrum einer einzelnen Airy-Scheibe - und damit die Position des abgebildeten Partikels - mit einer Genauigkeit lokalisiert werden kann, die weit unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskopes liegen kann. Die Position des Zentrums wird dabei durch einen Fitprozeß bestimmt. Anhand einer statistischen Analyse dieser Fit-Methode wird ein theoretisches Modell entwickelt, das Voraussagen über die Lokalisierungsgenauigkeit des Zentrums erlaubt. Dabei zeigt sich, daß die theoretische Lokalisierungsgenauigkeit nicht nur von den gewählten Aufnahmeparametern (z.B. Objektiv und Bildfeldgröße), sondern maßgeblich vom erzielbaren Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) der Bilder anhängt.

Daher wird ein Überblick über die vorhandenen Rauschquellen des verwendeten Mikroskopes gegeben und ein Modell entwickelt, das eine genaue Definition des SRV zuläßt. Diese Methode wird durch entsprechende Messungen des Rauschens ergänzt und überprüft.

Anhand von immobilen submikroskopischen Partikeln wird anschließend die Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit vom SRV gemessen und mit den theoretischen Daten verglichen. Dabei zeigt sich, daß hohe SRV eine Lokalisierung bis auf weniger als ± 5 nm erlauben, dies wird hier als Nanolokalisierung bezeichnet. Begrenzt wird die experimentelle Genauigkeit vom erzielbaren SRV und der Stabilität des Meßsystems. Die Methoden der Lokalisierung immobiler Partikel werden anschließend auf einzelne mobile Partikel angewendet. Die Detektion einer Teilchentrajektorie erfolgt dabei durch eine Abfolge von einzelnen Aufnahmen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. In jeder einzelnen Aufnahme wird dann wiederum die Position des Teilchens mit großer Genauigkeit bestimmt. Die Messungen erreichen dabei eine zeitliche Auflösung bis zu 1 ms.

Die hohe räumliche und zeitliche Auflösung ermöglicht eine sehr genaue Analyse von Teilchentrajektorien. Als Beispiel werden im Rahmen dieser Arbeit die ein- und dreidimensionalen Teilchentrajektorien von einzelnen diffundierenden submikroskopischen Partikeln in Wasser und Glycerin bestimmt. Aus den ermittelten Positionen der Partikel in den einzelnen Aufnahmen wird das mittlere Abstandsquadrat ermittelt. Dies ermöglicht die Berechnung des Diffusionskoeffizienten.

Der Vorteil der Trajektorienaufnahme einzelner Partikel liegt darin, daß diese Methode unabhängig von der Art der Bewegung des Teilchens ist. Es lassen sich, wie in dieser Arbeit, einfache Diffusionsbewegungen aber letztlich auch gerichtete Transportabläufe oder komplexe zusammengesetzte Bewegungen analysieren. Daher ist diese Methode besonders zur Untersuchung der Transportvorgänge innerhalb einer Zelle geeignet.

2 Das konfokale Laser-Scannning-Mikroskop (CLSM)

Die in dieser Arbeit durchgeführten Messungen basieren auf einer speziellen lichtmikroskopischen Technik, der sogenannten konfokalen Laser-Scanning- Mikroskopie. Mit dieser Technik ist es möglich, eine reale dreidimensionale Abbildung einer Präparatstruktur zu erhalten, ohne in dessen Topographie einzugreifen. Darüber hinaus bietet das CLSM die Möglichkeit, die Kinetik von mikroskopischen Proben im Millisekundenbereich zu untersuchen. Vor allem Untersuchungen an biologischen und medizinischen Präparaten profitieren von dieser nichtinvasiven Mikroskopie-Technik. Zum besseren Verständnis der nachfolgenden Kapitel erfolgt deshalb zunächst eine kurze Einführung in die Funktionsweise und den Aufbau eines CLSM.

2.1 Der Aufbau des Mikroskopes und das konfokale Prinzip

In einem Mikroskop werden nur diejenigen Präparatstrukturen durch das Objektiv scharf abgebildet, die sich in der Objektebene befinden. Das Bild eines konventionellen Mikroskopes enthält allerdings einen hohen Streulichtanteil aus Ebenen ober- und unterhalb der Objektebene. Es ist daher nicht möglich, eine optimal kontrastreiche Abbildung der Objektebene zu erzielen. Das Prinzip der konfokalen Abbildung besteht darin, dieses Streulicht drastisch zu reduzieren. Dies wird durch eine spezielle Detektionslochblende und die punktförmige Beleuchtung des Präparates ermöglicht.

Abbildung 2.1.1 zeigt den schematischen Aufbau eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskopes. Die Lichtquelle ist ein Laser, der über eine Glasfaser in das Mikroskop eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird von einem Strahlteilerspiegel auf die Scannerspiegel reflektiert und vom Objektiv beugungsbegrenzt auf die Probe fokussiert. Das von der Probe emittierte Licht wird vom Objektiv gesammelt und gelangt über die Scannerspiegel wiederum auf den Strahlteiler. Das vom Strahlteiler transmittierte Licht gelangt durch die Detektionslochblende auf einen Photomultiplier. Die Detektionslochblende und die Objektebene liegen dabei in optisch konjugierten Ebenen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1.1 Schematischer Aufbau eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (Leica TCS).

Entscheidend an diesem Strahlengang ist, daß Licht aus der Objektebene auf die Detektionslochblende fokussiert wird und zum Photomultiplier gelangt, wohingegen das Streulicht aus anderen Ebenen entweder vor oder hinter die Detektionslochblende fokussiert wird. Dadurch wird das Licht dieser sonst unscharf abgebildeten Ebenen, je nach Größe der Blende, weitgehend ausgeblendet. Somit ist man in der Lage, jeweils einzelne Ebenen scharf aus einem Präparat abzubilden und sogenannte „optische Schnitte“ anzufertigen.

Prinzipiell gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten, Strukturen in einem Präparat mittels eines CLSM sichtbar zu machen. Zum einen kann man im Reflexionsmodus arbeiten und das von der Probe reflektierte Licht nachweisen. Als Strahlteiler wird dann ein Neutralfilter eingesetzt. Zum anderen kann man Präparate mit Fluoreszenzmolekülen markieren und das emittierte Fluoreszenzlicht detektieren. Als Strahlteiler benötigt man dann einen dichromatischen Spiegel, der das anregende Laserlicht reflektiert und das langwelligere Fluoreszenzlicht zur Detektionseinheit transmittiert. Diese Methode wird häufig in der Zellbiologie verwendet, um mittels Immunfluoreszenzfärbung selektiv Strukturen sichtbar zu machen. Im Rahmen dieser Arbeit wird das Mikroskop ausschließlich im Fluoreszenzmodus betrieben.

2.2 Die Bildaufnahme

Die punktförmige Beleuchtung des Objektes wird durch das Abrastern der Probe mit einem beugungsbegrenzten Laserspot realisiert. Im sogenannten x-y- Modus wird der Laserstrahl durch die Scannerspiegel zeilenweise senkrecht zur optischen Achse in der x-y- Ebene über die Probe geführt. Abbildung 2.2.1 verdeutlicht das Vorgehen. Jeder Objektpunkt wird beim Abrastern für ein definiertes Meßzeitintervall τ beleuchtet. Die von einem Objektpunkt emittierte Fluoreszenzintensität wird simultan vom Photomultiplier detektiert und über einen 8-Bit Analog-Digital-Wandler als Grauwert in den Bildspeicher eines Computers geschrieben. Die Intensität in einem Pixel des digitalisierten Bildes ist dabei idealerweise proportional zur Fluoreszenzintensität des Objektpunktes.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2.1 Um ein Bild des gesamten Objekts zu erzeugen, wird der Laserfokus durch eine entsprechende Steuerung der Scannerspiegel zeilen- weise in der x-y- Ebene über die Probe bewegt. Wahlweise kann dafür der unidirektionale oder der bidirektionale Modus gewählt werden.

Im unidirektionalen x-y- Modus erfolgt die Datenaufnahme, d.h. die Detektion des Fluoreszenzlichts, lediglich während der Bewegung des Laserspots von links nach rechts. Im bidirektionalen Modus erfolgt die Datenaufnahme auch in der entgegengesetzten Richtung. Dadurch halbiert sich die Aufnahmezeit für ein x-y- Bild. Zusätzlich zu dieser zweidimensionalen Bildaufnahme lassen sich dreidimensionale Schnittserien anfertigen. Dabei wird eine Serie von x-y- Bildern aufgenommen, wobei nach jedem Bild die Probe entlang der optischen Achse (z -Richtung) verschoben wird.

Das Verschieben der Probe um definierte Abstände wird durch ein Piezo-Element realisiert. Auf diese Weise gewonnene Bildstapel geben dabei nicht nur einen visuellen Eindruck von der dreidimensionalen Struktur des Präparates. Durch die reale dreidimensionale Auflösung lassen sich sogar Positions- und Abstandsmessungen in drei Raumrichtungen durchführen.

Durch das Verschieben der Probe in axialer Richtung lassen sich im x-z -Modus senkrechte Schnitte entlang der optischen Achse anfertigen. Der Laserstrahl rastert dabei über eine einzelne Linie in der x-y- Ebene und das Piezo-Element bewegt die Probe schrittweise in axialer Richtung.

Eine weitere Aufnahmetechnik bietet der x-t- Modus. Hier wird nur eine Linie in x- Richtung abgerastert, ohne die axiale Position der Probe zu variieren. Das resultierende Bild stellt eine Folge von Aufnahmen derselben Objektlinie zu unterschiedlichen Zeiten dar. Die y- Richtung im Bild bildet somit die Zeitachse. Abbildung 2.2.2 verdeutlicht das Vorgehen schematisch.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2.2 Prinzip des x-t - Modus. Der Laserstrahl rastert Bewegung des Laserfokus entlang einer Linie in x - Richtung, wobei die axiale Position der Probe nicht variiert wird. Eine Richtung des Bildes wird somit zur Zeitachse. Probe zwischen

Zur Reduktion des Rauschens in den Bildern läßt sich zusätzlich eine Zeilenmittelung durchführen. Dabei wird eine Zeile M -mal gerastert und für jedes Pixel wird der Mittelwert über die M gemessenen Intensitätswerte gebildet. Die Aufnahmezeit für ein Bild erhöht sich dadurch dementsprechend um den Faktor M.

Die Aufnahme von drei-, zwei- oder eindimensionalen Bildern in definierten Zeitabständen bietet eine Möglichkeit, die Kinetik von Präparaten zu untersuchen. Beispielsweise lassen sich intrazelluläre Diffusions- und gerichtete Transportvorgänge untersuchen. Dazu können einerseits Konzentrationsveränderungen an einer Gesamtheit von fluoreszenzmarkierten Ionen oder Proteinen beobachtet werden. Andererseits lassen sich aber auch Bewegungen einzelner fluoreszenzmarkierter Partikel beobachten.

2.3 Die Punktübertragungsfunktion des CLSM

Informationen über die Position eines Teilchens sind in dem Signal enthalten, das vom Mikroskop bei der Abbildung erzeugt wird. Die Lokalisierung eines Teilchens erfordert somit die Möglichkeit, die Position des Teilchens mit der Position des Signals in geeigneter Weise zu verbinden und diese möglichst genau zu lokalisieren. Die Beobachtung einzelner Teilchen erfolgt hier ausschließlich an submikroskopischen Partikeln. Das bedeutet, daß die Größe der Partikel weit unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskops liegt (ca. 200 nm lateral und 600 nm axial). Diese Partikel werden daher als punktförmige Lichtquellen betrachtet. Die Abbildung einer punktförmigen Lichtquelle mit einem CLSM ergibt die dreidimensionale Punktabbildungsfunktion (P oint- S pread- F unction, PSF) des Mikroskops.

Der folgende Abschnitt beschäftigt sich mit der Form der Signale, die von solchen submikroskopischen Partikeln bei der Abbildung durch das Mikroskop zu erwarten sind.

2.3.1 Die laterale Intensitätsverteilung der Signale

Im konfokalen Mikroskop wird die Probe mit einem beugungsbegrenzten Laserspot beleuchtet. Die Intensitätsverteilung I (ν ) der Beleuchtung in der Objektebene ist dann in der paraxialen Näherung gegeben durch [Wilson und Sheppard, 1984]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

J 1 ist die Bessel-Funktion 1. Art und 1. Ordnung. Die normierte optische Koordinate ν ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

wobei n sinα die numerische Apertur (NA) der Linse (Objektiv), λ die Wellenlänge und r der laterale Abstand von der optischen Achse ist.

Die Intensitätsverteilung der Beleuchtung in der Probe stellt dabei die Wahrscheinlichkeit dar, mit der Fluoreszenzmoleküle in der Probe angeregt werden. Die Abbildung des emittierten Fluoreszenzlichtes erfolgt durch dasselbe Objektiv. Vernachlässigt man die etwas größere Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes, dann ist die

Abbildungsfunktion identisch mit der Beleuchtungsfunktion. Sie stellt in diesem Fall die Wahrscheinlichkeit dar, daß ein Photon aus der Probe auf den Detektor gelangt. Die gesamte konfokale Punktübertragungsfunktion ist demnach durch das Produkt der Beleuchtungsfunktion mit der Abbildungsfunktion gegeben [Wilson und Sheppard, 1984]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3.1 zeigt die normierte Beleuchtungs- bzw. Abbildungsfunktion und die PSF des konfokalen Mikroskops in lateraler Richtung.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3.1 Laterales Intensitätsprofil der Beleuchtungsfunktion und der Punktabbildungsfunktion eines CLSM für NA=1.4 und λ=500 nm.

Der Kurvenverlauf macht deutlich, daß durch die Quadrierung der Beleuchtungsfunktion die Halbwertsbreite des Hauptmaximums kleiner wird. Zudem werden die Nebenmaxima stark unterdrückt.

2.3.2 Die axiale Intensitätsverteilung

Analog dazu läßt sich die PSF des konfokalen Mikroskops entlang der optischen Achse darstellen durch [Wilson und Sheppard, 1984]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die normalisierte optische Koordinate u ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dabei ist z der Abstand von der Brennweite f in axialer Richtung. Abbildung 2.3.2 zeigt die Intensitätsverteilung der axialen PSF.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3.2 Axiales Intensitätsprofil der Beleuchtungsfunktion und der Punktübertragungsfunktion eines CLSM für NA=1.4 und λ=500 nm.

Die konfokale PSF in der paraxialen Näherung weist sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung ein Hauptmaximum mit sehr schwachen Nebenmaxima auf und ist jeweils symmetrisch zum Mittelpunkt. Die Auflösung des Mikroskops ist durch die

Halbwertsbreite (F ull- W idth-at- H alf- M aximum, FWHM) des Maximums gegeben. Die axiale Halbwertsbreite ist ca. 2-3 mal größer als die laterale.

Aufgrund der Symmetrie der PSF ist die Position des Hauptmaximums mit der Position des abgebildeten submikroskopischen Partikels identisch. Die Lokalisierung eines submikroskopischen Partikels läuft also auf die Bestimmung der Position des Maximums der PSF hinaus.

2.3.3 Die Näherung durch eine Gauß-Funktion

Die entscheidenden Eigenschaften der Punktübertragungsfunktion sind die Amplitude, die Breite FWHM und die Position des Hauptmaximums. Die Form des Hauptmaximums der PSF ermöglicht eine Vereinfachung zur Bestimmung dieser Parameter. Die Abbildungen 2.3.1 und 2.3.2 zeigen jeweils den Fit einer Gauß-Funktion an das laterale und axiale Intensitätsprofil der PSF. Die gesamte dreidimensionale PSF kann mit einer dreidimensionalen Gauß-Funktion gefittet werden. Diese ist in kartesischen Koordinaten gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

wobei A die Amplitude der Gauß-Funktion ist und x, y und z die Positionen des Maximums in den jeweiligen Koordinatenrichtungen. Die Breite der Gauß-Funktion in lateraler und axialer Richtung ist durch σ xy und σ z gegeben.

Die Abbildungen verdeutlichen die gute Übereinstimmung des Hauptmaximums der PSF mit der Gauß-Funktion. Die Position des Hauptmaximums der Gauß-Funktion weicht weniger als 10− % von der PSF ab. Die Abweichung der Amplitude und der Halbwertsbreite von den entsprechenden Werten der Punktübertragungsfunktion beträgt 0.1 %. Die sehr schwachen Nebenmaxima, die für die Lokalisierung unwichtig sind, können natürlich nicht wiedergegeben werden.

Im folgenden wird aufgrund der sehr guten Übereinstimmung der beiden Funktionen ausschließlich die Gauß-Funktion zur Untersuchung der detektierten Signale von submikroskopischen Partikeln verwendet. Dies ermöglicht eine einfachere und effizientere Analyse der zu untersuchenden Daten.

3 Theorie

3.1 Rauschanalyse der Bilder

Die Bildentstehung im CLSM beruht auf der Detektion von Photonen, die von der Probe emittiert werden. Der detektierte Photonenstrom wird im Photomultipliers (PMT) in einen dazu proportionalen Photostrom umgewandelt. Dieser Photostrom wird anschließend im digitalisierten Bild als Intensitätswert dargestellt. Wie jede physikalische Messung ist die Bestimmung dieser Intensitäten mit einem gewissen Maß an Schwankungen verbunden. Das bedeutet, daß sich bei wiederholter Messung eines Photonenstroms, der im zeitlichen Mittel konstant ist, unterschiedliche Werte ergeben. Dadurch unterliegt die dem Photonenstrom entsprechende Intensität im Bild ebenfalls Schwankungen.

Dieses sogenannte Rauschen hat einen entscheidenden Einfluß auf die Messung der Punktübertragungsfunktion und damit auf die Qualität der aufgenommenen Bilder. Die erzielte Bildqualität beeinflußt entscheidend die Bestimmung der Parameter der PSF, insbesondere die Position x des Hauptmaximums.

Ein quantitatives Maß zur Beschreibung der Bildqualität ist das S ignal- R ausch- V erhältnis (SRV). Das SRV bildet die zentrale Größe bei der Analyse der Lokalisierungsgenauigkeit von beugungsbegrenzten Signalen mit dem CLSM. Somit ist es zunächst erforderlich, eine genaue Definition des SRV einzuführen. Zudem wird eine geeignete Methode zur Messung des SRV benötigt.

In diesem Kapitel wird deshalb ein Überblick über die Ursachen des Rauschens in den digitalisierten Bildern gegeben. Anschließend wird eine relativ einfache Formel entwickelt, die es erlaubt, mittels grundlegender Bildanalyse das SRV in einem Bild zu bestimmen.

3.1.1 Die Rauschquellen

3.1.1.1 Das Photonenrauschen

Es lassen sich unterschiedliche Quellen des Rauschens ausmachen. Der größte Teil wird durch das sogenannte Photonenrauschen erzeugt. Darunter versteht man die statistischen Schwankungen in der Anzahl der Photonen, die pro Zeiteinheit τ von einem Ensemble von Fluoreszenzmolekülen emittiert werden. Diese Schwankungen im Photonenstrom sind von grundsätzlicher Natur, da die Emission von Fluoreszenz- oder Streulichtphotonen ein stochastischer Prozeß ist. Jede beliebige Folge von statistisch unabhängigen Ereignissen weist diese Art von Fluktuationen auf. Dieser Effekt wird auch als „Schroteffekt“ bezeichnet.

Die Statistik, mit der diese Prozesse beschrieben werden, ist die Poisson-Statistik, die allgemein aus wahrscheinlichkeitstheoretischen Betrachtungen folgt. Mißt man demnach z.B. Z -mal das Eintreffen voneinander unabhängiger Ereignisse, so findet man im Mittel z mal die Zählrate n, wobei gilt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Mittelwert der Verteilung ist dabei durch n gegeben. Die Poisson-Verteilung hat die Eigenschaft, daß die mittlere Schwankung oder Standardabweichung σ vom Mittelwert n gegeben ist durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Standardabweichung eines Signals von seinem Mittelwert wird nun als das Rauschen des Signals definiert. Als Signal werden die von einer lichtmikroskopischen Probe emittierten Fluoreszenzphotonen betrachtet.

Der mittlere Photonenstrom Φ sei gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

, der von einer mikroskopischen Probe emittiert wird,

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

die mittlere Anzahl von Photonen, die im Meßzeitintervall τ emittiert

werden. Die Schwankungen, also das Rauschen der Photonenzahl mit der Zeit, ist dann gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Objektiv kann aufgrund der begrenzten numerischen Apertur nicht den gesamten emittierten Photonenstrom sammeln. Zudem treten an verschiedenen Gerätekomponenten Verluste auf, so daß nur ein zu Φ

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

auf den Detektor gelangt. Das Rauschen, das die mittlere Photonenzahl vor dem Detektor aufweist, ist dann gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

, der zum Detektor gelangt, setzt sich dabei aus zwei

Anteilen zusammen. Zum einen erhält man direktes Licht von den fluoreszierenden markierten Strukturen. Zum anderen ist immer ein endlicher Streulichtanteil aus der Probe und von optischen Komponenten vorhanden. Es gilt somit

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die beiden Prozesse werden als statistisch unabhängig betrachtet, so daß sich deren

Schwankungsquadrate addieren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diese zeitlichen Schwankungen in der Anzahl der Photonen bilden aufgrund ihrer grundsätzlichen Natur die untere Grenze für das Rauschen, das prinzipiell nicht unterschritten werden kann.

3.1.1.2 Das Rauschen der Sekundärelektronen

Der auf die Kathode des Photomultipliers treffende Photonenstrom ϕ

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

erzeugt dort

durch das Auslösen von Photoelektronen den Photostromϕ

Pe

. Jedes auftreffende Photon

erzeugt dabei mit der Quanteneffizienz Q e < 1 die Photoelektronen n

Pe

. Die Anzahl der

Photoelektronen, die die Kathode verlassen und auf die erste Dynode des Multipliers

treffen ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dabei ist β der sogenannte Sammelkoeffizient. Er gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein Photoelektron die erste Dynode erreicht. Typische Werte liegen bei β = 0.7 − 0.9. Berücksichtigt man wiederum das direkte Licht und das Streulicht, so erhält man

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Pee Signal Streu

Auch die Photoelektronen lassen sich somit aufteilen in diejenigen, die vom direkten Licht erzeugt werden und diejenigen, die durch das Streulicht entstehen, d.h.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die mittlere Anzahl der Photoelektronen unterliegt aufgrund des Rauschens im auftreffenden Photonenstrom den Schwankungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die erzeugten Photoelektronen werden durch ein elektrisches Feld auf die erste Dynode beschleunigt und lösen dort im Mittel δ Sekundärelektronen heraus. Diese werden dann zur zweiten Dynode beschleunigt, wo sie im Mittel δ Sekundärelektronen auslösen. Dieser Prozeß setzt sich bis zur letzten Dynode fort. Diese bildet gleichzeitig die Anode des Photomultipliers. Hier entsteht durch die auftreffenden Elektronen ein Spannungsstoß Δ U von einigen mV. Dieser Spannungspuls ist das Ausgangssignal des Photomultipliers. Die Emissionsrate δ steigt mit zunehmender Spannung zwischen den Dynoden an und ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei ist A eine Proportionalitätskonstante und α ist von der Form und vom Material

der Dynoden abhängig. U

Dyn

ist die Spannung zwischen den einzelnen Dynoden.

Bei einer Zahl von m Dynoden ist die mittlere Vervielfachungμ der Photoelektronen gegeben durch [Hamamatsu Photonics, 1996]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Größe θ ist eine Konstante und für den jeweiligen Multiplier charakteristisch. Typische Werte sind m = 9 − 12 und α = 0.7 − 0.8 , so daß die Verstärkung mit der 6.−10. Potenz der anliegenden Gesamtspannung steigt. Die mittlere Anzahl n der Sekundärelektronen, die von den auftreffenden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

emittiert werden und auf die Anode treffen ist somit gegeben durch n Se = β Q e (n Sign al + n Stre u)μ Gl. 3.1.14

Das Rauschen der Sekundärelektronen wird ebenfalls mit dem Verstärkungsfaktor multipliziert und läßt sich beschreiben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei wurde die Rauschzahl Ω eingefügt, die berücksichtigt, daß der Multiplikationsfaktorμ ebenfalls Schwankungen unterliegt. Die Ursache dafür ist, daß die Auslösung von Sekundärelektronen ebenfalls ein stochastischer Prozeß ist. Die Rauschzahl Ω ist folgendermaßen definiert [Hamamatsu Photonics, 1996]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Typische Werte sind δ ≈ 3 − 5 , so daß sich für den Rauschfaktor der Wert Ω≈1.3-1.5 ergibt. Der Verstärkungsfaktor fügt also durch seine Schwankungen zum Rauschen der Sekundärelektronen noch einen zusätzlichen Rauschanteil hinzu.

3.1.1.3 Der Dunkelstrom des Photomultipliers

Als Dunkelstrom eines Photomultipliers bezeichnet man die Photoelektronen, die auch ohne direkten Lichteinfall von der Kathode pro Zeiteinheit emittiert werden. Hauptursache sind Elektronen, deren thermische Energie größer als die Bindungsenergie im Kathodenmaterial ist (≈2 eV). Bei sehr hohen Spannungen können auch durch Feldemission Elektronen aus der Kathode austreten. Auch Höhenstrahlung kann zur Erzeugung von Photoelektronen beitragen. Die mittlere Anzahl der ohne Lichteinfall emittierten Sekundärelektronen sei n. Die daraus resultierende Anzahl Dunkel von Sekundärelektronen, die auf die Anode treffen, ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Schwankungen dieser Sekundärelektronen lassen sich beschreiben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Anzahl der Elektronen aus dem Dunkelstrom addiert sich mit der Zahl der Sekundärelektronen, die durch einfallendes Licht emittiert werden zur Gesamtzahl

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Rauschen der gesamten Sekundärelektronen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.1.4 Elektronikrauschen

Die Signale am Ausgang eines Multipliers werden in der Regel durch entsprechende elektronische Bauteile verstärkt. Der Verstärker liefert durch Widerstandsrauschen eine weitere Rauschkomponente, die gegeben ist durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

T ist die absolute Temperatur, k die Boltzmann-Konstante, F der Rauschfaktor des a Verstärkers und R der Widerstand (z.B. 50 Ω), über den der Verstärker mit dem Multiplier verbunden ist.

3.1.2 Das Signal-Rausch-Verhältnis

Die einzelnen Rauschanteile (Gleichungen 3.1.15, 3.1.18 und 3.1.21) können als statistisch unabhängig voneinander aufgefaßt werden und summieren sich folgendermaßen zum Gesamtrauschen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Signal-Rausch-Verhältnis wird dann durch folgenden Quotienten definiert

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Durch Einsetzen der Gleichungen 3.1.14, 3.1.15, 3.1.17 und 3.1.21 erhält man

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Verstärkungsfaktor μ ist in der Regel von der Größenordnung 106, so daß das Rauschen der Elektronik vollkommen vernachlässigbar ist. Dann erhält man

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Übergang von der reinen Teilchenzahl zu den entsprechenden Teilchenströmen liefert den Zusammenhang zwischen dem SRV und dem Meßzeitintervall τ

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die endliche Anzahl von Fluoreszenzmolekülen im Detektionsvolumen und die nicht zu vermeidende Photolyse begrenzen in der Regel die Anzahl der Photonen, die von der

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Probe emittiert werden können. Der Detektorparameter

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ist durch den

verwendeten Photomultiplier vorgegeben. Gleichung 3.1.26 verdeutlicht, daß demnach eine Verbesserung des SRV lediglich über eine Verlängerung der Meßzeit τ oder über eine äquivalente Mittelung M über mehrere Messungen zu erreichen ist. Das bedeutet, daß eine Verdopplung der Meßzeit für eine Intensitätsmessung gleichwertig ist mit einer zweimaligen Messung und anschließender Mittelung über die beiden Intensitätswerte. Allgemein ist der Fehler des Mittelwertes bei mehrmaliger Messung gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

der Fehler der Einzelmessung und M die Anzahl der Messungen. Mit

Gleichung 3.1.26 folgt somit für das Signal-Rausch-Verhältnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das SRV ist demnach unabhängig vom Verstärkungsfaktorμ. Das bedeutet, daß durch eine größere Verstärkungsspannung des Photomultipliers keine Verbesserung des SRV zu erreichen ist.

3.1.3 Das vereinfachte Rauschmodell

Die Vielfalt der Rauschquellen macht deutlich, daß es nicht möglich ist, die einzelnen Rauschkomponenten in einem digitalisierten Bild separat zu messen. Ziel des vereinfachten Modells ist es daher, eine Formel abzuleiten, die es erlaubt, das SRV durch einfache Bildanalyse der Messung zugänglich zu machen.

Der Photomultiplier arbeitet im sogenannten Analogmodus. Dabei werden die Spannungspulse am Ausgang des Multipliers über den Widerstand R in Strompulse umgewandelt. Diese Strompulse werden im Meßzeitintervall τ integriert und mit einem 8-Bit Analog-Digital-Wandler in einen digitalen Intensitätswert umgewandelt, der dann im Bild als Grauwert erscheint. Die totale mittlere Pixelintensität I im Bild ist dabei

Total

proportional zur Höhe des integrierten Strompulses und somit proportional zum

Sekundärelektronenstromϕ

Se ges

. Mit der Proportionalitätskonstanten k gilt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Streulicht und der Dunkelstrom machen sich im Bild durch eine Untergrundintensität I bemerkbar und können daher zu Vereinfachung Untergrund zusammengefaßt werden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

und läßt sich durch einfache Bildanalyse direkt aus dem Bild bestimmen. Das Rauschen wird mit demselben Proportionalitätsfaktor wie die Mittelwerte in einen Intensitätswert im Bild umgewandelt, so daß sich für das Rauschen im Bild ergibt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Mit den einzelnen Rauschanteilen (Gleichungen 3.1.14, 3.1.15 ,3.1.17 und 3.1.21) und den Gleichungen 3.1.30, 3.1.31 und 3.1.32 erhält man

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Streulicht- und Dunkelstromintensitäten werden wieder zusammengefaßt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]