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Enzyme. Versuchsprotokoll aus einem pflanzenphysiologischen Praktikum

von Christoph Böhm (Autor)

Praktikumsbericht / -arbeit 2008 20 Seiten

Biologie - Botanik

Leseprobe

V 3a Biokatalyse am Beispiel der Katalasewirkung

1. Einleitung

Es gibt viele chemische Reaktionen, die nur mithilfe eines Katalysators ablaufen. Der Katalysator setzt die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion herab und beschleunigt somit deren Geschwindigkeit und Gleichgewichtseinstellung, ohne jedoch die Gleichgewichtslage zu verandern. Ein Katalysator geht immer unverandert aus einer Reaktion hervor. In Organismen fungieren die Enzyme als Biokatalysatoren, die mit ihren Substraten Enzym-Substrat-Komplexe bilden, woraus dann ein Komplex aus Enzym und Produkt entsteht, der anschlieBend in Enzym und Produkt zerfallt und dieses somit freisetzt.

In diesem Versuch wird die Wirkung eines Enzyms am Beispiel der Katalase demonstriert, welche das schadliche Wasserstoffperoxid spaltet.

2. Material und Methode

1) Als erstes wurde aus 20 ml 30%iger H2O2-Losung und 80 ml Aqua dest. eine 6%ige H2O2-Losung hergestellt. Dann wurden 10 ml dieser Losung in einen Erlenmeyerkolben gefullt und mit einer Spatelspitze Mangen(IV)-oxid versetzt. Nachdem eine deutliche Gastentwicklung zu erkennen war, wurde die Glimmspanprobe durchgefuhrt.
2) Fur den zweiten Teilversuch wurden 50 g ungeschalte Kartoffeln gewurfelt und in einem Erlenmeyerkolben mit den restlichen 90 ml der H2O2-Losung versetzt.

Nachdem eine deutliche Schaumbildung eingetreten war, wurden einige Tropfen Octanol zugesetzt, um den Schaum aufzulosen. AnschlieBend wurde auch hier die Glimmspanprobe durchgefuhrt.

3. Ergebnisse

Sowohl beim ersten als auch beim zweiten Teilversuch ist die Glimmspanprobe positiv ausgefallen, d.h. bei beiden Reaktionen konnte Sauerstoff nachgewiesen werden.

4. Diskussion

Da bei beiden Reaktionen Sauerstoff entstanden ist, muss das Wasserstoffperoxid zersetzt worden sein. Wasserstoffperoxid ist bei Zimmertemperatur metastabil, d.h. seine Zerfallsgeschwindigkeit ist sehr gering. Deshalb kann es nur durch Erhitzen oder mithilfe eines Katalysators zersetzt werden. Da in unserem Versuch die Temperatur stabil war, muss die Reaktion im ersten Teilversuch durch den Katalysator Mangan(IV)-oxid und im zweiten Teilversuch durch das Enzym Katalase, das in Kartoffeln vorhanden ist, gemaB der Gleichung 2 H2O2 ^ 2 H2O + O2 zersetzt worden sein. Der Versuch zeigt, dass Wasserstoffperoxid sowohl von einem anorganischen Katalysator (Mangan(IV)-oxid) als auch von einem Biokatalysator (Katalase) abgebaut werden kann.

V 3b Phenoloxidasen

1. Einleitung

In diesem Versuch soll die Funktion der Phenoloxidasen unter verschiedenen Gesichtspunkten untersucht werden. Phenoloxidasen sind meistens in den Plastiden lokalisiert, wahrend ihr Substrat in den Vakuolen vorliegt. Wird die Zelle nun so verletzt, dass Vakuolen und Plastiden beschadigt werden, so kommen Phenoloxidase und ihr Substrat zusammen. Die Phenoloxidase oxidiert dabei je nach Typ unterschiedliche Phenole in die entsprechenden, teils farbigen, Chinone. Diese Chinone wirken vermutlich funghi- und bakterizid. Die Dunkelfarbung von verletzten Pflanzenteilen beruht auf einer nicht-enzymatischen Weiterreaktion der Chinone in Melanine.

Phenoloxidasen sind relativ unspezifisch. In ihrem aktiven Zentrum befindet sich 2- wertiges Kupfer und sie sind mit den Hamocyanen verwandt.

In dieser Versuchsreihe sollte die Phenoloxidase der Kartoffelknolle im ersten Versuch gehemmt werden. In den folgenden Versuchen wurden noch Denaturierungserscheinungen durch Hitze und niedrigen pH-Wert untersucht. Als Substrat wurde hierbei DOPA verwendet, die Hemmung geschah mit Natriumdiethyldithiocarbaminat.

2.1 Nachweis und Hemmung derPhenoloxidasen in vitro

1. Material und Methode

Als erstes wurden 25ml einer Losung hergestellt, die 10mol/l DOPA in Phosphatpuffer (pH 7,5) enthielt.

Diese wurde zu je 5ml auf 3 Reagenzglaser aufgeteilt. Danach wurde in Reagenzglas b) 1ml des Enzymhemmer Natriumdiethyldithiocarbaminat-Losung gegeben. Dann wurden in Reagenzglas a) und b) ein Kartoffelextrakt (50g geschalte Kartoffel mit Phospatpuffer gemixt und filtriert) hinzugegeben. Reagenzglas 3 verblieb als Kontrollprobe ohne Zusatz.

2. Ergebnisse

Reagenzglas a). Die Losung verfarbte sich zunachst komplett dunkel. Nachdem sie uber einige Stunden gestanden hatte, entfarbte sie sich weitgehend und eine dunkle Schicht setzte sich an der Oberflache ab. Durch Schutteln konnte diese Schicht wieder aufgelost werden, so dass die Losung wieder dunkel wurde.

Reagenzglas b) Die Losung wurde durch Zugabe des Extraktes leicht milchig, verfarbte sich jedoch nicht wie Reagenzglas a). Die Farbe anderte sich uber die gesamte Versuchsdauer nicht und behielt die gleiche Farbe wie Reagenzglas c).

Reagenzglasc): DOPA Kontrolllosung; Es war keine Verfarbung zu beobachten.

3. Diskussion

Die Verfarbung in Reagenzglas a) deutet die Anwesenheit von Phenoloxidasen an, die das DOPA (ein Diphenol) zunachst in das dazugehorige Chinon umgewandelt hat:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dieses Chinon kann nicht-enzymatisch mit dem Luftsauerstoff zu braunschwarzem Melanin weiterreagieren, was wir in diesem Versuch beobachten. Damit erklart sich auch, warum die dunkle Schicht an der Oberflache auftritt, denn hier ist der meiste Luftsauerstoff verfugbar.

2.2 Verfarbung des Extraktes beim Stehenlassen

1. Material und Methode

In diesem Versuchsteil wurde je ein Teil (5ml) des Kartoffelextraktes aus Versuchsteil 1 in Reagenzglas d) und der andere in ein flaches Schalchen gefullt und uber die Kurszeit hinweg beobachtet.

2. Ergebnisse

Die Losung ist zunachst gelblich und trub, wird aber direkt beim Hantieren innerhalb von Minuten dunkler. Die Losung im Reagenzglas wurde innerhalb einer Stunde sehr dunkel, nach zwei Stunden (vgl. Abb. 1) ist die Losung groBtenteils gelblich trub und an der Oberflache hat sich ahnlich wie in Versuchsteil 2.1 eine dunkle Schicht gebildet.

In dem groBflachigen Schalchen ist die Losung bereits seit dem EingieBen durchgehend dunkel (Abb. 2). Es lasst sich keine Phasenbildung beobachten.

3. Diskussion

Die dunkle Farbe wird durch die im Kartoffelextrakt enthaltenen Phenoloxidasen verursacht, die diverse Phenole in Chinone umsetzen, die wiederum selbststandig zu den farblich dunklen Melaninen weiter reagieren. Durch das Mixen wurden die Zellen und ihre Organellen stark verletzt, so dass aus den Vakuolen die phenolischen Verbindungen austreten konnten, die mit den aus den zerstorten Plastiden austretenden Phenoloxidasen in Wechselwirkung treten. Die Umsatzprodukte sind die schon erwahnten teils farbigen Chinone bzw. die aus ihnen hervorgehenden farblichen Melanine, die wir beobachten. Da fur diese Reaktionen molekularer Sauerstoff notig ist, treten diese Reaktionen hauptsachlich an Stellen auf, die mit molekularem Sauerstoff in Kontakt kommen. Daher verfarbt sich in dem Reagenzglas hauptsachlich die Oberflache dunkel wahrend in der Schale die Flussigkeit mit einer groBeren Oberflache in Kontakt mit dem molekularen Luftsauerstoff tritt. Eine vergleichbare Reaktion lasst sich z.B. bei einem angebissenen, dunkel anlaufenden Apfel beobachten.

2.3 Hitzeempfindlichkeit der Enzyme

1. Material und Methode

Von dem bereits fur die vorigen Versuchsteile hergestellten Kartoffelextrakt wurden etwa 2ml in Reagenzglas e) funf mal aufgekocht. Von diesem aufgekochten Extrakt wurden 0,1ml mit 5ml DOPA Losung gemischt.

2. Ergebnisse

Die Losung wurde komplett dunkelgrau und war weitgehend klar. Allerdings lieB sich keine dunkle Schicht an der Oberflache beobachten, wie sie bei den anderen Versuchsteilen beobachtbar war.

3. Diskussion

Durch das Erhitzen werden Proteine denaturiert, da die Molekule durch die Energiezufuhr derart ins Schwingen geraten, dass sich einige Bindungen wie Wasserstoffbruckenbindungen, Disulfidbindungen und hydrophobe Effekte losen, was zu einer Konformationsanderung fuhrt und somit die Funktion der Enzyme stort. Dabei werden haufig die im Inneren des Proteins gelegenen Abschnitte nach auBen gekehrt. Die Proteine sind nicht mehr loslich und fallen aus. Kovalente Bindungen werden hierbei nicht getrennt und die Primarstruktur bleibt erhalten. Hitzedenaturierungen sind oft reversibel, wobei hier die Einwirkzeit und die Hohe der Temperatur entscheidend und fur die einzelnen Enzyme unterschiedlich sind.

[...]

Details

Seiten
20
Jahr
2008
ISBN (eBook)
9783640617081
ISBN (Buch)
9783640616596
Dateigröße
1.2 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v150433
Institution / Hochschule
Johannes Gutenberg-Universität Mainz – Allgemeine Botanik
Note
1,7
Schlagworte
Enzyme Pflanzenphysiologie

Autor

  • Autor: undefined

    Christoph Böhm (Autor)

    8 Titel veröffentlicht

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