Untersuchungen zur Organisation und Sequenz menschlicher Histongene

Inhaltsübersicht

1. Einleitung

2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien
2.1.2. Reagenziensatze
2.1.3. Enzyme
2.1.4. Nucleotide
2.1.5. Zellen
2.2. Methoden
2.2.1. Analyse einer menschlichen Genbibliothek
2.2.1.1. Aufbau und Herkunft
2.2.1.2. Reagenzien
2.2.1.3. Herstellung von Agarplatten
2.2.1.4. Aussaat von Bakteriophagen
2.2.1.5. Transfer von Phagen-DNA auf Nitrocellulose
2.2.1.6. Hybridisierungssonden
2.2.1.7. Hybridisierung von membrangebundener DNA
2.2.1.8. Autoradiographie
2.2.1.9. Anlegen von Bakteriophagenstammkulturen
2.2.2 Preparation von Bakteriophagen- DNA
2.2.2.1. Reagenzien
2.2.2.2 Preparation aus Plattenlysaten
2.2.2.3. Preparation aus Fliissigkulturen
2.2.2.4. Preparation in kleinem Mapstab
2.2.2.5. Aufreinigung von Phagenlysat mit Lambdasorb Antikorpern (Promega)
2.2.2.6. Aufreinigung von Phagenlysat mit DEAE-Cellulose
2.2.3. Verdauung von DNA mit Restriktionsenzymen
2.2.3.1. Reagenzien
2.2.3.2. Durchfuhrung
2.2.4. Agarose-Gelelektrophorese von DNA
2.2.4.1. Reagenzien
2.2.4.2. Durchfuhrung
2.2.5. Dot-Blot-Analyse von DNA
2.2.5.1. Reagenzien
2.2.5.2. Durchfuhrung
2.2.6. Ubertragung von DNA auf Membranfilter
2.2.6.1. Kapillarblot nach Southern
2.2.6.2. Diffusionsblot nach Reed und Mann
2.2.7. Markierung von DNA
2.2.7.1. Radioaktive Markierungstechniken
2.2.7.2. Nichtradioaktive Markierungen
2.2.8. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen
2.2.8.1. Extraktion aus Low-Melting-Point (LMP)-Agarosegel
2.2.8.2. Isolierung aus TypII-Agarosegel
2.2.9. Subklonierung von DNA-Fragmenten
2.2.9.1. Verwendete Vektoren 3q
2.2.9.2. Dephosphorylierung von Vektoren
2.2.9.3. Vorbereitung der DNA-Fragmente
2.2.9.4. Ligation _
2.2.10. Transformation
2.2.10.1. Herstellung kompetenter Zellen
2.2.10.2. Einschleusen von Plasmiden in Bakterienzellen
2.2.11. Ausstreichen von transformierten Bakterien
2.2.12. Isolierung von Plasmid-DNA
2.2.12.1. Plasmidpraparation zur Analyse ("Mini Screen”)
2.2.12.2. Preparation im mittleren Magstab
2.2.12.3. Preparation im gro|3en Ma^stab
2.2.13. Aufreinigung von DNA
2.2.13.1. Saccharosegradienten
2.2.13.2. CsCl2-Gradienten
2.2.13.3. Reinigung mit "Gene-Clean"
2.2.13.4. Aufreinigung markierter DNA iiber Sephadex G-50
2.2.14. Strangtrennung von DNA-Fragmenten
2.2.15. Sequenzanalyse von DNA
2.2.15.1. Chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert
2.2.15.2. Enzymatische Methode nach Sanger
2.2.15.3. Hochspannungsgelelektrophorese in Polyacrylamidgelen
2.2.15.4. Autoradiographie 4
2.2.16. Isolierung von Gesamt-DNA aus Blut
2.2.17. Southern-Blot-Analyse genomischer DNA
2.2.18. Zellkultur
2.2.19. Preparation von RNA aus Zellen
2.2.20. Ubertragung von RNA auf Membranfilter (Northern-Blot)
2.2.20.1. Glyoxylierung von RNA
2.2.20.2. RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot des Gels
2.2.21. Sj- Kartierung 52

3. Ergebnisse

4. Diskussion und Zusammenfassung

5. Anhang

6. Verzeichnis der Abkurzungen

7. Literaturverzeichnis

Einleitung

Desoxyribonucleinsaure wurde bereits 1869 aus menschlichen Eiterzellen und 1871 aus Spermien vom Rheinlachs isoliert (Miescher), ihre Rolle als Trager der Erbinformation jedoch wurde erst mehr als 70 Jahre spater entdeckt (Avery et al, 1944). Erst die Aufklarung ihrer Struktur einer DNA- Doppelhelix durch Watson und Crick (1953) ermoglichte einen Einblick in ihre Funktionsweise bei der Vererbung.

Mit der Erkenntnis, dap der Sitz der Erbinformation der Zellkern ist, und nach der Beschreibung der Kernsubstanz als Chromatin (Flemming, 1882) stellte sich die Frage, welche Rolle den DNA-gebundenen, basischen Proteinen zukommt. Kossel hatte ihnen bereits 1884, ohne Kenntnis ihrer Funktion, den Namen Histone gegeben.

Dahinter verbargen sich 5 verschiedene basische Kernproteintypen, deren Wechselwirkung mit der DNA durch Rontgenbeugungsexperimente belegt wurde (Wilkins, 1956).

Bei einer Bindung aufgereinigter Histone an DNA entstanden sich wiederholende Strukturelemente von etwa 100 Angstrom Abstand. Da die Doppelhelix allein keine solchen Strukturmerkmale aufwies, schlop man, dap die basischen DNA-bindenden Proteine Einflup auf die Organisation dieser Substanz im Zellkern haben sollten.

1973 konnten dann erstmals Olins und Olins periodische Chromatinstrukturen im Zellkern nachweisen. Gleichzeitig zeigten Hewish und Burgoyne (1973) durch Spaltung mit endogenen Nucleasen die periodische Verteilung spaltbarer DNA-Abschnitte. Eine Kombination von Rontgenstruktur- experimenten und Quervernetzungsdaten fiihrte schlieplich zum Postulat einer Untereinheitsstruktur des Chromatins durch Kornberg (1977).

Aggregationsversuche der Histonuntergruppen mit DNA fiihrten zu der Erkenntnis, dap es sich bei den Untereinheiten des Chromatins urn DNA-gebundene Histonoktamere der Histone H2A, H2B, H3 und H4 handelte, in denen jedes der 4 Histone doppelt vorlag.

Diese Struktur, die als Nucleosom bezeichnet wurde (Oudet et al, 1975) formiert die DNA als Superhelix von etwa 110 Angstrom Durchmesser urn das Histonoktamer, und stellt die erste Ebene der DNA-Kondensation im Zellkern dar.

Weitere Experimente mit Mikrokokken-Nuclease zeigten die besondere Bedeutung der Hl-Histone auf, deren Anteil an der Struktur der "Perlenkette" darin besteht, dap sie sich iiber ein Stuck Verbindungs-DNA (linker-DNA) an das Oktamer anlagern und zwei voile Windungen DNA um diesen Proteinkern versiegeln (Kornberg, 1977; Simpson, 1978; Thoma et al, 1979; Allan et al 1980).

Die drei-Domanenstruktur der Hl-Histone (Hartman et al, 1977; Aviles et al, 1978; Cary et al, 1981) erlaubt neben der DNA-Protein-Wechselwirkung in deren zentraler Domane (Simpson, 1978) zusatzliche Kontakte mit anderen Hl- Proteinen und ermoglicht dadurch die Ausbildung einer weiteren Kondensationsebene, die als 300 Angstrom-Fibrille bezeichnet wurde (Igo-Kemenes et al, 1982; Thoma et al 1979). Sie enthalt zwei verschiedene Strukturelemente der Superhelix. Einmal die Zusammenlagerung 5-6 aufeinander- folgender Nucleosomen zur spiraligen Form des "Solenoids" (Thoma et al, 1979), zum anderen die diskontinuierliche Verkniipfung der Nucleosomen zu globularen Strukturen, auch "Superbead" genannt (Renz et al, 1977; Zentgraf & Franke, 1984). '

Betrachtet man diese komplexe Struktur der DNA-Verpackung, so stellt sich die Frage, wie im Rahmen der Regulation der Genexpression der Zugriff auf das kondensierte genetische Material der Zelle erfolgt. Unterschiedliche funktionelle Stadien der Zelle sollten Variationen im DNA- Kondensationsgrad zulassen.

Die starke Konservierung der Histone im Evolutionsverlauf diente lange Zeit als Argument gegen die Annahme, dap diese eine gewebsspezifische Rolle in der Genregulation bei der Entwicklung der Organismen spielen konnten. Eine nahere Analyse der Histonstrukturen la.pt diese Hypothese jedoch als moglich erscheinen. .

Einen Hinweis in diese Richtung brachte die Erkenntnis, dap Zellen abhangig vom Stadium ihrer Differenzierung, den Kondensationsgrad ihres Chromatins andern. So fand man in den kernhaltigen Erythrozyten verschiedener Amphibien, Fische, Reptilien und Vogel, die transkriptionell vdllig inaktiv sind und somit ein ausgepragtes

Differenzierungsstadium darstellen, eine Variante des Hl- Histons, die als H5 bezeichnet wurde (Appels & Wells,

1972).

Dieser Subtyp war ausschliepiich in diesen Zellen zu finden und war mit einer dichteren Kondensation des Chromatins korreliert.

In terminal differenzierten Saugerzellen wurde 1969 ein funktionell und strukturell zu H5 homologes Hl-Protein beschrieben, welches die Bezeichnung HI0 bekam (Panyim & Chalkley, 1969).

Bisher sind 7 verschiedene Hl-Typen in Saugern bekannt (Lennox & Cohen, 1983), von denen jedoch lediglich das Hi0 sowie der testikulare Subtyp Hit (Cole et al, 1984, 1986) auf bestimmte Zellstadien beschrankt sind.

Untersuchungen iiber die Syntheserate verschiedener Histone in der Zelle zeigten, dap der Zeitpunkt ihrer Biosynthese uberwiegend in die S-Phase des Zellzyklus fallt (Borun et al,1967; Gallwitz & Mueller,1969; Iqbal et al, 1984). Daneben wurden am deutlichsten in Embryos mit hoher Zellteilungsrate Falle beschrieben, in denen Histonprotein- und mRNA-Synthese unabhangig vom Zellzyklus stattfinden (Ubersicht in: Woodland, 1980). Dies fiihrte zur Unterscheidung von S-Phase regulierten, zellzyklusabhangigen, und den auf basalem Niveau synthetisierten Histonen.

Die Feststellung, dap die Zelle, abhangig von ihrer funktionellen Situation (Wachstum und Teilung Oder Differenzierung), die Menge und das Expressionsmuster an Histonproteinen variieren kann, eroffnete die Frage nach der Organisation und Regulation der Histonsynthese.

Die Entwicklung der gentechnischen Methoden ermoglichte die Untersuchung der genetischen Organisation dieser Gruppe von Zellkernproteinen, nachdem bereits zuvor Seeigel-Histongene durch differentielle Zentrifugationsverfahren angereichert worden waren (Kedes & Birnstiel, 1971). Eine Ubersicht iiber die ersten Histongen-Klonierungen und Charakterisierungen beim Seeigel wurde von Kedes (1979) gegeben.

Da die Zellteilungen dieser Organismen im ersten Stadium der Embryogenese besonders schnell ablaufen, fordert dies die Bereitstellung besonders groper Histonmengen in den Kernen der sich teilenden Zellen. Erste Untersuchungen an drei verschiedenen Seeigelarten (Psammechinus miliaris, Strongylocentrotus purpuratus, Lytechinus pictus) fiihrten zu der Erklarung, dap die Zelle diese hohe Syntheserate durch die Transkription multibler Genkopien bewerkstelligt.

So beschrieben verschiedene Autoren (Hentschel & Birnstiel, 1981; Kedes, 1979; Sures et al, 1978) eine einheitliche Organisationsform der Histongene in diesen Organismen. Die in der friihen Embryonalphase ausgepragten Gene liegen in etwa 400-facher Kopie im Genom vor und bilden eine Wiederholungseinheit einer Gengruppe (Tandem-Anordnung) aller 5 Histongene mit gleicher Orientierung der Leserichtung.

Daneben wurden Gene isoliert, die in der spaten Entwicklungsphase des Embryos ausgepragt werden (Maxson et al, 1983, 1987). Sie kodierten fur Varianten, die vom Grundtyp der friihen Phase abwichen und in unregelmapigen Gruppen Oder vereinzelt auf dem Genom angeordnet waren.

Es zeigte sich bei verschiedenen Organismen, dap neben den zuvor beschriebenen Varianten der Hl-Gruppe weitere Subtypen der Core-Histone existieren.

Neben testikularen Sonderformen der Histone H2A, H2B, H3 beim Seeigel (Lieber et al, 1987), der Ratte (Trostle-Weige et al, 1982, 1984; Cole et al, 1986) und des Menschen (Wattanaseree & Svasti, 1983) wurden bei den Spezies Volvox carteri (Muller & Schmitt, 1988), Neurospora crassa (Woudt et al, 1983), Gallus domesticus (Brush et al, 1985) und beim Menschen (Wells & Kedes, 1985) H3-Subtypen isoliert, die sich von alien bis dahin bekannten Histongenen unterschieden. Diese unabhangig vom Zellzyklus regulierten Gene trugen Intronsequenzen und die an ihnen produzierte mRNA war polyadenyliert.

Das war insofern sehr iiberraschend, als bis dahin die Regel gait, dap Histongene keine Introns tragen und ihre mRNA nicht polyadenyliert vorliegt.

Die Erwartung, dap alle Organismen die bei Seeigeln vorgefundenen Organisationsformen tandemartig repetierter Histongene identischer Transkriptionsrichtung aufweisen, wurde bei der Analyse weiterer Organismen widerlegt.

Gencluster anderer Anordnung und Kopienzahl wurden bei der Forelle Salmo gaidnerii (Connor et al, 1984), Drosophila melanogaster (Maxson et al, 1983), Xenopus laevis (Zernik et al, 1980), Seesternen (Cool et al, 1988), Notophthalmus (Stephenson, 1981) beobachtet.

Aus der Gruppe der Amphibien zeigte jedoch bereits der Krallenfrosch Xenopus borealis (Turner & Woodland, 1982) eine vollig andere Organisation seinST HiSt0nCf8n-Gruppeil als sein Artverwandter Xenopus laevis. Es konnten vier unterschiedliche Gengruppen isoliert werden, von denen jedoch nur eine einzige ein vollstandiges Cluster reprasentierte (Old et al, 1982; Turner et al, 1988).

Die Histongene hoherer Eukaryonten (Vogel, Sauger) ixegen in wesentlich geringerer Kopienzahl vor. Beim Haushuhn Gallus domesticus (Engel & Dodgson, 1981; Sugarman et al, 1983; D'Andrea et al, 1985), der Ente Cairina moschata (Doenecke & Tonjes, 1984), der Maus (Sittmann et al, 1981; Yih-Sheng Yang et al, 1987) wurden stark voneinander abweichende Organisationsforraen dieser Histongene beobachtet. Die isolierten Gengruppen reprasentierten nur in einzelnen Fallen vollstandige Cluster der 5 Grundtypen von Histongenen. Diese unterschieden sich jedoch in der Anordnung und Orientierung auf dem Genom grundsatzlich voneinander.

Es wurden bereits verschiedene Untersuchungen an menschlichen Histongenen durchgefiihrt (Clark et al, 1981; Heintz et al, 1981; Sierra et al, 1982; Zhong et al, 1983), die ebenfalls zu dem Ergebnis fiihrten, dap keine Tandem- Wiederholung dieser Gengruppen vorliegt, wobei zunachst keine Hl-Gene in der Nachbarschaft von Core-Histongenen beobachtet wurden.

1984 wurden erstmals Hybridisierungsdaten vorgelegt, die auf einen kompletten Cluster aller 5 Histontypen, einschliepiich HI, schliepen liepen (Carozzi et al, 1984). Obwohl bis dahin bereits verschiedene menschliche Core- Histongen-Seguenzen beschrieben worden waren (Clark et al, 1981; Heintz et al, 1981; Sierra et al, 1982; Zhong et al, 1983), fehlte zunachst noch jegliche Sequenzinformation uber menschliche Hl-Histongene. Auch Carozzi und Mitarbeiter (1984) beschrankten sich auf die Veroffentlichung einer kurzen Teilsequenz.

Die erste vollstandig beschriebene menschliche Hl-Sequenz war diejenige des Subtyps HI0 (Doenecke & Tonjes, 1986). Wenig spater wurde ein weiteres menschliches HI Gen isoliert und als HI.1 beschrieben (Eick et al, 1989).

Es war nun das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Aufbau menschlicher Histongengruppen zu untersuchen und die Sequenzen einzelner Gene und ihrer flankierenden Abschnltte

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Chemikalien

Fa. Serva (Heidelberg):

Acrylamid, APS, Bisacrylamid, Ethidiumbromid, Hydrazin, Spermidin, PEG, Saccharose, SDS, TEMED, Triton-X-100

Fa. Sigma (Munchen):

Agarose Typ II, BSA, DTT, Gelatine

Fa. Biorad (Munchen):

Bromphenolblau, Xylen-Cyanol FF

Fa. Pharmacia (Uppsala,Schweden):

Dextransulfat, Ficoll 400, Sephadex G50

Fa. Difco (Detroit, USA):

Agar, Bacto-Trypton, Hefe-Extrakt

Fa. BRL (Karlsruhe):

Harnstoff, LMP-Agarose, Phenol

Fa. Fluka (Buchs,Schweiz):

Piperidin, Formamid, Dimethylsulfat, DMSO

Fa. Boehringer (Mannheim):

E. coli t-RNA, Kalbsthymus-DNA, X-Gal

Fa. Bayer (Wuppertal):

Ampicillin (Binotal)

Alle iibrigen Chemikalien wurden in p.a. Qualitat von Merck (Darmstadt) bezogen

2.1.2. Reagenziensatze ("Kits")

Fa. Boehringer (Mannheim):pUC Sequencing Kit;

DNA Labelling and Detection Kit, nichtradioactiv

Fa. Renner, Dannstadt: DNA Sequencing Kit (Sequenase,

USB)

Fa. Amersham Buchler: Multiprime DNA Labelling System;

(Braunschweig) ECL Gene Detection System

Fa. Genofit (Heidelberg): Lambdasorb, Phage Adsorbent

Antibody

2.1.3. Enzyme

2.1.3.1. Restriktionsendonucleasen von Amersham Buchler, Boehringer (Mannheim), BRL, New England Biolabs: AccI, Alul, Asp718, Apal, Aval, Avail, BamHI, Bglll, BSSHII, EcoRI, Eco47III, Haell, Hindlll, Hindi, Kpnl, MspI, Mval, Nael, Ncol, PstI, PvuII, SacI, Sail, Sau3A, Smal, TaqI (E.C.3.1.23.-)

2.1.3.2. DNA-modifizierende Enzyme:

Alkalische Phosphatase (E.C.3.1.3.1.;aus Kalberdarm);

DNA Polymerase I (Kornberg-Enzym; E.C.2.7.7.7; aus E. coli);

DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, E.C.2.7.7.7) von New England Biolabs

T4 DNA Ligase (E.C.6.5.1.1) von Boehringer (Mannheim)

T4 Polynukleotidkinase (E.C.2.7.1.78) von BRL (Karlsruhe)

SI Nuclease (E.C.3.1.30.1) von Biolabs (Schwalbach)

Sequenase (E.C.2.7.7.7; aus Bakteriophagen T7) von USB (Renner, Dannstadt)

2.1.3.3. Sonstige Enzyme:

Lysozym (E.C. 3.2.1.17; aus Hiihnnereiwei{3) von Sigma

Proteinase K (E.C.3.4.21.14; aus Tritirachium album) von Merck

RNAse A (E.C.3.1.27.5; aus Rinderpankreas) von Boehringer (Mannheim) 2.1.4. Nucleotide

2.1.4.1. Radioaktive Nucleotide (von Amersham-Buchler):

5'-a32P-dNTP (wassrige Losungen, spez. Aktivitat 3000 Ci/mmol)

5'-a35S-dCTP (wassrige Losung, spez. Aktivitat 650 Ci/mmol) 51~V 32P-dATP (wassrige Lsg., spez.Aktivitat 3000 Ci/mmol)

2.1.4.2. Nichtradioaktive Nucleotide:

Desoxynucleosidtriphosphate von Boehringer (Mannheim) 2.1.5. Zellen

2.1.5.1. Bakterien Escherichia Coli-Stamme:

Q358, C600, HB101, DH5a, JM83, MC1061

2.1.5.2. Zell-Linie: U-937 Lymphomzellen

2.2. Methoden

2.2.1. Untersuchung einer menschlichen Genbibliothek

2.2.1.1. Aufbau und Herkunft

Die Genbibliothek wurde freundlicherweise von Prof.D. Gallwitz (Gottingen) zur Verfvigung gestellt. Als Vektor waren EMBL3-Bakteriophagen (Frischauf et al, 1983) benutzt worden, die aus dem Phagen Lambdal059 (Karn et al, 1980) abgeleitet sind und eine multiple Klonierstelle zwischen den Bakteriophagenarmen und der nichtessentiellen Zentralregion besitzen.DNA-Fragmente in der Grd{3e von ca. 18-23 Kb waren durch partielle Verdauung von DNA aus menschlicher Plazenta mit Sau3A gewonnen und in die BamHI- Stelle des Vektors eingebaut worden. Die Genbibliothek sollte sich aus etwa 150.000 verschiedenen Klonen zusammensetzen und somit das komplette menschliche Genom reprasentieren.

2.2.1.2. Reagenzien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.1.3. Aussaat der Bakteriophagen

Geht man von einer Grope des haploiden menschlichen Genoms von 2.8 x 109 Bp aus, und nimmt man an, dap jeder Bakteriophage 20 Kb fremde DNA tragt, so ergibt sich hieraus, dap bei 15.000-20.000 pfu/Platte mindestens 10 Platten (15-20 x 105 unterschiedliche rekombinante Bakteriophagen) uberpriift werden miissen, um einen bestimmten Abschnitt der genomischen menschlichen DNA zu finden. Hierzu wurde folgendermapen vorgegangen: Escherichia-Coli Q358 wurden 4-5 Stunden bei 37° in LB- Medium bis zu einer Dichte entsprechend OD650 0,5-0,7 vermehrt, die Zellen abzentrifugiert und vorsichtig in 10 mM Tris (pH 7.5) resuspendiert und auf OD650 2.0 (1.5 x 109 Zellen/ml) eingestellt. Diese Bakterienstammlosung konnte bei Kuhlraumtemperatur mehrere Tage zur Infektion durch eine Bakteriophagensuspension benutzt werden. Der Titer der Phagen in dem Beimpfungsgemisch wurde zunachst uberpriift.

Das Gemisch von gleichen Volumina (100-200 pi) Phagen und Bakterien in Puffer wurde 20 Minuten bei 37°C geschiittelt und anschliepend zusammen mit dem auf 45-50°C vortemperierten Deckagar auf eine vorbereitete, mit Boden- Agar gefullte Petrischale verteilt. Fur die erste Beimpfung wurde der Phagentiter so gewahlt, dap iiber Nacht eine konfluente Lysis des Bakterienrasens eintrat. Zur Eingrenzung bestimmter Klone wurde in den weiteren Aussaaten der Phagentiter so verringert, dap einzelne Plaques auf den Agarplatten auszumachen waren.

2.2.1.4. Ubertragung der Phagen-DNA auf Nitrocellulose (Benton & Davis, 1977)

Die Phagenplatten wurden zur weiteren Analyse mit Membranrundfiltern aus Nitrocellulose (Schleicher u. Schiill) blasenfrei bedeckt. Nach 1 Stunde Lagerung bei 5°C wurden die Filter mit der daran gebundenen DNA fur jeweils 2 Minuten in Denaturierungs-, Neutralisierungs- und 2 x SSPE-Losung getrankt und anschliepend die nun einzelstrangig vorliegende DNA bei 80°C, 2 Stunden an den Filter fixiert. Die so vorbereiteten Filter konnten trocken, in Folie eingeschweipt, fiir mehrere Monate aufbewahrt werden.

2.2.1.5. DNA-Sonden zur Hybridisierung

Das Genbankscreening nach menschlichen Histongenen erfolgte im ersten Schritt mit heterologen Proben aus dem Entengenom (Tonjes et al, 1989; Abb.l) oder entsprechenden Sonden aus dem Genom des Seeigels Strongylocentrotus purpuratus (Overton & Weinberg, 1978; Abb.l).

Das Plasmid pC02, welches ein komplettes Histongencluster des Seeigels enthielt, wurde von Herrn Prof. Dr. D. Gallwitz zur Verfiigung gestellt. Die Markierung der DNA erfolgte mit Hilfe der "Nicktranslation" (siehe unter 2.2.7.1. ) durch den Einbau radioaktiver Nukleotide.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.Histongenclustern der Ente und des Seeigels. Die FragmentgrofSen und Enzymangaben beschreiben die jeweils benutzten Sonden (Zusammengestellt aus: Tonjes & Doenecke, 1987; Tonjes et al, 1989 sowie Overton & Weinberg, 1978) .

2.2.1.6. Hybridisierung der membrangebundenen DNA Die Vorinkubation der Filter erfolgte in

Prahybridisierungslosung bei 65°C fur mindestens 2 Stunden. Hierdurch sollten unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abgedeckt werden. Anschliepend wurden die Filter kurz luftgetrocknet und zur Hybridisierung mit denaturierter, xnarkierter DNA-Sonde, welche dem Prahybridisierungsmedium zugesetzt wurde, iiber Nacht bei 65° inkubiert. Bedeutsam fiir das Ergebnis der Hybridisierung sind hierbei die Ionenkonzentration, das Volumen der Losung (l-2ml/Filter), die Homologie und Grope der Sonde, die Spezifitat der Markierung (1 pCi/200 ng DNA), sowie die Menge der filtergebundenen Phagen-DNA (Szostak et al, 1979; Bonner et al, 1973).

2.2.1.7. Waschen der Filter

Urn ungebundene, bzw. unspezifisch anhaftende DNA von den Filtern zu entfernen, ist es notig, diese in mehreren Schritten zu waschen. Nach Hybridisierung mit weitgehend homologer Probe haben sich folgende Bedingungen als ausreichend erwiesen:

Waschlosung: 2 x SSC/0.1 % SDS,

Waschtemperatur: zunachst 3 x Raumtemperatur, abschliepend 2 x bei Hybridisierungstemperatur. Nach Lufttrocknung erfolgte die Autoradiographie.

2.2.1.8. Autoradiographie Reagenzien:

Entwicklerlosung: Kodak D-19 Oder Du Pont, Cronex TD, oder

Tetenal

Fixiererlosung: Kodak AL4 oder 25 % Na2S203 (w/v) x

5H2 0, 5 % .

K2S205 (w/v),

oder Tetenal

Rontgenfilm: Kodak X-Omat OR

Rontgenfilmkassetten: AMPLI mit und ohne Bleieinlage (Philips)

Fluoreszenzfarbstoff: Phospho Relief, Typ 7 (J.M. Paillard/Paris)

Durchfiihrung:

Die Nitrocellulosefilter mit der daran gebundenen und hybridisierten DNA wurden auf Filterpapier (Schleicher u. Schiill) aufgeklebt, mit radioaktiven oder fluoreszierenden Markern versehen und mit Klarsichtfolie abgedeckt. Die Exposition mit einem Rontgenfilm wurde in Kassetten mit Verstarkerfolien bei -80°C vorgenommen und erstreckte sich je nach Grad der radioaktiven Markierung iiber 1-6 Tage.

2.2.1.9. Anlegen von Bakteriophagenstammsuspensionen

Nach Zuordnung von radioaktiven Signalen zu einzelnen Plaques auf den Bakteriophagenplatten, wurden diese mit Hilfe einer Pasteurpipette aus dem Agar ausgestochen und in 1 ml Phagenpuffer suspendiert. Die Zugabe von 1 Tropfen Chloroform diente dem Abtoten der nicht lysierten Bakterien. Die Verdiinnungen wurden bei 5°C gelagert und dienten als Stammlosungen fur weitere Praparationen.

2.2.2. Preparation von Bakteriophagen

2.2.2.1. Reagenzien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.2.2. Plattenlysatmethode

Zur Preparation von etwa 50 pg Phagen-DNA wurden 5 gro(3e Petrischalen (15 cm Durchmesser) mit konfluent lysiertem Bakterienrasen benotigt. Diese wurden mit je 5 ml Phagenpuffer iiberschichtet, 1 Stunde bei Raumtemperatur und 2-4 Stunden im Kuhlraum auf einer Schuttelplattform geschwenkt. Die Deck-Agarose wurde zusammen mit dem Puffer in ein Becherglas gekratzt, darin 5 min mit Chloroform (5 pl/ml Lysat) geruhrt und anschliefJend 5 min bei 10.000 UpM zentrifugiert. Der Uberstand wurde mit DNase und RNase (je 10 pg/ml) 1 Stunde bei 37°C verdaut. Enzyme und Phagenproteine wurden durch Phenol- und Chloroformextraktion entfernt und die DNA aus der wassrigen Phase in 0.3 M NaAc und 70% Ethanol (Endkonzentration) gefallt. Eine weitere Reinigung der Phagen-DNA erfolgte liber 10-40 %ige Saccharosegradienten (2.2.13.1.) Oder bei kleineren Mengen fiber LMP-Gelelektrophorese (2.2.8.2.J.

2.2.2.3. Preparation aus Fliissigkulturen (Lehrach & Frischauf, 1982)

Aus Phagen- (2.2.1.9.) und Bakterienstammlosungen (Q358 in 10 mM Tris, pH 7.5) wurde ein frisches Plattenlysat hergestellt. Hiervon wurden am folgenden Tag 1-3 Plagues ausgestochen und in 500 pi frisch aufgewachsene Q358 in L- Broth-Medium, 10 mM MgS04 (OD650=0.5) 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anstelle der Bakterien in Medium konnten auch 50-100 pi frische Bakterienstammsuspension (2.2.1.3.) verwendet werden. Das Bakterien-Phagen-Gemisch wurde anschliepend in 50 ml L-Broth-Medium 4-6 Stunden bei 37°C geschiittelt.

Bei ausreichendem Phagentiter sollte sich die zunachst triibe Bakteriensuspension nach dieser Zeit aufklaren. Faden von aggregierten Zellmembranen im Medium zeugten von der Bakterienlysis durch die Phagen. Nach 5 Minuten Zentrifugation bei 7000 UpM wurde zum Uberstand NaCl auf 2 % und PEG 6000 auf 8 % zugefiigt und die Phagen bei 5°C iiber Nacht gefallt. Die mit PEG gefallten Bakteriophagen wurden dann 20 Minuten bei 7000 UpM abzentrifugiert und das Sediment in 400 pi Phagenpuffer aufgenommen. Die Zerstorung der Bakteriophagenkopfe erfolgte nach Zugabe von 10 pi 10% SDS, 50pl 2 M Tris-HCl pH 8 und 0.2 mM EDTA, sowie 1 pi DEPC bei 5 miniitigem Erhitzen auf 70°C. Anschliepend wurden 50 pi 5 M KAc zugefiigt, der Ansatz 30 Minuten auf Eis gestellt und danach 15 Minuten bei 10000 UpM zentrifugiert. Aus dem Uberstand wurde die Phagen-DNA durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol bei -20°C prazipitiert, abzentrifugiert, nach Waschen mit 70 %igem Ethanol getrocknet und in kleinem Volumen TE-Puffer aufgenommen. Die so gewonnene DNA enthielt noch grope Mengen bakterieller RNA und war mit Restriktionsenzymen schlecht verdaulich. Eine Aufarbeitung eines Teils des Phagenlysates mit DEAE-Cellulose (2.2.2.5.) ergab saubere DNA.

2.2.2.4. Preparation in kleinem Ma(3stab (Grossberger, 1987)

Ein frisch ausgestochener Phagenplaque wurde 2 Stunden in 300 pi Phagenpuffer, 10 mM CaCl2 gelost. Hierzu wurden 200 pi aus einer frischen Bakterienkultur in LB-Medium zugegeben, der Ansatz von 500 pi anschliepend 10 Minuten bei 37°C inkubiert, in 10 ml LB-Medium, 10 mM MgS04 iiberimpft, und 4-6 Stunden bei 37 °C geschiittelt. Die Bakterien wurden dann durch 10 miniitiges Zentrifugieren bei 4000 UpM sedimentiert und der Uberstand im Ausschwingrotor SW41 (Beckman) bei 28.000 UpM 40 Minuten bei 0°C zentrifugiert. Das Sediment wurde daraufhin in 200 pi Phagenpuffer gelost und mit 20 pi Proteinase K (10 mg/ml) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Nach je einer Phenol- und Chloroformextraktion wurde die DNA durch Zugabe von 100 pi 7.5 M NH4Ac und 2 Volumina Ethanol 10 Minuten bei -80°C gefallt, anschliepend abzentrifugiert, gewaschen und in kleinem Volumen TE-Puffer aufgenommen.

2.2.2.5. Preparation mit Lambdasorb Immunokit (Promega)

10 ml Bakteriophagenlysat wurde mit 100 pi Lambdasorb Antikorper-Losung gemischt und vorsichtig geschiittelt. Bei 60 miniitiger Inkubation auf Eis konnten sich dann die Antikorper an die Oberflachenstrukturen der intakten Bakteriophagen binden, um anschliepend als Komplex 10 min bei 7000 RpM abzentrifugiert zu werden. Das Sediment wurde einmal mit Phagenpuffer gewaschen, die Bakteriophagen anschliepend abzentrifugiert und in TE-Puffer (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA) resuspendiert. Nach 5 miniitigem Erhitzen der Bakteriophagenlosung auf 70°C, zur Zerstorung der Phagenkopfe, konnten nach 2 min Zentrifugation bei 10.000 RpM der wassrige Uberstand mit der Bakteriophagen- DNA in ein neues Reaktionsgefap iiberfiihrt werden. Nach 2 Phenol/Chloroform (1/1)-Extraktionen wurde die DNA in 0.3 M NaAc, 70 % Ethanol gefallt und abzentrifugiert. Die Ausbeute betrug etwa 10 pg DNA.

2.2.2.6. Aufreinigung von Bakteriophagen- DNA mit DEAE- Cellulose (Zagursky et al, 1985)

Zur schnellen Preparation kleiner Mengen DNA aus Fliissigkulturen Oder Uberstanden von Plattenlysaten (2.2.2.2.) hat sich diese Methode als praktisch erwiesen. Hierbei wurden 5-10 ml Lysat nach 5 minutigem Riihren mit 200 pi Chloroform 10 min bei 4°C und 7000 RpM zentrfugiert. Der Uberstand wurde mit Hilfe einer Spritze durch Filter mit 0.2 pm Porengrdpe sterilf iltriert. Die Bakteriophagen konnten die Filtermembran passieren. Zur Entfernung bakterieller DNA und RNA wurde das Filtrat mit DEAE- Cellulose vorsichtig geschiittelt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur hatten sich die bakteriellen Nukleinsauren an die Aminogruppen der Cellulose gebunden und wurden 5 min bei 7000 RpM abzentrifugiert. Der die Bakteriophagen enthaltende Uberstand wurde anschliepend zweimal mit gleichem Volumen Phenol extrahiert, wobei sich die DNA in der wassrigen Phase loste. Die organische Phase wurde durch Zentrifugation abgetrennt und der wassrige Uberstand zur Entfernung des verbliebenen Phenols dreimal ausgeathert. Die DNA wurde in 0.3 M NaAc und 70 % Ethanol gefallt und nach Zentrifugation, Waschen mit 70 % Ethanol und anschliependem Trocknen im Vakuumtrockner in TE-Puffer (10 mM Tris ph7-5, 1 mM EDTA) resuspendiert.

2.2.3. Verdauung von DNA mit Restriktionsendonucleasen

Das Prinzip der Restriktion wurde urspriinglich bei der Infektion von E. Coli Bakterien mit Lambda-Bakteriophagen beobachtet (Arber und Linn, 1969). Der gleiche Phage wuchs in verschiedenen Wirten unterschiedlich schnell, was sich auf zwei Mechanismen zuruckfiihren liep. Zu& einen schiitzte sich der Wirt durch Methylierung seiner eigenen DNA, zum zweiten durch Spaltung der Fremd-DNA mit Enzymen - den Restriktionsendonukleasen. Als Werkzeuge der Gentechnologie wurden sie aus verschiedensten Bakterienstammen isoliert und zeigten die Fahigkeit, DNA an spezifischen Basensequenzen zu schneiden. Als Enzymaktivitat von 1 Unit wird meist die Enzymmenge definiert, die 1 pg DNA/Stunde bei 37°C schneidet. Abweichend davon spalten Restriktionsenzyme thermophiler Microorganismen (Taq I) die DNA optimal bei 65-78°C (Malcom, 1981).

Reagenzien:Verdauungspuffer, (lOx) y0-yl50: 10 mM Tris pH 7.5, 6 mM MgCl2 , 6 mM ME, 0- 1500 mM NaCl, 200 pg/ml BSA (Die Bezeichnungen y0-yl50 beschreiben die molaren NaCl- Konzentration im Ansatz)Auftragspuffer: 70 % (w/v) Saccharose, 0.1 M EDTA, 0.01 % (w/v) Bromphenolblau

Durchfuhrung:DNA wurde in Eppendorf-Reaktionsgefapen fur 2-12 Stunden bei der fur das Enzym optimalen Temperatur verdaut. Das Volumen des Ansatzes richtete sich meist nach dem Taschenvolumen der Agarosegele und betrug pro Tasche 25 pi (17 pi Probe, 2 pi lOx y-Puffer, 1 pi Enzym=l-5 U/pg DNA, 5 pi Auftragspuffer) Die Menge an Enzymlosung war hierbei so zu bemessen, dap bei 50 % Glyceringehalt die Endkonzentration an Glycerin 5 % nicht iiberstieg. Bei Verdauung mit mehr als einem Enzym wurden y-Puffer verwendet, in denen beide Enzyme gut schneiden konnten. Bei unterschiedlichen Optimalbedingungen der Enzyme wurde zunachst der Puffer mit niedrigerer NaCl-Konzentration eingesetzt und nach Verdauung mit dem ersten Enzym die NaCl-Molaritat in grdperem Volumen des Ansatzes erhoht. Anschliepend erfolgte die Verdauung mit den weiteren Restriktionsenzymen. Eine Alternative war es, die DNA vor weiteren Verdauungen zu fallen und im geeigneten Puffer wieder aufzunehmen.

2.2.4. Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Reagenzien:

Tris-Borat-EDTA-Puffer (lOx TBE): 0.9 M Tris pH 8.3, 0.9 M Borsaure, 25 mM EDTA

Tris-Acetat-EDTA-Puffer (lOx TAE): 0.5 M Tris pH 7.8, 0.2 M Na-Acetat, 20 mM EDTA

Ethidiumbromid-Losung: 1 mg/ml in H20, TBE- bzw. TAE-Puffer (lx)

Agaroselosung: 0.5-1.5 % (w/v) Agarose II bzw. LMP-Agarose in lx Puffer

Durchf iihrung:

Das Gel wurde nach 5 minutigem Aufkochen von Agarose-Pulver in Elektrophoresepuffer im Mikrowellenherd mit 50 pi Ethidiumbromidlosung (1 mg/ml) gemischt und in eine Plastikschale (8.5 x 12.5 x 0.5 cm) gegossen. Die Taschen zum Auftrag der Proben wurden mit Hilfe eines Plastikkammes, der in die Schale eingesetzt wurde, ausgespart und nach Erkalten des Gels mit H20 gefiillt. Bei 80-120 Volt wanderte die negativ geladene DNA zur Anode.

Die Wanderungsgeschwindigkeit eines linearisierten DNA- Molekiils ist hierbei umgekehrt proportional dem dekadischen Logarithmus seines Molekulargewichtes (Helling et al,

1974). Als Marker dienten DNA-Fragmente bekannter Groj3en, wie z.B. Lambda-DNA mit Hindlll, Oder pBR322-DNA mit Alul verdaut (Daniels & Blattner, 1982; Sutcliffe, 1978; Parker et al, 1977). Die Sichtbarmachung der DNA erfolgte, nach Einlagerung von Ethidiumbromid zwischen die gepaarten Basen des DNA-Doppelstranges (Interkalieren), auf dem UV-Schirm bei 366 nm (Rodriguez & Tait, 1983). Die fluoreszeierenden DNA-Banden konnten mit einer Polaroidkamera photographiert werden.

2.2.5. "Dot-Blot"-Analyse von DNA

Reagenzien:

Denaturierungslosung Neutralisierungslosung 2 x SSPE

Praehybridisierungsmedium (Zusammensetzung, siehe 2.2.2.)

Durchfuhrung:

1—3]j1 DNA in H2 0 (lpg/jil) wurden auf einen :Nitrocellulosestreifen pipettiert und luftgetrocknet. Die Filter wurden jeweils 1 min in Denaturierungs-, Neutralisierungs- und 2 x SSPE-Losung getrankt und die denaturierte DNA 2 Stunden bei 80'C eingebacken. Nach 2- stiindigem Praehybridisieren konnte die filtergebundene DNA mit den gewiinschten markierten DNA-Sonden liber Nacht hybridisiert werden. Das Waschen der Filter erfolgte mit 2 x SSC/ 0.1 % SDS Waschlosung (siehe 2.2.I.2.). Nach Trocknung und Exponieren der Filter mit einem Rontgenfilm, wurden positive Signale in Form eines schwarzen Flecken ("Dot") sichtbar. Eine spezifischere Analyse der DNA ist mit der Southern-Blot-Methode moglich.

2.2.6. Ubertragung von DNA auf Membranfilter

2.2.6.1. Kapillarblot nach Southern (1975)

Ein Agarosegel wurde je 20 min in Denaturierungs-, Neutralisierungs-, und 20 x SSC-Losung gebadet (Losungen siehe 2.2.I.2.). Zur Ubertragung der DNA vom Agarosegel auf Membranfilter (Nitrocellulose oder Nylon-Membran) wurde ein kapillarer Pufferstrom als treibende Kraft der Ubertragung benutzt (Southern, 1975; siehe Abb.2), wobei auf der Membran eine identische Kopie des elektrophoretischen Trennmusters entstand. Die fixierten Bandenmuster ("Blots") konnten fur mehrere aufeinanderfolgende Analysen mit verschiedenen Sonden benutzt oder fur mehrere Monate gelagert werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.2: Aufbau eines Southern-Blots (aus: Pfister et al, 1987). Saug- und Filterpapier erzeugen einen Pufferstrom tiber eine Filterpapierbriicke aus dem Puffer-Reservoir durch das Gel und die Transfer- Matrix (Nitrocellulose Oder Nylon).

2.2.6.2. Diffusionsblot nach Reed & Mann (1985)

Eine weitere Methode bestand darin, das Gel und die immobilisierende Membran in noch engeren Kontakt miteinander zu bringen und auf ein Puffer-Reservoir zu verzichten. Hierzu wurde von einer oder beiden Seiten auf das vorbehandelte, denaturierte Gel eine zunachst in H20 und dann in 2 x SSC getrankte Nitocellulosemembran aufgelegt und nach Abdeckung mit etwa 20 Lagen Filterpapier (Schleicher & Schiill) der Aufbau unter Druck fur 8-10 Stunden gelagert. Nach 2 stiindiger Fixierung der filtergebundenen DNA bei 80°C standen somit 2 identische Filter zur weiteren Analyse zur Verfiigung.

2.2.7. Markierung von DNA

2.2.7.1. Radioaktive Markierungstechniken (Abb.:3)

2.2.7.1.1. "Nicktranslation" (Rigby et al, 1977)

Reagenzien:

Reaktionspuffer (lOx): 0.5 M Tris-HCl pH 7.5, 50 mM MgCl2, 100 mM 2-Mercaptoethanol, dATP dGTP dCTP dTTP je 0.6 mM (das jeweils markierte Nukleotid wurde weggelassen)

cx-32P-dNTP: spez. Aktivitat 3000 Ci/mM

DNA-Polymerase I (Kornberg): Das Praparat der Fa.

Boehringer ist mit geringer Menge DNasel versetzt

EDTA-Losung: 0.1 M pH 8 Durchfiihrung:

100-200 ng DNA wurden nach Zugabe von 2 pi Reaktionspuffer (10 x), 4 pi a-32P-dNTP, 2 pi Kornberg-Polymerase mit H20 auf 20 pi aufgefiillt und bei 14 °C fiir 4 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 pi 10 % SDS und 12 pi 0.1 M EDTA-Losung gestoppt. Die Reinigung von freien Nukleotiden erfolgte entweder mit der "Gene Clean"-Methode (2.2.13.3.) Oder nach Zugabe von 25 pi Hefe RNA (4 mg/ml) durch Gelfiltration iiber eine mit Sephadex G-50 gepackte Saule. Die anschliepend bei 95°C denaturierte Sonde konnte bis zu dreimal zur Hybridisierung verwendet werden.

2.2.7.1.2. "Random Priming" von DNA (Abb.3)

Hierzu wurde das "Multiprime DNA-Markierungssystem" der Fa. Amersham/Buchler verwendet. 25 pg hitzedenaturierter DNA wurden in Reaktionspuffer (siehe: Nicktranslation) nach Zugabe von 5 pi Primer, 4 pi a-(32P)-dNTP, 2pl Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I und h20 auf 50 pi bei Raumtemperatur £iir 4 Stunden oder liber Nacht inkubiert .

Nach Reaktionsstop durch Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 20 mM wurde die markierte DNA von freien Nukleotiden gereinigt (2.2.7.1.1.)* Die DNA-Sonde konnte bei -20°C aufbewahrt werden oder nach Denaturierung einmalig benutzt werden.

2.2.7.1.3 . Markierung von DNA am 5 ' -iiberhangenden Ende (Abb.3)

Reagenzien:

Kinasierpuffer (lOx): 0.5 M Tris-HCl pH 7.6, 0.1 M MgCl2,

50 mM Dithiothreitol, 1 mM Spermidin, 1 mM EDTA

Y~(3 2P)-dATP: 3000 mCi/mmol Durchfiihrung:

Diese Methode wird neben der Markierung von Oligonukleotiden fur die Markierung von DNA zur chemischen Spaltung (Maxam Gilbert Sequenzierung) oder zur Sl- Kartierung von Genen (2.2.21.) benotigt. Das Enzym T4- Polynukleotidkinase ubertragt hierbei den gamma-standigen Phosphatrest von ATP auf die 5'OH-Gruppe eines DNA- Fragments (Richardson, 1971). Voraussetzung ist die vorherige Dephosphorylierung der DNA-Enden (siehe2.2.9.2. ). Die Kinasierung von 1-5 pg DNA erfolgte, nach Zugabe von 5 pi Kinasierpuffer (10 x), 6 pi y-(32P)-dATP, 2 pi T4-Kinase und H20 auf 50 pi, fur 30 min bei 37°C. Sie wurde durch Fallung der DNA mit 200 pi 2.5 M NH4Ac und 750 pi Ethanol (100 %) gestoppt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.3: Schematische Darstellung verschiedener DNA-

Markierungsmethoden. . . ,

(Aus: Kits for molecular biology, Boehr., Mannheim)

2.2.7.2. Nichtradioaktive Markierungen

2.2.7.2.1. Einbau Digoxigenin-markierter Nukleotide in DNA mit dem "DNA Labeling and Detection Kit" der Fa. Boehringer (Mannheim)

200-400ng linearisierte hitzedenaturierte DNA wurde nach der Methode des "Random Priming"(2.2.7.1.2.) durch den Einbau von mit Digoxygenin-gekoppelten Desoxyuridin- Triphosphaten markiert. Nach Fallung der DNA in 400 mM LiCl und 7o % Ethanol wurde die abzentrifugierte, getrocknete DNA in TE-Puffer gelost, bei 95°C denaturiert und direkt zur Hybridisierung eingesetzt. Es wurden pro 100 cm2 Filterflache 20 ml der Hybridisierungslosung verwendet. Das Waschen der Filter erfolgte entsprechend den Bedingungen bei der Verwendung radioaktiver Sonden. Die Hybridisierung an die Ziel-DNA wurde durch Verwendung eines Antikorper- Konjugats (Anti-Digoxygenin-alkalische Phosphatase) und einer nachfolgenden enzymgekoppelten Farbreaktion nachgewiesen.

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