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Untersuchung des membrangebundenen, PQQ-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase-Komplexes bei Gluconobacter oxydans

Diplomarbeit 2005 81 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Leseprobe

Inhalt

Abkürzungen

1 Einleitung
1.1 Allgemeine Aspekte zur Überexpression von Metaboliten
1.2 Essigsäurebakterien, Gluconobacter oxydans
1.3 Alkohol Dehydrogenase mit PQQ als Coenzym
1.4 Das Ethanol oxidierende System in Gluconobacter oxydans ATCC 621H
1.5 Aufgabestellung

2 Material und Methoden
2.1 Verwendete Mikroorganismen und Vektoren
2.1.1 Verwendete Mikroorganismen
2.1.2 Verwendete Vektoren
2.2 Kultivierung der Stämme
2.3 Lagerung der Stämme
2.4 Allgemeine genetische Arbeiten
2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Gluconobacter oxydans
2.4.2 Minipräparation der Plasmid-DNA
2.4.3 Konzentration Bestimmung der DNA
2.4.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
2.4.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA
2.5 Klonierungsmethoden
2.5.1 Restriktinsanalyse
2.5.2 Restriktion des PCR-Produkts, und des Plasmides pBBR1MCS5
2.5.3 Dephosphorylierung mit Alkalischer Phosphatase
2.5.4 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem PCR-Purifikationskit
2.5.5 Ligation
2.6 Transformation
2.6.1 Herstellung Elektokompetenter Zellen von E. coli DH5α
2.6.2 Herstellung Elektokompetenter Zellen von Gluconobacter oxydans
2.6.3 Elektroporation
2.7 Identifizierung von Klonen mit rekombinanter DNA
2.8 Enzymexpression
2.8.1 Induktion bei E. coli
2.8.2 Enzymexpression bei Gluconobacter oxydans
2.9 Zellaufschluss mittels frensch Press
2.10 Bestimmung der spezifischen ADH-Aktivität
2.10.1 Enzymtest
2.10.2 Proteinkonzentrationsbestimmung
2.10.3 Berechnung der spezifischen ADH-Aktivität

3 Ergebnisse
3.1 Amplifizierung der Gene, ADH(A) und ADH(A)+Cyt c(B)
3.2 Restriktion und Ligation
3.3 Transformation von E. coli und Gluconobacter oxydans
3.4 Untersuchung der ADH-Aktivität der E. coli DH5α Transformanten
3.5 Untersuchung der ADH-Aktivität bei Gluconobacter oxydans
3.5.1 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Glucose (0,5%)
3.5.2 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Ethanol (0,5%)
3.5.3 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Glucose (0,3%)
3.5.4 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Glucose (0,5%) + Ethanol (0,5%)
3.5.5 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH auf verschiedenen C-Quellen
3.5.6 Einfluss des Einfrierens auf Gluconobacter oxydans PTB9018
3.5.7 Einfluss der Pufferzusammensetzung auf die spezifische Aktivität der ADH
3.5.8 Wirkung des Cofaktors auf die spezifische Aktivität der ADH
3.6 Bestimmung der Km-Werte der ADH in Rohextrakten des Wildtyps und der Transformanten (PTB9016, PTB9018) für verschiedene Alkohole

4 Diskussion
4.1 Expression der ADH in E. coli
4.2 Expression der ADH in Gluconobacter oxydans
4.3 Einfluss des Einfrierens bei -80 °C auf die Transformanten PTB9018
4.4 Einfluss der Pufferzusammensetzung und des Cofaktors auf die spezifische Aktivität der ADH
4.5 Vergleich der Affinität der ADH zu verschiedenen Substraten

5 Ausblick

6 Zusammenfassung

Literatur

Danksagung

Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Allgemeine Aspekte zur Überexpression von Metaboliten

In der Vergangenheit bediente man sich zum Zwecke der Alkohol-, Essigsäure-, Milchsäure- oder anderer Fermentationen der jeweils besten Mischkulturen, die in der Natur zu finden waren, und kultivierte diese Mikroorganismen unter den vermeintlich besten Bedingungen. Im Laufe der Zeit stieg jedoch der Bedarf an den unterschiedlichsten Produkten. Zahlreiche, durch Misserfolge, oder Fehler gemachte Erfahrungen machten es notwendig, das Forschen nach geeigneten und spezifischen produzierenden Mikroorganismen in immer größeren Umfeldern und Maßstäben zu betreiben.

Ein neues Kapitel für das Arbeiten mit Mikroorganismen eröffnete sich im letzten Jahrhundert. Mit den Möglichkeiten der Gentechnik wurden enorme Fortschritte auf den Gebieten der Biochemie, Mikrobiologie, Enzymologie und Enzymregulation gemacht. Ferner wurden die physiologischen Eigenschaften der verschiedenartigsten Mikroorganismen aufgeklärt. All diese neuen Aspekte und Einblicke trugen maßgeblich zu unseren heutigen Erkenntnissen zur Produktion mikrobieller Metabolite bei.

Ein wesentliches Ziel der modernen Biotechnologie ist, die Produktivität von Mikroorganismen, bezüglich primärer (z.B. Essigsäure, Ethanol, Glycerin) und auch sekundärer (z.B. Enzyme, Hormone, Antikörper, Proteine) Stoffwechselprodukte, zu steigern. Dabei bedient man sich je nach gewünschtem Produkt physiologischer (Kulturverfahren) und genetischer (Mutagenesetechniken) Mittel.

Die meisten erfolgreichen, industriellen Prozesse zur Überproduktion diverser Verbindungen basieren darauf, dass Wildtyp-Stämme von Natur aus die gewünschten Stoffe bilden und unter bestimmten Bedingungen in die Lage versetzt werden können, diese zu überproduzieren.

Ein wirkungsvolles Instrument zur weiteren Erhöhung von natürlich gebildeten primären oder sekundären Metaboliten liefert die Gentechnologie, unter Ausnutzung der Erkenntnisse aus Enzymologie und Enzymregulation. Um mittels Gentechnologie Stoffwechsselflüsse in bestimmte Richtungen umzulenken, sind Veränderungen an entsprechenden Schlüsselenzymen erforderlich. In der Vergangenheit wurden bereits Gene manipuliert, z.B. durch gezielte Punktmutationen [1] und/oder die Gene wurden in Multicopy-Plasmiden bzw. Transposons vervielfältigt [2]. Diese Techniken wurden variiert und kombiniert um zu untersuchen, welche Auswirkungen diese Veränderungen auf den Stoffwechsel zeigen würden. Es wurde dabei u.a. gefunden, dass die Erhöhung einzelner Enzymaktivitäten kaum zu einer Erhöhung des Gesamtfluxes führt, wenn die Umsatzrate eines vorhergehenden bzw. nachfolgenden Reaktionsschrittes begrenzend ist [3].

1.2 Essigsäurebakterien,Gluconobacter oxydans

Die Essigsäurebakterien bilden eine Gruppe von gramnegativen, aeoroben, beweglichen Stäbchen, die unvollständige Oxidationen durchführen, was bei Alkoholen zur Akkumulation von organischen Säuren als Endprodukten führt. Mit Ethanol als Substrat wird Essigsäure produziert, daher die Bezeichnung dieser Bakterien. Eine weitere Eigenschaft der Essigsäurebakterien ist die relative hohe Toleranz gegenüber Säure, da die meisten Stämme in der Lage sind, bei pH- Werten unter 5 zu wachsen (optimaler pH für G.oxydans 5,5 bis 6,0). Die Säuretoleranz ist natürlich entscheidend für einen Mikroorganismus, der große Mengen an Säure produziert. Die Essigsäurebakterien bilden eine heterogene Gruppe, die sowohl peritriche als auch polar begeißelte Mikroorganismen einschließt.

Die polar begeißelten Mikroorganismen sind in der Gattung Gluconobacter zusammengefasst, während die peritrichen Arten zu der Gattung Acetobacter gehören. Alle Essigsäurebakterien gehören phylogenetisch zu den Proteobacteria.

Zusätzlich zur Begeißelung unterscheidet sich Acetobacter von Gluconobacter darin, dass die von ihm gebildete Essigsäure weiter zu CO2 oxidiert wird. Dieser Unterschied geht auf das Vorhandensein eines vollständigen Citratzyklus zurück. Da Gluconobacter ein vollständiger Citratzyklus fehlt, ist er unfähig, Essigsäure zu oxidieren [4].

In der Natur kommt Gluconobacter in stark zuckerhaltigen Medien wie Blütennektar, Früchten und auch in Cidre, Wein vor, G.oxydans ist somit für die Biotechnologie sehr Interessant. Besondere Bedeutung haben hierbei Dehydrogenasen, die in der Lage sind nichtphosphorylierte Alkohole [5] und Aldehyde [6] zu oxidieren. Bei der Umsetzung von Ethanol zu Essigsäure, bei der Oxidation von D-Sorbit zu L-Sorbose für die industrielle Ascorbinsäuresynthese [7] und bei der Herstellung des Bräunungsmittels Dihydroxyaceton [8] aus Glycerin wird dieser Organismus eingesetzt [9].

Die meisten aeroben Mikroorganismen oxidieren die organischen Nährstoffe im Atmungsstoffwechsel zu Kohlendioxid und Wasser. Da der Kohlenstoff im Kohlendioxid in seiner höchsten Oxidationstufe vorliegt, spricht man von " vollständiger Oxidation " und grenzt diese Art der Atmung von der " unvollständigen Oxidation" ab, bei der die Substrate nur teilweise oxidiert werden und organische Verbindungen als Stoffwechselprodukte ausgeschieden werden.

Die Bezeichnung " vollständige Oxidation " bedeutet nur, dass keine organischen Verbindungen ausgeschieden werden; sie bedeutet nicht, dass das gesamte aufgenomme Substrat endoxidiert wird. In jedem Fall wird ein beträchtlicher Teil der Substrate ( 40-70% ) assimiliert, das heißt zum Zellmaterial umgewandelt.

Zu den Endprodukten der "unvollständigen Oxidationen" zählen Essigsäure, Gluconsäure, Ketosäuren, Fumarsäure, Citronensäure, Milchsäure usw. Durch die unvollständige Oxidation wird der Wasserstoff von einem Substrat abgespalten und auch die Verwendung Gluconobacter zur Katalyse gewisser Stoffumwandlung zählen, die für den Organismus ohne Wert sind [10].

Der Sauerstoffbedarf während des Wachstums ist groß, und das Hauptproblem der Essigsäureherstellung ist eine ausreichende Belüftung des Mediums [11] [12].

Ein zusätzlicher Vorteil der Essigsäuren besteht in ihrer Fähigkeit, verschiedene Oxidationsreaktionen industriell interessanter Alkohole regio- und stereoselektiv durchzuführen (z.B. Vitamin C) [13].

1.3 Alkohol Dehydrogenase mit PQQ als Coenzym

Pyrrolochinolinchinon ( PQQ ), das essentielle Coenzym zahlreicher bakterieller Oxidoreduktasen, ist als prosthetische Gruppe weit verbreitet, insbesondere bei Alkohol- und Aldol-Dehydrogenasen, wie z.B. die Alkohol-Dehydrogenase und die Glucose-Dehydrogenase in Gluconobacter. Neben PQQ, das nicht kovalent am Enzym gebunden ist, sind inzwischen weitere verwandte Chinone identifiziert worden, die alle aus Aminosäuren der Peptid-Kette abgeleitet sind [14]. Dazu gehören Tryptophantryptophylchinon (TTQ) [15], Topachinon (TPQ) [16], und Lysintyrosylchinon (LTQ) [17]. Enzyme mit PQQ als Coenzym werden als Quinoproteine, bzw. wenn sie Cyt c enthalten als Quinohemoenzyme bezeichnet [18].

Bei der Substratoxidation durch eine Quinoproteindehydrogenase, z.B.:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

hat das Coenzyme PQQ die Funktion die Elektronen vom Substrat zu übernehmen. Dabei geht die oxidierte Form PQQ in die reduzierte Form PQQH2 über.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.1-1 Pyrrolochinolinchinon, (Methoxatin); Abk.: PQQ [19]

Die PQQ-abhängigen Alkohol Dehydrogenasen oxidieren Alkohole und die bei der Oxidation entstehenden Reduktionsäquivalente werden auf die Elektronentransportkette übertragen [20].

1.4 Das Ethanol-oxidierende System in Gluconobacter oxydans ATCC 621H

Gluconobacter oxydans ATCC 621H wächst aerob auf Glucose oder/und Ethanol. Ethanol wird durch eine lösliche heterotrimere, periplasmatische Quinohemoprotein-Ethanol-Dehydrogenase (ADH), die PQQ als Cofaktor enthält, zu Acetaldehyd oxidiert. Die ADH überträgt die Elektronen über ein lösliches periplasmatisches Cytochrom c auf ein Ubiquinon Q10. Ubiquinol Q10H2 wird weiter durch Cytochrom o Oxidase oxidiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.1-2 Elektronentransport bei der PQQ- abhängigen membrangebundenen Alkohol Dehydrogenase von Gluconobacter oxydans [38].

Die genetische Organisation der am Alkohol-oxidierenden System beteiligten Gene:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.1-3 Gen-Anordnung der Alkohol Dehydrogenase von Gluconobacter Oxydans.

Das Gen A mit 2,7 kb codiert für die größte Untereinheit: die Dehydrogenase (83 kDa). Das Gen B mit 1,7 kDa kodiert für die zweite Untereinheit: Cytochrom c (52,1 kDa). Die beiden Gene A+B bilden ein Operon und werden von einem Promotor gesteuert. Das Gen S ist ca. 352 kb von Gen B, entfernt. Dieses Gen (S 0,7 kb) kodiert für die kleinste Untereinheit (14kDa), die in dieser Arbeit nicht untersucht wurde.

1.5 Aufgabestellung

Das Forschungsprojekt, in welches sich die vorliegende Arbeit eingliedert, beschäftigt sich mit der Untersuchung der PQQ-abhängigen Dehydrogenasen von G. oxydans. Dazu sollen die Gene A (ADH) und B (Cyt c) kloniert und zuerst in E. coli und danach in Gluconobacter oxydans ATCC 621H überexprimiert werden. Die Überproduktion der ADH, sowohl der Untereinheit A als auch der beiden Untereinheiten A+B zusammen mit Hilfe eines Multicopy-Vektors (pBBR1MCS5), soll zu einer starken Erhöhung der Alkohol-Dehydrogenase Aktivität führen. Die Enzymaktivität der transformierten Stämmen soll mit der Enzymaktivität des Wildtyps verglichen werden.

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Mikroorganismen und Vektoren

2.1.1 Verwendete Mikroorganismen

Für die Klonierungsarbeiten wurden die Stämme E. coli DH5a und der Wildtyp Gluconobacter oxydans ATCC 621H verwendet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten21 22

Tab 2-1 Stämme mit relevanten genotypischen Merkmalen

2.1.2 Verwendete Vektoren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten 23 24

Tab 2-2 Vektoren mit relevanten Merkmalen

pUC18: ist 2,7 kb Klonierungsvektor mit Ampicillinresistanresistenz, der nur in E. coli repliziert werden kann.

pEC86: 11,75 kb ist verantwortlich für die Expression von Cytochrom c bei E. coli und besitzt die Resistenzgene Chloramphenicol und Tetracyclin.

pBBR1MCS5: ist 4768 bp Klonierungsvektor mit Gentamycinresitenz enthält 16 Klonierungssite mit Lac Za Gene und ist in vivo und in vitro relativ stabil, er ist mobilisierbar, und er ist kompatibl mit anderen Plasmidgrupen [25].

pTB9006: Ampr, 2,7 kb PCR-Produkt des Gens ADH(A) kloniert zwischen

EcoR I- und Sal I-Schnittstellen in der Richtung von Lac Z Promotor von pUC18. [Es wurde von Fr. Viola Khodaverdi Afaghi durchgeführt] pTB9016: ist 7,375 kb Gmr; 2,663 kb PCR Produkt des Gens ADH(A) kloniert zwischen Xba I- Sal I Schnittstellen von pBBR1MCS5.

pTB9018: ist 8,912 kb,Gmr; 4,2 kb PCR Produkt der Gene ADH(A)+ Cytc(B) kloniert zwischen Xba I- Sal I-Schnittstellen von pBBR1MCS5. Nach der Transformation, werden die Transformanten (allerdings mit großem P so wie die entsprechenden Plasmide) benannt.

2.2 Kultivierung der Stämme

Gluconobacter oxydans ATCC 621H und E. coli DH5 a wurden in Nährmedien kultiviert, die bei 121 °C 20 min im Autoklaven sterilisiert wurden . Gluconobacter wurde bei 30 °C als Vorkultur auf Mannitol Medium und als Hauptkultur Natrium Gluconat (Base-Medium) mit verschiedenen Kohlenstoffquellen kultiviert. Natrium Gluconat Medium mit Glucose 0,5 % bzw. Glucose 0,3 % wurde nur 6 min 121 °C autoklaviert, Ethanol wird 0.5%ig (v/v) hinzugefügt.

E. coli wurde in Luria Bertani (LB)-Medium kultiviert und in Minimal Medium M9 mit Ethanol (0,1%) als einzige C-Quelle induziert.

Antibiotika wurden in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-3 Verwendete Antibiotika und ihre Wirkmechanismus [26]

Zusammensetzung des LB-Mediums pro Liter: 10 g/l Trypton

5 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

pH = 7 einstellen; autoklavieren.

Die Zusammensetzung der Stammlösungen des Minimalmediums (M9- Medium) sind Tab 2-4 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-4 Stammlösungen des Minimalmediums (M9-Medium)

MM-Salzlösungen wurden getrennt autoklaviert, die Thiamindichlorid- Lösung wurde extra sterilfiltriert.

Zusammensetzung des Mannitol-Mediums pro Liter: 10 g/l Mannitol

5 g/l Hefeextrakt 3g/l Trypton

pH = 6 einstellen, autoklavieren.

Zusammensetzung des Natrium Gluconat-Mediums pro Liter: 20 g/l Natrium Gluconat

3 g/l Glycerol

3 g/l Hefeextrakt

2 g/l Peptone

pH = 6 einstellen, autoklavieren, dieses Medium wurde Medium M genannt.

Medium M + 0,5 % Glucose = Medium A

Medium M + 0,5 % Ethanol = Medium B

Medium M + 0,3 % Glucose = Medium C

Medium M + 0,5 % Glucose + 0,5 % Ethanol = Medium D

2.3 Lagerung der Stämme

G. oxydans wurde in Mannitol-Medium, E. coli wird in LB-Medium mit 50% (v/v) Glycerol gelagert. Hierfür wurde 800 µl Kultur mit 800 µl Mannitol (für G. oxydans), oder 800 µl LB-Medium (für E. coli) in einem 2 ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Stämme bei -80 °C gelagert.

Um die Zellen von G. oxydans kurzfristig frisch aufzubewahren, wurde ein Teil der positiven transformierten Kolonien auf Mannitol-Agar ausplattiert (für ca. 2-3 Wochen).

2.4 Allgemeine Genetische Arbeiten

2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Gluconobacteroxydans

Die Isolierung genomischer DNA erfolgte mit dem Kit „DNeasy Tissue Kit (50)” der Firma Qiagen.

G. oxydans wurde in 30 ml Mannitol Medium als Vorkultur (30 °C) gezüchtet, nach 24 h wurden die Zellen bei 5500xg zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 20 ml Natrium Glucomat Medium + Glucose 0,5 % resuspendiert und bei 30 °C unter Schütteln bis zur OD620nm = 0,3-0,4 kultiviert.

Die Zellen wurden 5 min bei 10000 x g zentrifugiert, das Pellet wurde in 5 ml autoklaviertem Wasser aufgenommen und auf 1,5 ml aufgeteilt (jeweils 500 µl Suspension). Die Zellen wurden 2 min bei 10000 x g zentrifugiert, und in 180 µl ATL-Puffer aufgenommen, zu dieser Suspension wurde 20 µl Proteinase K zugegeben und bei 55 °C inkubiert (gelegentlich leicht vortexen).Diese Lösung wurde mit 200 µl AL-Puffer vermischt und bei 70 °C 10 min inkubiert. Nach der Zugabe von 200 µl 100 %ige Ethanol Lösung, wurde der gesamte Mix auf die beladene „Spin” Säule aufgetragen, welche in einem Sammelgefäß positioniert worden war, und bei 8000xg 1 min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säule mit 500 µl AW1-Puffer versetzt. Es folgte eine weitere Zentrifugation bei 6000 g für 1 Minute. Der Durchfluss wurde wiederum verworfen, die Säule mit 500 µl AW2-Puffer gefüllt und noch mal bei 6000g abzentrifugiert. Anschließend wurde die DNA in einem neuen 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß mit 100 µl Wasser eluiert.

ATL-Puffer („ tissue Lysis Buffer”) enthält Proteinkinase A AL, AW1, AW2 sind nicht näher bezeichnet.

2.4.2 Minipräparation der Plasmid-DNA

Plasmid-DNA wurde mit dem Kit "Qiaprep Spin" isoliert. Für die Plasmid- Minipräparation wurden Einzelkolonien, die das gewünschten Plasmid enthielten, über Nacht auf Schüttler in 4 ml Mannitol oder LB (G.oxydans oder E. coli) mit den entsprechenden Antibiotika kultiviert. Aus der Übernacht-Kulturen wurden Plasmide wie folgt isoliert:

4 ml Übernacht-Kulturen wurden 1 min bei 14000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 µl P1 mit RNase resuspendiert und mit 250 µl Puffer P2 versetzt (4-6 Mal invertieren), und bei Raumtemperatur 5 min inkubiert. Um lokale Präzipitation zu vermeiden, wurde sofort nach der Zugabe von 350 µl Puffer N3 vorsichtig gemischt. Die Lösung wurde bei diesem Schritt trüb. Nach der anschließenden Zentrifugation wurde die Qiaprep Spin Säule auf ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und 10 min bei 13000xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und erneut für 30- 60 s zentrifugiert, um weiteren Überstand zu entfernen. Die Säule wurde zum Waschen mit 0,5 ml Puffer PB beladen und 30-60 s bei 13000 x g zentrifugiert. 0,75 ml Puffer PE wurden ebenfalls zum Waschen der Säule aufgetragen und 60 s abzentrifugiert. Die Zentrifugate wurden verworfen. Um sicher zu gehen, dass kein Waschpuffer verblieben war, wurde abschließend 1 min zentrifugiert. Zur DNA-Elution wurde die Säule auf ein frisches Eppendorf-Gefäß überführt und mit 50 µl H20 beladen, 1 min stehen gelassen und für 1 min zentrifugiert. Im Zentrifugat befand sich die DNA.

2.4.3 Konzentrationsbestimmung der DNA

Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde durch photometrische Messung der Nukleinsäure bei 260 nm wie beschrieben ermittelt [27].

Bei geringen DNA-Mengen und kleinen Volumina wurde die DNA- Konzentration nach der Gelelektrophorese durch visuellen Vergleich mit dem DNA-Standard, der ebenfalls auf das Gel aufgetragen wurde und die Intensität der Banden nach der Ethidiumbromidfärbung verglichen [27].

2.4.4 Polymerase-Kettenreaktion ( PCR )

Die PCR wurde zur exponentiellen Vervielfältigung der gewünschten DNA Abschnitte, und zum Einfügen neuer Restriktinonstellen für die Ligation, durchgeführt.

Für die Klonierungsarbeiten wurde die PCR zur Amplifizierung der folgenden DNA-Abschnitte durchgeführt.

- 2,663 kb großes Fragment, das Gen A enthält.
- 4,2 kb großes Fragment, das die beiden Gene A+B enthält
- 0,2 kb großes Fragment, das die MCS-region des Plasmides pBBR1MCS5 enthält.

Die Primer wurden ca. 200 bp vor ATG entfernt ausgewählt, um sicher zu gehen, dass der eigene Promotor des Gens A und des Gens A+B amplifiziert wurde. Anschließend wurden die Restriktionsstellen für die Ligation eingefügt.

Die für diese Untersuchung verwendeten Primerpaare sind mit den entsprechenden Hybridisierungstemperaturen in Tab 2.5 dargestellt, die mittels des Programms bestimmt werden [28].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-5 Primerpaare und ihre Hybridisierungtemperaturen

Restriktionserkennungssequenzen

Xba I 5’-T¯CTAG­A-3’

Sal I 5’-G¯TCGA­C-3’

BstX I 5’-CCAN­NNNN¯NTGG-3’

Zur Amplifizierung des Gens A wurde ein Thermocylerprogramm entwickelt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-6 PCR-Thermocyclerprogramm zur Amplifizierung des Gens A

Für die Amplifzierung der Gene A+B wurde das vorliegende Programm modifiziert, hierbei betrug die Hybridisierungstemperatur 64°C und Polymerisationszeit 5 min.

Zur Durchführung der PCR wurden die Template-DNA bzw. frische Kolonien, die beiden Oligonucleotid-Primer, ein Gemisch aller Desoxynucleotid, die Pfu-bzw. Taq-Polymerase, 10x Reaktionspuffer in 25 µl Endvolumen verwendet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-7 Zusammensetzung des PCR-Anzatzes

Um unspezifische Hybridisierungen bei Ansetzen der Reaktion und während der Initialen Aufheizphase des Thermocyclers zu vermeiden, wurde die Hot-Start-PCR angewendet. Dabei wurde die Pfu-Polymerase während des Denaturierungsschritts zur Reaktionsmischung pipettiert.

2.4.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA

Die Agarosegel-Elektrophoresen wurden wie bei Sambrook et al beschrieben durchgeführt [27]. In der vorliegenden Analyse wurden alle Gelelektrophorese auf 1 %igen Agarosegelen in 0,5 fachen TAE-Puffer durchgeführt. Es wurden 2 bis 10 µl DNA-Lösung mit 2 µl 6x Ladepuffer vermischt und auf Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 1 bis 1,5 h bei Raumtemperatur und 100 V durchgeführt.

Als Standard wurden 5 µl 1-kb-DNA-Lader (Gene ruler, MBI Fermentas) verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 10 bis 20 min in Ethidiumbromid Lösung (0,5 µg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Anregung mit UV Licht (254 nm) wurde der Ethidiumbromid-DNA- Komplex im Sichtbaren Bereich (500-590 nm) als rot-orange leuchtende Bande sichtbar.

Zusammensetzung der 50 x TAE-Puffer pro L

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2.5 Klonierungsmethoden

2.5.1 Restriktionsanalyse

Die Restriktionsanalysen wurden nach Angaben des Herstellers (MBI Fermentas) durchgeführt. Zur Klonierung in die gewünschten Vektoren wurden die PCR-Produkte über Nacht bei 37 °C verdaut. Die Restriktion der Vektoren wurde 3 bis 4 h bei 37 °C verdaut durchgeführt. Zur Auffindung der Restriktionsstellen innerhalb der zu klonierenden DNA- Fragmente wurde das Programm Nebcutter V 2.0 “ (Biolabs Inc., New ” England) verwendet [29]. Die Restriktionsreaktionen wurden in einem Volumen von 25 µl wie Tab. 2.8 dargestellt, durchgeführt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 2-8 Zusammensetzung des Restriktionsansatzes

Bei Doppelverdau mit Xba I/ Sal I, wurden jeweils 1,5 µl der beiden Enzyme und ein entsprechender Reaktionspuffer, in dem beiden Enzyme aktiv sind, verwendet.

[...]


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Details

Seiten
81
Jahr
2005
Dateigröße
1.4 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v110462
Note
2,0
Schlagworte
Untersuchung PQQ-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase-Komplexes Gluconobacter Studiengang Biotechnologie

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Titel: Untersuchung des membrangebundenen, PQQ-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase-Komplexes bei Gluconobacter  oxydans